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Bioengineering

एपलिसिया सिंगल न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और मॉलिक्यूलर एनालिसिस के लिए गैंगलिया तैयारी

Published: January 13, 2014 doi: 10.3791/51075
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, Florida

Summary

समुद्री घोंघा Aplysia californica व्यापक रूप से व्यवहार के सेलुलर और आणविक आधार पर अध्ययन के लिए एक न्यूरोबायोलॉजी मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है । यहां पहचाने गए तंत्रिका सर्किटरी के एकल न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और आणविक विश्लेषण के लिए एपलिसिया के तंत्रिका तंत्र की खोज के लिए एक पद्धति का वर्णन किया गया है।

Abstract

न्यूरोबायोलॉजी में एक बड़ी चुनौती तंत्रिका सर्किटरी के आणविक आधार को समझना है जो एक विशिष्ट व्यवहार को नियंत्रित करते हैं। एक बार विशिष्ट आणविक तंत्र की पहचान कर रहे हैं, नई चिकित्सीय रणनीतियों अपक्षयी रोगों या तंत्रिका तंत्र की उंर बढ़ने की वजह से विशिष्ट व्यवहार में असामान्यताओं के इलाज के लिए विकसित किया जा सकता है । समुद्री घोंघा एपलिसिया कैलिफॉर्निका व्यवहार के सेलुलर और आणविक आधार की जांच के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि एक विशिष्ट व्यवहार में अंतर्निहित तंत्रिका सर्किटरी आसानी से निर्धारित की जा सकती है और सर्किटरी के व्यक्तिगत घटकों को आसानी से हेरफेर किया जा सकता है। एपलिसिया के इन फायदों ने सीखने और स्मृति के न्यूरोबायोलॉजी की कई मौलिक खोजों का नेतृत्व किया है। यहां हम व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और आणविक विश्लेषण के लिए एपलिसिया तंत्रिका तंत्र की तैयारी का वर्णन करते हैं। संक्षेप में, तंत्रिका तंत्र से विच्छेदित गैंगलियन को गैंगलियन म्यान को हटाने के लिए प्रोटीज के संपर्क में आता है ताकि न्यूरॉन्स उजागर हों लेकिन अक्षुण्ण जानवर के रूप में न्यूरोनल गतिविधि को बनाए रखें। इस तैयारी का उपयोग एकल या कई न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप को पूरा करने के लिए किया जाता है। महत्वपूर्ण बात, एक सरल पद्धति का उपयोग कर रिकॉर्डिंग के बाद, न्यूरॉन्स जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए सीधे गैंगलिया से अलग किया जा सकता है । इन प्रोटोकॉल का उपयोग एल 7 और आर 15 न्यूरॉन्स से एक साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग करने के लिए किया गया था, अलग-थलग एकल एल 7, एल11, आर15 और एपलिसियाके आर 2 न्यूरॉन्स में एसिटिलकोलिन और सीआरईबी1 जीन की मात्रात्मक अभिव्यक्ति के लिए उनकी प्रतिक्रिया का अध्ययन किया गया था।

Introduction

मानव मस्तिष्क लगभग 100 बिलियन न्यूरॉन्स और खरबों सिनैप्टिक कनेक्शन के साथ असाधारण रूप से जटिल है। लगभग समान संख्या में गैर-मूत्र कोशिकाएं हैं जो न्यूरॉन्स के साथ बातचीत करती हैं और मस्तिष्क में उनके कार्य को विनियमित करती हैं। न्यूरॉन्स सर्किट में आयोजित कर रहे हैं कि विशिष्ट व्यवहार को विनियमित. मस्तिष्क कार्यों और तंत्रिका सर्किट की हमारी समझ में प्रगति के बावजूद, थोड़ा सर्किट घटकों की पहचान के बारे में जाना जाता है जो एक विशिष्ट व्यवहार को नियंत्रित करते हैं। एक सर्किटरी के विभिन्न घटकों की पहचान का ज्ञान न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों के लिए उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने में व्यवहार और सहायता दोनों के सेलुलर और आणविक आधार की हमारी समझ को बहुत सुविधाजनक बना देगा।

