Summary
Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelleri üzerine yapılan çalışmalar için nörobiyoloji modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, tanımlanan sinir devrelerinin tek nöronlarının elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia'nın sinir sistemini keşfetmek için bir metodoloji açıklanmaktadır.
Abstract
Nörobiyolojide önemli bir zorluk, belirli bir davranışı yöneten sinir devrelerinin moleküler temellerini anlamaktır. Spesifik moleküler mekanizmalar belirlendikten sonra, dejeneratif hastalıkların veya sinir sisteminin yaşlanmasının neden olduğu belirli davranışlardaki anormallikleri tedavi etmek için yeni terapötik stratejiler geliştirilebilir. Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelinin araştırılması için çok uygundur, çünkü belirli bir davranışın altında kalan sinir devreleri kolayca belirlenebilir ve devrenin bireysel bileşenleri kolayca manipüle edilebilir. Aplysia'nın bu avantajları, öğrenme ve hafıza nörobiyolojisinin birkaç temel keşifine yol açmıştır. Burada, aplysia sinir sisteminin bireysel nöronların elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için bir hazırlığını açıklıyoruz. Kısaca, sinir sisteminden parçalanan ganglion, ganglion kılıfını çıkarmak için proteazlara maruz kalır, böylece nöronlar maruz kalır, ancak bozulmamış hayvanda olduğu gibi nöronal aktiviteyi korur. Bu preparat, tek veya birden fazla nöronun elektrofizyolojik ölçümlerini yapmak için kullanılır. Daha da önemlisi, basit bir metodoloji kullanılarak kaydı takiben, nöronlar gen ekspresyon analizi için doğrudan gangliyondan izole edilebilir. Bu protokoller, L7 ve R15 nöronlarından eşzamanlı elektrofizyolojik kayıtları gerçekleştirmek, aplysia'nınizole tek L7, L11, R15 ve R2 nöronlarında CREB1 geninin asetilkolin ve nicel ekspresyonlarına yanıtlarını incelemek için kullanıldı.
Introduction
İnsan beyni, neredeyse 100 milyar nöron ve trilyonlarca sinaptik bağlantı ile olağanüstü karmaşıktır. Nöronlarla etkileşime giren ve beyindeki işlevlerini düzenleyen neredeyse eşit sayıda nonneuronal hücre vardır. Nöronlar belirli davranışları düzenleyen devreler halinde düzenlenir. Beyin fonksiyonlarını ve sinir devrelerini anlamamızdaki gelişmelere rağmen, belirli bir davranışı kontrol eden devre bileşenlerinin kimliği hakkında çok az şey bilinmektedir. Bir devrenin çeşitli bileşenlerinin kimliklerinin bilgisi, davranışın hem hücresel hem de moleküler temelini anlamamızı büyük ölçüde kolaylaştıracak ve nöropsikiyatrik bozukluklar için yeni terapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olacaktır.
Deniz salyangozu Aplysia californica, belirli davranışların altında kalan nöronal devreleri belirlemek için bir çalışma atı olmuştur1-14. Aplysia sinir sistemi, 9 farklı gangliyon halinde organize edilmiş yaklaşık 20.000 nöron içerir. Aplysia'nın nöronları büyüktür ve boyutlarına, elektriksel özelliklerine ve gangliyondaki konumlarına göre kolayca tanımlanabilir. Aplysia, çalışılabilen zengin bir davranış repertuarına sahiptir. İyi çalışılmış davranışlardan biri solungaç çekme refleksidir (GWR). Bu refleksin merkezi bileşenleri abdominal gangliyonlarda bulunur. GWR devresinin bileşenleri haritalandı ve çeşitli bileşenlerin katkıları belirlendi. Daha da önemlisi, GWR devresi ilişkilendirilebilir ve ilişkisiz öğrenmeden geçer5,6,15-19. Bu refleks üzerinde onlarca yıllık çalışma da öğrenme ve hafızada kilit bir role sahip birkaç sinyal yolu tanımlamıştır20-24.