समुद्री घोंघा एपलिसिया कैलिफॉर्निका 1-14विशिष्ट व्यवहार अंतर्निहित न्यूरोनल सर्किट का निर्धारण करने के लिए एक वर्कहॉर्स रहा है। एप्लिसिया तंत्रिका तंत्र में लगभग 20,000 न्यूरॉन्स होते हैं जो 9 अलग-अलग गैंगलिया में आयोजित किए जाते हैं। एप्लिसिया के न्यूरॉन्स बड़े होते हैं और गंगलिया में उनके आकार, विद्युत गुणों और स्थिति के आधार पर आसानी से पहचाने जा सकते हैं। एपलिसिया में व्यवहार का एक समृद्ध प्रदर्शनों की सूची है जिसका अध्ययन किया जा सकता है। अच्छी तरह से अध्ययन व्यवहार में से एक गिल वापसी पलटा (GWR) है । इस पलटा के केंद्रीय घटक पेट गंगलिया में स्थित हैं। जीडब्ल्यूआर सर्किटरी के घटकों को मैप किया गया है और विभिन्न घटकों के योगदान निर्धारित किए गए हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि जीडब्ल्यूआर सर्किटरी साहचर्य और गैर-साहचर्य सीखने5,6,15-19से गुजरती है। इस पलटा पर दशकों के अध्ययन ने कई सिग्नलिंग रास्तों की भी पहचान की है जिनकी सीखने और स्मृति20-24में महत्वपूर्ण भूमिका है ।

स्मृति भंडारण के सेलुलर और आणविक आधार का अध्ययन करने के लिए एपलिसिया की कई अलग-अलग तैयारी का उपयोग किया गया था। इनमें अक्षुण्ण पशु2,3,अर्ध-अक्षुण्ण तैयारी1,7,13,14,16 और तंत्रिका सर्किटरी25-29के प्रमुख घटकों का पुनर्गठन शामिल है। पहचाने गए न्यूरोनल सर्किट के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और आणविक विश्लेषणों के लिए एपलिसिया गैंगलिया की खोज के लिए कम तैयारी का वर्णन यहां किया गया है । निम्नलिखित चार पहचाने गए न्यूरॉन्स का अध्ययन किया गया। R15, एक फटन न्यूरॉन, L7 और L11, दो अलग मोटर न्यूरॉन्स और R2, एक कोलिनेर्गिक न्यूरॉन का अध्ययन किया गया । R2 अकशेरुकी तंत्रिका तंत्र में वर्णित सबसे बड़ा न्यूरॉन है। संक्षेप में, इस पद्धति में गंगलिया का प्रोटीज उपचार, औषधीय उपचार से पहले और बाद में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप, और जीन अभिव्यक्ति के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एकल न्यूरॉन्स का अलगाव शामिल है। यह पद्धति हमें कई न्यूरॉन्स से एक साथ रिकॉर्डिंग के साथ आणविक विश्लेषण गठबंधन करने के लिए सक्षम बनाता है । इस पद्धति का सफलतापूर्वक युग्मित इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग द्वारा एसीटिलकोलिन (एसीएच) के लिए R15 और L7 न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया था। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापन R15 और L7 और अन्य पहचाने गए न्यूरॉन्स जैसे L11 और R2 को क्वांटिटेटिव पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) के विश्लेषण के लिए अलग किया गया था, जो मेमोरी स्टोरेज के लिए महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर है।

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Protocol

1. पेट गंगलिया की तैयारी, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापन, और एप्लिसिया कैलिफोर्निका के उदर गैंगलियन से एकल पहचाने गए न्यूरॉन्स का अलगाव