Hafıza depolamanın hücresel ve moleküler temelini incelemek için Aplysia'nın birkaç farklı preparatı kullanıldı. Bunlar arasında sağlam hayvan2,3, yarı bozulmamış hazırlık1,7,13,14,16 ve nöral devrenin ana bileşenlerinin yeniden25-29. Tanımlanan nöronal devrelerin elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia gangliyonlarını keşfetmeye yönelik daha az hazırlık burada açıklanmıştır. Tespit edilen dört nöron incelendi. R15, patlayan bir nöron, L7 ve L11, iki farklı motor nöron ve bir kolinerjik nöron olan R2 incelendi. R2 omurgasız sinir sisteminde tanımlanan en büyük nörondur. Kısaca, bu metodoloji gangliyonların proteaz tedavisini, farmakolojik tedavilerden önce ve sonra elektrofizyolojik ölçümleri ve gen ekspresyonunun nicel analizi için tek nöronların izolasyonu içerir. Bu metodoloji, moleküler analizleri birden fazla nörondan eşzamanlı kayıtla birleştirmemizi sağlar. Bu metodoloji, R15 ve L7 nöronlarının asetilkoline (Ach) eşleştirilmiş hücre içi kayıtlarla verdiği yanıtları incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Elektrofizyolojik ölçümler sonrasında R15 ve L7 ve L11 ve R2 gibi tanımlanan diğer nöronlar, bellek depolama için önemli bir transkripsiyon faktörü olan CREB1 ekspresyonunun nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi için izole edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Abdominal Ganglion Aplysia californica Abdominal Ganglion'dan Abdominal Ganglionların Hazırlanması, Elektrofizyolojik Ölçümler ve Tek Tanımlanmış Nöronların İzolasyonu
- Aplysia'yı laboratuvar akvaryumunda 12:12 ışık:karanlık koşullar altında 16 °C'de dolaşan yapay deniz suyu (ASW) ile koruyun.
- Karın ganglionunun izolasyonu.
- 5-10 dakika boyunca 380 mM MgCl2 çözeltisi enjekte ederek hayvanları uyuşturun (hayvanın vücut ağırlığının% 30-35'ine eşdeğer).
- Karın ganglionunu merkezi sinir sistemindeki konumuna göre tanımlayın24,28.
- Gangliyleri cerrahi operasyonla çıkarın ve hemen 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3ve 10 mM HEPES 'den (pH 7,4) oluşan yapay deniz suyunda saklayın.
- Proteaz tedavisi.
- Yukarıda açıklanan ASW'de seyreltilmiş% 0±1 proteaz (dispaz) ile bir Petri kabında 34 °C±0.5'te 30 dakika boyunca karın ganglionunu kuluçkaya yatır.
NOT: Kullanılan proteaz miktarının hayvanların yaşı ve ağırlığı ile standartlaştırılması gerekir. Genel olarak, yaşlı ve daha büyük hayvanlar daha fazla proteaz gerektirir.
- Yukarıda açıklanan ASW'de seyreltilmiş% 0±1 proteaz (dispaz) ile bir Petri kabında 34 °C±0.5'te 30 dakika boyunca karın ganglionunu kuluçkaya yatır.
- Gangliyon kılıfa kaldırılması.
- Enzim tedavisinden sonra, gangliyolayı bir hücre odasının Sylgard Silikon tabanına sabitleyin (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) ve oda sıcaklığında (18 °C±2) ASW (akış hızı: 150 μl/ dk) ile perfuse.
NOT: Tanımlanan nöronların görünürlüğünü artırmak için ganglionu, 20X ve 40X büyütmeli dürbün stereomikroskop kullanılarak alttan kolayca aydınlatılabilen polikarbonat cam silindirin(Şekil 1) (çap Ø= 2 mm modifiye hücre odası) üstüne yerleştirin. - Kılıbını, kümesleri ve mikrosirsörler kullanarak gangliyondan dikkatlice çıkarın.
- Enzim tedavisinden sonra, gangliyolayı bir hücre odasının Sylgard Silikon tabanına sabitleyin (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) ve oda sıcaklığında (18 °C±2) ASW (akış hızı: 150 μl/ dk) ile perfuse.
- İki nörondan eşzamanlı elektrofizyolojik kayıt.
- İlgi çekici nöronları tanımlayın.
- Nöron, 3 M KCl çözeltisi ile doldurulmuş 10-15 MΩ dirençli tek bir hücre içi keskin mikroelekrod ile impale edin.
- Hücre içi kayıt sistemi kullanarak nöronal aktiviteyi (10 kHz bant geçişi) kaydedin.
- Kayıt verilerini Axograph gibi elektrofizyoloji yazılımı kullanarak işleyin.
NOT: Kişi birden fazla nörondan kaydı kolayca gerçekleştirebilir. Nöronlar L7, L11 veya R15 ve R2 konumlarına göre kolayca tanımlanır. İki L7 ve R15 nörondan aynı anda kayıt için iki amplifikatör ve iki mikromanipülatör gereklidir (Şekil 2).
- İlaç uygulaması.
- Seçtiğiniz ilacı nazik pipetleme ile hücre odasına uygulayın veya doğrudan nöronlara enjekte edin.
- Elektrofizyolojik ölçümler yapmak.
NOT: Deneysel hedefe bağlı olarak, ilaç uygulamasından önce, ilaç uygulaması sırasında ve sonrasında membran potansiyelindeki (MP) veya eylem potansiyelindeki (AP) değişiklikler gibi nöronların farklı elektrofizyolojik parametreleri ölçülebilir.
- Tek nöronların izolasyonu.
- Elektrofizyolojik deneylerin sonunda, ASW'nin perfüzyonunu durdurun ve ganglionu% 100 etanol ile yıkayın. Etanol maruziyeti nöronları taşlaştıracak ve ince kümesler kullanarak, gangliondan diğer nöronlara zarar vermeden bireysel nöronların çıkarılmasını kolaylaştıracaktır.
- Stereomikroskop altında tek nöronları çıkarın ve buz gibi 500 μl RNA ekstraksiyon reaktifi içeren küçük bir Eppendorf tüpüne aktarın. İzole tek nöronlar gelecekteki analizler için -80 °C'de RNA ekstraksiyon reaktifinde saklanabilir.
2. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qPCR) ile Tek Nöronlardan RNA İzolasyonu ve Gen Ekspresyon Analizi
- RNA bozulmasını en aza indirmek için önlemler:
Ribonikleazlar (RNazlar) RNA'yı bozar ve çok kararlı ve aktif enzimlerdir. RNA'ları işlerken aşağıdaki adımları uygulayın.- Çalışma alanını ve aletleri RNase devre dışı bırakma ajanları ile temizleyin.
- RNA kullanırken her zaman eldiven giyin ve sık sık eldiven değiştirin.
- RNA'ları işlemek için yalnızca RNase içermeyen plastikler kullanın.
- Total RNA'nın Tek nöronlardan izole edilmesi:
- RNA izolasyonu için standart Trizol protokolü, RNA'ları tek nöronlardan izole etmek için kullanılabilir. Trizol'a kısaca% 20 v / v kloroform ekleyin, kısa girdap ile iyice karıştırın.
- Tüpleri 4 °C'de 10 dakika boyunca rotator üzerine yerleştirin. Trizol-Kloroform karışımını 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika döndürün.
- Sulu fazı toplayın ve taze bir tüpe aktarın.
- RNA'yı çökeltmek için 0,3 M, 100 ng/ml coprecipitant GlycoBlue ve 2,5 hacim %100 etanol nihai konsantrasyonuna sodyum asetat çözeltisi (pH 5,5) ekleyin.
- Numuneleri iyice karıştırın ve gece boyunca -80 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Numuneleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 12.000 x g'da döndürün ve tüpün dibinde küçük mavi bir pelet görünecektir.
- Süpernatant çıkarın ve peletin 850 μl% 75 buz gibi etanol ile 12.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca yıkayın.
- Üstnatant dikkatlice çıkarın ve RNA peletini maksimum 7-10 dakika boyunca havayla kurulayın.
NOT: RNA'nın uzunsüre kurumaya bırakılmamasını bekleyin - RNA peletininkurutılması çözünürlüğü çok zorlaştırır. - Kuruduktan sonra, RNA peletini 10 μl RNAse serbest suya yeniden boşaltın ve RNA konsantrasyonu belirleyin.
NOT: Spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu belirleyin. Hemen kullanmadığınızda, RNA'yı -80 °C'de saklayın.
- tek nöronlardan aRNA sentezi:
- Ticari olarak kullanılabilen doğrusal RNA amplifikasyon sistemini kullanarak RNA'yı (deneysel hedefe bağlı olarak bir veya iki tur) güçlendirin.