  1. 12:12 प्रकाश: अंधेरे स्थितियों के तहत 16 डिग्री सेल्सियस पर कृत्रिम समुद्री जल (ASW) परिसंचारी के साथ प्रयोगशाला मछलीघर में Aplysia बनाए रखें।
  2. पेट गैंगलियन का अलगाव।
    1. 5-10 मिनट (जानवर के शरीर के वजन के 30-35% के बराबर) के लिए 380 m M MgCl2 समाधान इंजेक्शन द्वारा जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
    2. केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में अपनी स्थिति के आधार पर पेट के गैंगलियन की पहचानकरें 24,28.
    3. सर्जिकल ऑपरेशन द्वारा गैंगलिया को हटा दें और तुरंत कृत्रिम समुद्री जल में स्टोर करें जिसमें 450 एमएमएम एनएसीएल, 10 एमएल केसीएल, 10 एमएमएम सीसीएल2,55 एमएमएम एमजीसीएल2,2.5 एमएम एनएएचसीओ3और 10 एमएम एचईपीईएस (पीएच 7.4) शामिल हैं।
  3. प्रोटीज़ उपचार।
    1. ऊपर वर्णित एएसडब्ल्यू में पतला 0.1% प्रोटीज (डिस्पास) के साथ पेट्री डिश में 30 मिनट के लिए 34 डिग्री सेल्सियस±0.5 पर पेट गैंगलियन।
      नोट: इस्तेमाल किए गए प्रोटीज की मात्रा को जानवरों की उम्र और वजन के साथ मानकीकृत करने की आवश्यकता है। सामान्य तौर पर, पुराने और बड़े जानवरों को अधिक प्रोटीज की आवश्यकता होगी।
  4. गैंगलिया म्यान को हटाना।
    1. एंजाइम उपचार के बाद, गैंगलिया को एक सेल चैंबर (Ø= 1 सेमी; vol. 0.3 मिलीलीटर) के सिलगार्ड सिलिकॉन बेस पर पिन करें और कमरे के तापमान (18 डिग्री सेल्सियस±2) पर एएसडब्ल्यू (प्रवाह दर: 150 माइक्रोल/न्यूनतम) के साथ झुकाएं।
      नोट: पहचाने गए न्यूरॉन्स की दृश्यता बढ़ाने के लिए, गैंगलियन को पॉलीकार्बोनेट ग्लास सिलेंडर(चित्रा 1)(व्यास Ø= 2 मिमी संशोधित सेल चैंबर) के शीर्ष पर रखें जिसे 20X और 40X और 40X आवर्धन के साथ दूरबीन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके नीचे से आसानी से प्रकाशित किया जा सकता है।
    2. संदंश और माइक्रो कैंची का उपयोग करके गैंगलियन से म्यान को सावधानी से हटा दें।
  5. दो न्यूरॉन्स से एक साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग।
    1. रुचि के न्यूरॉन की पहचान करें।
    2. 3 एम केसीएल समाधान से भरे प्रतिरोध 10-15 एमΩ के साथ एक एकल इंट्रासेलुलर शार्प माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ न्यूरॉन को इम्पेल करें।
    3. इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग सिस्टम का उपयोग करके रिकॉर्ड न्यूरोनल गतिविधि (10 किलोहर्ट्ज बैंड पास)।
    4. एक्सोग्राफ जैसे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके रिकॉर्डिंग डेटा को संसाधित करें।
      नोट: एक आसानी से कई न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग बाहर ले जा सकते हैं । न्यूरॉन्स L7, L11 या R15 और R2 आसानी से उनकी स्थिति के आधार पर पहचान कर रहे हैं । दो एल7 और R15 न्यूरॉन्स(चित्रा 2)से एक साथ रिकॉर्डिंग के लिए दो एम्पलीफायर और दो माइक्रोमैनीपुलेटर की आवश्यकता होती है।
  6. दवा आवेदन।
    1. कोमल पाइपिंग द्वारा सेल कक्ष में पसंद की दवा लागू करें या सीधे न्यूरॉन्स में इंजेक्ट करें।
    2. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप करें।
      नोट: प्रायोगिक उद्देश्य के आधार पर, कोई भी न्यूरॉन्स के विभिन्न इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापदंडों को माप सकता है जैसे कि दवा आवेदन से पहले, उसके दौरान और बाद में झिल्ली क्षमता (एमपी) या कार्रवाई क्षमता (एपी) में परिवर्तन।
  7. एकल न्यूरॉन्स का अलगाव।
    1. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के समापन पर, एएसडब्ल्यू के परफ्यूजन को रोकें और 100% इथेनॉल के साथ गैंगलियन को धोएं।  इथेनॉल के संपर्क में आने से न्यूरॉन्स को डर लगेगा और, ठीक संदंश का उपयोग करके, गैंगलियन से अन्य न्यूरॉन्स को नुकसान पहुंचाए बिना व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को हटाना आसान हो जाएगा।
    2. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत एकल न्यूरॉन्स निकालें और बर्फ ठंड 500 माइक्रोन आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट युक्त एक छोटे से Eppendorf ट्यूब में स्थानांतरित करें। अलग एकल न्यूरॉन्स भविष्य के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए निष्कर्षण अभिवाक में संग्रहीत किया जा सकता है।