NOT: Tek nöronlardan elde edilen toplam RNA ~10-60 ng arasında değişmektedir. İlk tur amplifikasyonun beklenen verimi ~100-300 ng ve ikinci amplifikasyon turu ~0.8-1.5 μg RNA'dır.
- Ticari olarak kullanılabilen doğrusal RNA amplifikasyon sistemini kullanarak RNA'yı (deneysel hedefe bağlı olarak bir veya iki tur) güçlendirin.
- RNA'nın ters transkripsiyon:
- aRNA'dan cDNA oluşturmak için, 20 μl ters transkripsiyon reaksiyonunda 1,0 μg aRNA kullanın. Bu amaçla çeşitli kitler ticari olarak mevcuttur.
NOT: cDNA, termal çevrimcide aşağıdaki ayarlar kullanılarak üreticinin protokolüne göre sentezlenmiştir.
25 °C'de 5 dk
42 °C'de 30 dk
85 °C'de 5 dk
4 °C'de tutun - Ters transkripsiyon adımından sonra, cDNA'yı uzun süreli depolama için -20 °C'de saklayın.
- aRNA'dan cDNA oluşturmak için, 20 μl ters transkripsiyon reaksiyonunda 1,0 μg aRNA kullanın. Bu amaçla çeşitli kitler ticari olarak mevcuttur.
- Astar tasarımı ve standardizasyonu:
Gerçek zamanlı amplifikasyonlar için astarlar tasarlamak için ücretsiz olarak çeşitli mükemmel yazılım programları mevcuttur.- 70-110 bp amplicon üreten ve astarları ticari kaynakları kullanarak sentezleyen 18-24 mer oligonükleotid seçin.
NOT: İlgi çekici her gen için iki ila üç astar çifti tasarlanmalıdır. Her astar setin qPCR tarafından standartlaştırılması gerekir. CREB1 geni için kullanılan ileri ve geri astar çiftleri (Şekil 4) aşağıdadır:
Astar seti 1
İleri: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3'
Geri vites: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
Astar seti 2
İleri: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'
Ters: 5'-GACACAGGAAGTATGCCAAA-3' - Aşağı akış analizleri için kullanılacak en iyi astarı seçmek için ct değerini ve qPCR'deki amplifikasyon eğrisinin şeklini izleyin.
NOT: PCR'nin üstel fazında 40 yuvarlak amplifikasyonda 10-35 arasında Ct (Döngü eşiği) değerleri ve ardından pürüzsüz bir plato ile pürüzsüz eğriler veren primerler gen ekspresyon analizleri için en uygunudur.
- 70-110 bp amplicon üreten ve astarları ticari kaynakları kullanarak sentezleyen 18-24 mer oligonükleotid seçin.
- Nicel Gerçek Zamanlı PCR (qPCR):
Not: qPCR makinesiyle uyumlu uygun tüpler veya plakalar kullanın.- CDNA'yı çekirdeksiz su ile 5x'e seyreltin.
- 2 μl seyreltilmiş cDNA'ya, 2 μl H 2 O, 5 μl2xSYBR Green master mix ve 10 μM (her biri) ileri ve ters astar içeren 8 μl qPCR ana karışımı ekleyin.
- Boruları kapatın ve cDNA ve ana karışımı pipetledikten sonra plakayı kapatın. 30 saniye boyunca 1.500 rpm'de hafifçe dokunup aşağı döndürerek içeriği karıştırın.
- qPCR makinesini kurmaya devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada kullanılan hayvanların ağırlıkları 100-200 g arasında değişmektedir. Açıklanan protokollerin ardından 2-5 g ile 200-300 g arasında değişen hayvanlardan izole edilmiş abdominal gangliyon nöronlarının elektrofizyolojik ölçümlerini ve moleküler analizlerini yaptık.
Proteaz tedavisinin standardizasyonu, gangliyonlardaki nöronların başarılı elektrofizyolojik ölçümleri için önemlidir. Başlangıçta, birden fazla proteaz (Dispase) konsantrasyonu ve süresi kullanıldı ve R15 nörondan patlama eylem potansiyellerikaydedildi 26,31. Bu ölçümler bozulmamış gangliyondan doğrudan (proteaz tedavisi olmadan) kayıtla karşılaştırıldı. Sonraki deneylerde, proteaz olmadan maruz kalan ganglionlardan elde edilenlerle karşılaştırılabilir patlama potansiyelleri üreten proteaz konsantrasyonu (%0.1 proteaz, bkz. adım 1.3) kullanılmıştır.