2. मात्रात्मक रियल टाइम पीसीआर (क्यूपीसीआर) द्वारा एकल न्यूरॉन्स और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से आरएनए अलगाव

  1. आरएनए क्षरण को कम करने के लिए सावधानियां:
    रिबोन्यूक्लिस (आरएनए) आरएनए को नीचा दिखाता है और बहुत स्थिर और सक्रिय एंजाइम होते हैं। आरएनए को संभालने के दौरान निम्नलिखित कदम उठाएं।
    1. RNase निष्क्रिय एजेंटों के साथ कार्य क्षेत्र और उपकरणों को साफ करें।
    2. आरएनए को संभालते समय हर समय दस्ताने पहनें और अक्सर दस्ताने बदलें।
    3. आरएनए को संभालने के लिए केवल आरएनएई मुफ्त प्लास्टिक का उपयोग करें।
  2. एकल न्यूरॉन्स से कुल आरएनए अलग:
    1. आरएनए अलगाव के लिए मानक Trizol प्रोटोकॉल एकल न्यूरॉन्स से RNAs को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ट्रिजोल में क्लोरोफॉर्म का 20% v/v संक्षेप में जोड़ें, संक्षिप्त भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए रोटेटर पर रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर ट्राइज़ोल-क्लोरोफॉर्म मिश्रण स्पिन करें।
    3. जलीय चरण ले लीजिए और एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. आरएनए को उपजी करने के लिए 0.3 एम, 100 एनजी/मिलीलीटर कोप्रिपिजेंट ग्लायकोब्लू की अंतिम एकाग्रता और 100% इथेनॉल के 2.5 वॉल्यूम में सोडियम एसीटेट समाधान (पीएच 5.5) जोड़ें।
    5. नमूनों को अच्छी तरह से मिलाएं और रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर नमूनों को स्पिन करें और ट्यूब के नीचे एक छोटा नीला गोली दिखाई देगी।
    7. सुपरनेट निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर 75% बर्फ-ठंडे इथेनॉल के 850 माइक्रोन के साथ गोली धोएं।
    8. सुपरनेट को ध्यान से निकालें और हवा-7-10 मिनट, अधिकतम के लिए आरएनए गोली सूखी।
      नोट: सुनिश्चित करें कि आरएनए लंबे समय के लिए नहीं छोड़ा जाता है केरूप में सूखने के लिए-आरएनए गोलीसुखाने घुलनशीलता बहुत मुश्किल बना देता है ।
    9. एक बार सूख जाने के बाद, आरएनएई मुफ्त पानी के 10 माइक्रोन में आरएनए गोली को फिर से खर्च करें और आरएनए एकाग्रता निर्धारित करें।
      नोट: स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता का निर्धारण करें। तुरंत उपयोग नहीं करने पर, आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. एकल न्यूरॉन्स से aRNA संश्लेषण:
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रैखिक आरएनए प्रवर्धन प्रणाली का उपयोग करके आरएनए (प्रायोगिक उद्देश्य के आधार पर एक या दो राउंड) को बढ़ाना।
      नोट: एकल न्यूरॉन्स से कुल आरएनए ~ 10-60 एनजी से लेकर । प्रवर्धन के पहले दौर की अपेक्षित उपज ~ 100-300 एनजी है और प्रवर्धन का दूसरा दौर आरएनए का ~ 0.8-1.5 माइक्रोग्राम है।
  4. आरएनए का रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन:
    1. आरएनए से सीडीएनए उत्पन्न करने के लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन के 20 माइक्रोन में 1.0 माइक्रोन का उपयोग करें। इस उद्देश्य के लिए कई किट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।

      नोट: सीडीएनए को थर्मल साइकिलर पर निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार संश्लेषित किया गया था।
      25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट
      42 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट
      85 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट
      4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो
    2. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन स्टेप के बाद, सीडीएनए को लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. प्राइमर डिजाइन और मानकीकरण:
    रियल टाइम प्रवर्धन के लिए प्राइमर डिजाइन करने के लिए कई उत्कृष्ट सॉफ्टवेयर प्रोग्राम मुफ्त में उपलब्ध हैं।
    1. 18-24 मेर ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का चयन करें जो 70-110 बीपी एम्प्लिकॉन का उत्पादन करते हैं और वाणिज्यिक स्रोतों का उपयोग करके प्राइमर को संश्लेषित करते हैं।
      नोट: दो से तीन प्राइमर जोड़े ब्याज के प्रत्येक जीन के लिए डिजाइन किया जाना चाहिए । प्रत्येक प्राइमर सेट को क्यूपीसीआर द्वारा मानकीकृत करने की आवश्यकता होती है। आगे और रिवर्स प्राइमर जोड़े कि जीन CREB1(चित्रा 4)के लिए इस्तेमाल किया गया नीचे हैं:

      प्राइमर सेट 1
      फॉरवर्ड: 5'-TGATTCTGACGAGAAGAAGAAGAAGAAGA-3'
      रिवर्स: 5'-ACCGTGAGCAGTAGTAGTAGA-3 '
      प्राइमर सेट 2
      फॉरवर्ड: 5'-AGGGAATGGATGAAGAAGAAGA-3'

      रिवर्स: 5'-GACACACAGAAGTATCCAAA-3 '
    2. डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उपयोग किए जाने वाले सर्वश्रेष्ठ प्राइमर का चयन करने के लिए, सीटी मूल्य की निगरानी और क्यूपीसीआर में प्रवर्धन वक्र के आकार।
      नोट: एक चिकनी पठार के बाद पीसीआर के घातीय चरण के दौरान 40 दौर प्रवर्धन और चिकनी घटता में 10-35 के बीच सीटी (चक्र सीमा) मूल्य देने वाले प्राइमर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इष्टतम होते हैं।
  6. मात्रात्मक रियल टाइम पीसीआर (क्यूपीसीआर):
    नोट: क्यूपीसीआर मशीन के अनुकूल उपयुक्त ट्यूब या प्लेटों का उपयोग करें।
    1. नाभिक मुक्त पानी के साथ 5x करने के लिए पतला सीडीएनए।
    2. पतला सीडीएनए के 2 माइक्रोन करने के लिए, एक क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण के 8 माइक्रोन जोड़ें जिसमें एच 2 ओ के 2 माइक्रोन,2xSYBR ग्रीन मास्टर मिक्स के 5 माइक्रोन, और 10 माइक्रोन (प्रत्येक) के 1.0 माइक्रोन आगे और रिवर्स प्राइमर शामिल हैं।
    3. ट्यूबों को बंद करें और सीडीएनए और मास्टर मिक्स को पाइपिंग करने के बाद प्लेट को सील करें। कोमल दोहन द्वारा सामग्री मिलाएं और 30 सेकंड के लिए 1,500 आरपीएम पर नीचे कताई करें।
    4. क्यूपीसीआर मशीन स्थापित करने के लिए आगे बढ़ें।

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Representative Results

इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए जानवरों का वजन 100-200 ग्राम से लेकर था। वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, हमने 2-5 ग्राम से लेकर 200-300 ग्राम तक के जानवरों से अलग पेट गैंगलिया के न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप और आणविक विश्लेषण का आयोजन किया।

गंगलिया में न्यूरॉन्स के सफल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप के लिए प्रोटीज उपचार का मानकीकरण महत्वपूर्ण है। प्रारंभ में, कई प्रोटीज (डिस्पास) सांद्रता और अवधि का उपयोग किया गया था और R15 न्यूरॉन से एक्शन क्षमता को फोड़ने की क्षमता26,31दर्ज की गई थी। इन मापों की तुलना बरकरार गंगलिया से प्रत्यक्ष (प्रोटीज उपचार के बिना) रिकॉर्डिंग से की गई थी। प्रोटीज़ की एकाग्रता (0.1% प्रोटीज़, चरण 1.3 देखें) जो फटने की क्षमता का उत्पादन करती थी जो बिना किसी प्रोटीज़ के उजागर गैंगलियन से प्राप्त लोगों के बराबर थीं, बाद के प्रयोगों में उपयोग की जाती थीं।

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, R15, एक कोलिनेर्गिक न्यूरॉन और एल 7, एक मोटर न्यूरॉन जो Ach का जवाब नहीं देता है, के लिए Ach जोखिम के जवाब में कार्रवाई क्षमता (एपी) दर्ज की गई। जैसा कि अपेक्षित था, एक साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग से पता चलता है कि Ach R15 में depolarization प्रेरित करता है जबकि L7 की गोलीबारी में कोई परिवर्तन नहीं हुआ था। चित्रा 2 सीधे सेल कक्ष में एसीटिलचोलिन (Ach) के आवेदन को दर्शाता है। कक्ष के अंदर अंतिम 1 mm एकाग्रता प्राप्त करने के लिए माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 1 एम आच (वॉल्यूम 0.3 माइक्रोल) सीधे कक्ष में लागू किया गया था।