Açıklanan protokol kullanılarak, Ach'ın kolinerjik bir nöron olan R15'e ve Ach'a yanıt vermeyen bir motor nöron olan L7'ye maruz kalmasına yanıt olarak eylem potansiyelleri (AP) kaydedildi. Beklendiği gibi, eşzamanlı elektrofizyolojik kayıtlar, Ach'ın R15'te depolarizasyona neden olduğunu, L7'nin ateşlenmesinde bir değişiklik olmadığını göstermektedir. Şekil 2, Asetilkolin (Ach) uygulamasını doğrudan hücre odasına gösterir. Odanın içinde son 1 mM konsantrasyon elde etmek için mikropipette kullanılarak doğrudan odaya 1 M Ach (hacim 0,3 μl) uygulandı.
Ach perfüzyon ile banyodan yıkandı ve R15 nöronlarından tekrar kaydedildi. Şekil 3, Ach etkisinin geri döndürülebilir olduğunu gösteren dalga formlarını göstermektedir. Ap parametrelerinin analizi kontrol altında, depolarizasyon sırasında ve yıkamadan sonra gösterilir. Depolarizasyon sırasında genlik azalır ve AP süresi önemli ölçüde artar.
Elektrofizyolojik ölçümler sonrasında R15 ve L7 nöronları izole edildi ve QPCR analizleri için RNA'lar hazırlandı. Ambion'dan MessageAmp II aRNA Amplifikasyon Kiti kullanılarak doğrusal bir T7 RNA Polimeraz tahrikli transkripsiyon, RNA'ları tek nöronlardan yükseltmek için kullanıldı. Karşılaştırma için, tanımlanan nöronlar R2 ve L11 ve yetişkin (6-9 aylık) ve genç hayvanlardan (1-2 aylık) tüm abdominal gangliyonlar da çalışıldı. qPCR amplifikasyonu aşağıdaki koşullar altında 7900HT Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sisteminde gerçekleştirildi: 10 dakika için 95 °C, ardından 15 sn için 95 °C 40 döngü, 1 dakika için 60 °C. Deneyde dört biyolojik kopya vardı. Her biyolojik kopyanın qPCR kurulumunda dört teknik çoğaltması vardı. Dört kopyadan CT değerleri ortalama alındı ve her örnekte CREB1'in mutlak ifade düzeyini bulmak için 1/Ct hesaplandı (Şekil 4). Genç ve yetişkin Aplysia gangliyonlarında CREB1 geninin mutlak ekspresyon seviyelerinin tahmini ve tanımlanan dört tek nöronda qPCR ölçümlerinden elde edilen Ct değeri ile izlendi.
Başlangıç mRNA konsantrasyonu hem genç hem de yetişkin abdominal gangliyonlarda aynıydı. Aynı ileri ve ters CREB1 astar seti, hem gangliyon hem de tek nöronların kullanıldığı çalışmalarda tüm qPCR'lerde kullanılmıştır. Ct değerleri genç ve yetişkin abdominal gangliyon arasında çok benzerdir. Benzer şekilde, başlangıç toplam mRNA konsantrasyonlarının düşük olduğu ve iki tur amplifikasyonun cDNA sentezi için iyi miktarda RNA verdiği tek nöronlarda Bt değerleri ölçüldü. CREB1 amplifikasyonunun Bt değerleri, R15 ve L7 nöronlarındaki CREB1 ekspresyonunun karşılaştırılabilir olduğunu, R2 ve L11'in ise L7 veya R15 ile karşılaştırıldığında ifadede önemli farklılıklar gösterdiğini ileri sürmektedir (Öğrencinin T testi, s<0.05) (Şekil 4).
Şekil 1. Gangliyon elektrofizyolojisi için mikroskop aşaması ve perfüzyon sistemi. Perfüzyon sistemi ve aşaması Pleksiglas kullanılarak yapılmıştır ve şeffaftır. Bu kurulum, konumu korumak için metal bir bloğa (gösterilmez) monte edilir. Metal blok, numunelerin alttan aydınlatılabilmesi için tasarlanmıştır. R15 nörondan kaydedilen örnek bir elektrofizyolojik patlama paterni gösterilmiştir.