Ach परफ्यूजन द्वारा स्नान से धोया गया था और R15 न्यूरॉन्स से फिर से दर्ज की गई । चित्रा 3 तरंग बताते हैं कि Ach प्रभाव प्रतिवर्ती है। नियंत्रण में मापदंडों एपी का विश्लेषण, depolarization के दौरान और धोने के बाद दिखाया गया है । 2018 के दौरान आयाम कम हो जाता है और एपी की अवधि में काफी वृद्धि होती है।

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापन के बाद, R15 और L7 न्यूरॉन्स अलग थे और RNAs qPCR विश्लेषण के लिए तैयार किए गए थे । एम्बियन से मैसेजएम्प II एआरएनए प्रवर्धन किट का उपयोग करके एक रैखिक T7 आरएनए पॉलीमेरेज-संचालित ट्रांसक्रिप्शन का उपयोग एकल न्यूरॉन्स से आरएनए को बढ़ाने के लिए किया गया था। तुलना के लिए, पहचाने गए न्यूरॉन्स R2 और L11 और वयस्क (6-9 महीने पुराने) और युवा जानवरों (1-2 महीने पुराने) से पूरे पेट गैंगलिया का भी अध्ययन किया गया। क्यूपीसीआर प्रवर्धन निम्नलिखित शर्तों के तहत 7900HT फास्ट रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम में किया गया था: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस। प्रयोग में चार जैविक प्रतिकृति थे । प्रत्येक जैविक प्रतिकृति क्यूपीसीआर स्थापित में चार तकनीकी प्रतिकृति थी । चार प्रतिकृति से सीटी मानों का औसत था और प्रत्येक नमूने(चित्रा 4)में CREB1 के पूर्ण अभिव्यक्ति स्तर को खोजने के लिए 1/सीटी की गणना की गई थी । युवा और वयस्क एप्लिसिया गंगलिया में CREB1 जीन के पूर्ण अभिव्यक्ति के स्तर का अनुमान है, और चार में पहचाने गए एकल न्यूरॉन्स क्यूपीसीआर माप से प्राप्त सीटी मूल्य द्वारा निगरानी की गई थी।

शुरुआती एमआरएनए एकाग्रता युवा और वयस्क पेट गैंगलिया दोनों में एक ही थी। एक ही आगे और रिवर्स CREB1 प्राइमर सेट सभी qPCRs में इस्तेमाल किया गया, दोनों गंगलिया और एकल न्यूरॉन्स का उपयोग कर अध्ययन में । सीटी मान युवा और वयस्क पेट गैंगलिया के बीच बहुत समान हैं। इसी तरह, सीटी मानों को एकल न्यूरॉन्स के मामले में मापा गया था जहां शुरुआती कुल एमआरएनए सांद्रता कम थी और प्रवर्धन के दो दौर सीडीएनए संश्लेषण के लिए आरएनए की एक अच्छी मात्रा में मिले थे। CREB1 प्रवर्धन के सीटी मूल्यों का सुझाव दिया है कि R15 और L7 न्यूरॉन्स में CREB1 अभिव्यक्ति तुलनीय हैं, जबकि R2 और L11 अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया जब L7 या R15 (छात्र टी परीक्षण, पी<०.०५)(चित्रा 4)की तुलना में ।

Figure 1
चित्रा 1. गंगलिया इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए माइक्रोस्कोप स्टेज और परफ्यूजन सिस्टम। परफ्यूजन सिस्टम और स्टेज प्लेक्सीग्लास का उपयोग करके बनाए गए थे और पारदर्शी हैं। इस सेटअप को स्थिति को पकड़ने के लिए धातु ब्लॉक (नहीं दिखाया गया) पर रखा गया है। मेटल ब्लॉक को इस तरह डिजाइन किया गया है कि नमूनों को नीचे से रोशन किया जा सके। R15 न्यूरॉन से दर्ज एक नमूना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल फटने पैटर्न दिखाया गया है।

Figure 2
चित्रा 2। पेट गैंगलिया के L7 और R15 न्यूरॉन से एक साथ रिकॉर्डिंग। (A)पेट गैंगलिया का कार्टून जिसमें एल 7 और आर15 न्यूरॉन्स की स्थिति दिखाई गई है (कंडेल 2001 से संशोधित, एएएएस की अनुमति से पुनर्मांकित)। इसके अलावा दिखाया गया है पेट गैंगलिया में R2 और L11 की स्थिति है । (ख)L7 और R15 से प्रतिनिधि इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग । तीर Ach आवेदन के समय को इंगित करता है। एक 8-10 घंटे के लिए इन माप जारी रख सकते हैं ।

Figure 3
चित्र 3। Ach R15 की कार्रवाई क्षमता (एपी) में परिवर्तन प्रेरित किया । एपी तरंगों का विश्लेषण पहले, उसके दौरान और Ach एक्सपोजर के बाद किया गया था। प्रतिनिधि तरंग रूप दिखाए जाते हैं। एमएस: मिलीसेकंड, एमवी: मिलीवोल्ट।

Figure 4

चित्र 4. पेट गैंगलिया और एकल पहचान न्यूरॉन्स में CREB1 की अभिव्यक्ति का क्यूपीसीआर विश्लेषण। (ए) एप्लिसियाके युवा और वयस्क पेट गैंगलिया में सीआरईबी1 ट्रांसक्रिप्ट का पूर्ण मात्राकरण । कुल आरएनए को मानक ट्राइज़ोल प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग किया गया था जैसा कि तरीकों में वर्णित है। कुल आरएनए के 1 माइक्रोन का उपयोग सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए किया गया था, जिसके बाद क्रेब 1 प्राइमर का उपयोग करके वास्तविक समय पीसीआर प्रवर्धन किया गया था। (ख) ओल्ड एपलिसियाके पहचाने गए एकल न्यूरॉन्स में सीआरईबी1 ट्रांसक्रिप्ट का पूर्ण मात्राकरण । सीडीएनए संश्लेषण से पहले कुल आरएनए को इन विट्रो प्रवर्धन के दो दौर के अधीन किया गया था। 1 μg aDNA संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था, वास्तविक समय पीसीआर प्रवर्धन CREB1 प्राइमर का उपयोग कर के बाद ।

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Discussion

न्यूरॉन R15 हृदय, पाचन, श्वसन, और प्रजनन प्रणाली30को विनियमित करने में शामिल है । एपी की एक नियमित रूप से लयबद्ध फोड़ गतिविधि R15 की एक विशेषता है । जैसा कि परिणाम अनुभाग में दिखाया गया है, R15 और L7 की जोड़ी रिकॉर्डिंग से पता चलता है कि गैंगलिया तैयारी ने R15 न्यूरॉन्स की गतिविधि को संरक्षित किया है। R15 और L7 न्यूरॉन्स Ach को उचित जवाब दिया । इस गैंगलिया की तैयारी को 8-10 घंटे तक बनाए रखा जा सकता है और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल एक्टिविटी पर लगातार नजर रखी जा सकती है । इस प्रकार, कोई भी लंबे समय तक संक्षिप्त न्यूरोट्रांसमीटर एक्सपोजर (स्थानीय रूप से एक विशिष्ट न्यूरॉन या स्नान के लिए उजागर) के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रभावों का अध्ययन कर सकता है। इसके अलावा, कोई भी खुद के या अनुयायी न्यूरॉन या दोनों के गुणों को दागने पर एक ही न्यूरॉन पर कई न्यूरोट्रांसमीटर (एक साथ या मिलकर) के संपर्क के प्रभावों का अध्ययन कर सकता है।

क्यूपीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति मापन का एक उदाहरण चित्र 4में दिखाया गया है । चूंकि एक ही न्यूरॉन की आरएनए सामग्री कम है, इसलिए इन विट्रो प्रवर्धन कई जीनों की मात्रात्मक अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त मात्रा में आरएनए प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया के लिए वाणिज्यिक किट उपलब्ध हैं। CREB1 ट्रांसक्रिप्ट के प्रवर्धन को सीधे मानकीकृत फ्लोरेसेंस सिग्नल, सीटी-विधि31प्राप्त करने के लिए आवश्यक चक्रों की संख्या से निर्धारित किया गया था। एक ही न्यूरॉन से परिलक्षित आरएनए अध्ययनों के लिए पर्याप्त है ताकि माइक्रोएरे32 का उपयोग करके जीन की बड़ी संख्या में जीन में परिवर्तन निर्धारित किया जा सके और आरएनएसेक द्वारा संपूर्ण ट्रांसक्रिप्टोम का विश्लेषणकियाजा सके ।