Şekil 2. Karın gangliyonunun L7 ve R15 nöronlarından eşzamanlı kayıt. (A) L7 ve R15 nöronlarının konumunu gösteren abdominal gangliyon karikatürü (Kandel 2001'den değiştirildi, AAAS'den izin atılmış olarak yeniden basıldı). Ayrıca karın gangliyonunda R2 ve L11 pozisyonları gösterilmiştir. (B) L7 ve R15'ten temsili hücre içi kayıtlar. Ok, Ach uygulamasının zamanını gösterir. Bu ölçümlere 8-10 saat devam edilebilir.
Şekil 3. R15'in eylem potansiyelinde (AP) ach kaynaklı değişiklikler. AP dalga formları Ach maruziyeti öncesinde, sırasında ve sonrasında analiz edildi. Temsili dalga formları gösterilir. ms: milisaniye, mV: milivolt.
Şekil 4. abdominal gangliyonlarda CREB1 ekspresyonunun qPCR analizi ve tek tanımlanmış nöronlar. (A) Aplysia'nıngenç ve yetişkin abdominal gangliyonlarında CREB1 transkriptinin mutlak nicelemesi . Toplam RNA, yöntemlerde açıklandığı gibi standart Trizol protokolü kullanılarak izole edilmiştir. CDNA sentezlemek için 1 μg toplam RNA kullanıldı, ardından CREB1 astarları kullanılarak gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu yapıldı. (B) Creb1 transkriptinin eski Aplysia'nıntanımlanmış tek nöronlarında mutlak nicelemesi . Total RNA, cDNA sentezi öncesinde iki tur in vitro amplifikasyona maruz kaldı. CDNA sentezlemek için 1 μg aRNA kullanıldı, ardından CREB1 astarları kullanılarak gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu yapıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nöron R15 kardiyovasküler, sindirim, solunum ve üreme sistemlerinin düzenlenmesinde rol oynar30. AP'nin düzenli olarak ritmik bir patlama aktivitesi R15'in bir özelliğidir. Sonuçlar bölümünde gösterildiği gibi, R15 ve L7'nin eşleştirilmiş kaydı, gangliyon preparatının R15 nöronlarının aktivitesini koruduğunu göstermektedir. R15 ve L7 nöronları Ach'e uygun şekilde yanıt verdi. Bu gangliyon preparat 8-10 saate kadar sürdürülebilir ve elektrofizyolojik aktivite sürekli olarak izlenebilir. Böylece, kısa nörotransmitter maruziyetinin elektrofizyolojik etkileri (belirli bir nörona veya banyoya lokal olarak maruz kalır) uzun bir süre incelenebilir. Ayrıca, birden fazla nörotransmittere maruz kalmanın (aynı anda veya birlikte) aynı nöron üzerindeki etkilerini, kendisinin veya takipçi nöronun veya her ikisinin ateşleme özellikleri üzerinde inceleyebilme.
qPCR ile gen ekspresyon ölçümlerine bir örnek Şekil 4'te gösterilmiştir. Tek bir nöronun RNA içeriği düşük olduğundan, birden fazla genin nicel ekspresyonu için yeterli miktarda RNA elde etmek için in vitro amplifikasyon gereklidir. Tüp bebek transkripsiyon işlemi için ticari kitler mevcuttur. CREB1 transkriptinin amplifikasyonu, standartlaştırılmış bir floresan sinyali elde etmek için gereken döngü sayısı ile doğrudan ölçüldü, Ct yöntemi31. Tek bir nörondan güçlendirilmiş RNA, mikroarray32 kullanarak çok sayıda gendeki gen ekspresyon değişikliklerini belirlemek için çalışmalar için ve RNAseq analizleri ile tüm transkriptom içinyeterlidir 33.