इस तकनीक की एक सीमा यह है कि यह तैयारी पेट गैंगलिया के न्यूरॉन्स के सभी सिनैप्टिक कनेक्शन को संरक्षित नहीं कर सकती है। न्यूरॉन्स के कई अन्य गैंगलिया में न्यूरॉन्स के साथ synapses फार्म और गैंगलिया तैयारी में इन लंबी दूरी के कनेक्शन याद किया जाएगा। हालांकि, यहां वर्णित पद्धति को आसानी से पूरे सीएनएस को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है या आसानी से अर्ध-बरकरार तैयारी13,14,16 को एकीकृत किया जा सकता है जिसे गिल और साइफन निकासी पलटा में सेलुलर और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए वर्णित किया गया था।

जीनोमिक्स तकनीकों में हाल की प्रगति अब हमें कोडिंग और नॉनकोडिंग आरएनए34की अभिव्यक्ति की गतिशीलता में गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की अनुमति देती है। कम तैयारी है कि यहां वर्णित है इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप के साथ संयोजन के रूप में जीन अभिव्यक्ति के लौकिक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए आदर्श है । उदाहरण के लिए, कोई भी औषधीय एजेंटों को लागू कर सकता है और व्यक्तिगत न्यूरॉन्स या कई न्यूरॉन्स के विद्युत गुणों पर उनके प्रभावों को माप सकता है जो एक ही तंत्रिका सर्किटरी का हिस्सा हैं और आरएनए अलगाव के लिए अलग-अलग समय पर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को अलग करते हैं। पूरे पहचाने गए सर्किटरी पर एक ही न्यूरॉन (जैसे विद्युत उत्तेजना, या औषधीय एजेंटों के संपर्क में हेरफेर के प्रभाव का अध्ययन एकल न्यूरॉन्स में विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन के स्तर पर किया जा सकता है। इस प्रकार यह पद्धति एपलिसियामें तंत्रिका सर्किटरी का अध्ययन करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और जीनोमिक पद्धतियों के सफल एकीकरण की सुविधा प्रदान करती है ।

इस दृष्टिकोण को आसानी से अन्य अकशेरुकी मॉडलों जैसे नुदिब्रांक मोलस्क ट्राइटोनिया, तालाब घोंघा लिमनिया, और स्थलीय घोंघा हेलिक्स के अध्ययन तक आसानी से बढ़ाया जा सकता है जिनके तंत्रिका तंत्र में कई पहचाने गए न्यूरॉन्स35-57होते हैं। इन मॉडलों का उपयोग उन व्यवहारों के तंत्रिका नियंत्रण के अध्ययन के लिए भी बड़े पैमाने पर किया जाता है जैसे कि एस्केप स्विमिंग, चुंबकीय क्षेत्र अभिविन्यास, सिनैप्स गठन, सीखने और स्मृति भंडारण। हमने जिस पद्धति का वर्णन किया है वह एकल कोशिका स्तर पर न्यूरोनल गतिविधि के शारीरिक मापों के साथ जीनोमिक्स विश्लेषण का एक सरल एकीकरण है। व्यवहार के तंत्रिका नियंत्रण के आणविक और शारीरिक आधार में एक गहरी अंतर्दृष्टि ऐसे अध्ययनों से प्राप्त किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है ।

Acknowledgments

हम ईमानदारी से इस काम को अंजाम देने के लिए स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट से उनके फंडिंग सपोर्ट और स्टार्टअप फंड्स के लिए व्हाइटहॉल फाउंडेशन को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica

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न्यूरोबायोलॉजी अंक 83 इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग पहचाने गए न्यूरॉन तंत्रिका सर्किटरी जीन अभिव्यक्ति एक्शन पोटेंशियल क्रेब एपलिसिया कैलिफॉर्निया,जीनोमिक्स
<em>एपलिसिया</em> सिंगल न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और मॉलिक्यूलर एनालिसिस के लिए गैंगलिया तैयारी
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Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).

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