Bu tekniğin bir sınırlaması, bu preparatın abdominal gangliyonların nöronlarının tüm sinaptik bağlantılarını koruyamayabileceğidir. Nöronların bazıları diğer gangliyonlarda nöronlarla sinaps oluşturur ve gangliyon preparatında bu uzun mesafeli bağlantılar kaçırılacaktır. Bununla birlikte, burada açıklanan metodoloji tüm CNS'yi içerecek şekilde kolayca değiştirilebilir veya solungaç ve sifon çekme refleksinde hücresel ve elektrofizyolojik değişiklikleri incelemek için tanımlanan yarı bozulmamış preparat13,14,16'ya kolayca entegre edilebilir.
Genomik tekniklerdeki son gelişmeler artık kodlama ve kodlamayan RNA'ların ifade dinamikleri hakkında derin bir fikir edinmemizi sağlıyorRNA'lar 34. Burada açıklanan azaltılmış preparat, elektrofizyolojik ölçümlerle birlikte gen ekspresyonunun zamansal değişikliklerini incelemek için idealdir. Örneğin, farmakolojik ajanlar uygulanabilir ve etkilerini aynı sinir devresinin bir parçası olan bireysel nöronların veya birden fazla nöronun elektriksel özellikleri üzerinde ölçebilir ve RNA izolasyonu için farklı zamanlarda bireysel nöronları izole edebilirsiniz. Tek bir nöronun manipülasyonunun (elektriksel stimülasyon veya farmakolojik ajanlara maruz kalma gibi) tanımlanan devrelerin tamamı üzerindeki etkisi, tek nöronlarda belirli genlerin ekspresyasyonundaki değişiklikler düzeyinde incelenebilir. Bu nedenle bu metodoloji, Aplysia'dakisinir devrelerini incelemek için elektrofizyolojik ve genomik metodolojilerin başarılı bir şekilde entegrasyonunu kolaylaştırır.
Bu yaklaşım, sinir sistemleri tanımlanmış birkaç nöron içeren nudibranch yumuşakça Tritonia, gölet salyangozu Lymnaea ve karasal salyangoz Helix gibi diğer omurgasız modellerin çalışmasına kolaycagenişletilebilir. Bu modeller ayrıca kaçış yüzme, manyetik alan yönelimi, sinaps oluşumu, öğrenme ve hafıza depolama gibi davranışların sinir kontrolünün incelenmesi için de yaygın olarak kullanılmaktadır. Tarif ettiğimiz metodoloji, genomik analizin tek hücre düzeyinde nöronal aktivitenin fizyolojik ölçümleriyle basit bir entegrasyonudur. Bu tür çalışmalardan, davranışın nöral kontrolünün moleküler ve fizyolojik temeli hakkında daha derin bir içgörü elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların herhangi bir rakip finansal çıkarları yok.
Acknowledgments
Whitehall Vakfı'na, scripps araştırma enstitüsünden bu çalışmayı yürüttükleri için fon desteği ve başlangıç fonları için içtenlikle teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aplysia | National Aplysia Resource Facility, University of Miami | ||
| NaCl | SIGMA | S 3014-1KG | |
| KCl | SIGMA | P 9333-500G | |
| CaCl2•2H2O | SIGMA | C5080- 500G | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP 214-501 | |
| NaHCO4 | SIGMA | S 6297-250G | |
| HEPES | SIGMA | H 3375-500G | |
| Protease | GIBCO | 17105-042 | |
| Trizol | Ambion | 15596-026 | |
| Chloroform | MP Biomedicals | 2194002 | |
| 100% Ethanol | ACROS | 64-17-5 | |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| 3 M NaOAc, pH 5.5 | Ambion | AM9740 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9737 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion | AM1751 | |
| qScript cDNA SuperMix | Quanta Biosciences | 95048-100 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stainless Steel Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 or | |
| 26002-20 | |||
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | Veriti Thermal Cycler | |
| 5430R Centrifuge | Eppendorf | 5430R Centrifuge | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | 7900HT Fast Real-Time PCR | |
| Amplifier | BRAMP-01R | NPI Electronics | |
| Digidata Converter | Instrutech ITC-18 | HEKA ELEKTRONIK | |
| Micro Manipulator | Patch Star | Scientifica |
References
- Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
- Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
- Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
- Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
- Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
- Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
- Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
- Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
- Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
- McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
- McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
- Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
- Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
- Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
- Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
- Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
- Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
- Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
- Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
- Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
- Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
- Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
- Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
- Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
- Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
- Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
- Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
- Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
- Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
- Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
- Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
- Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
- Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
- Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
- Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
- Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
- Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O'Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
- Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
- Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
- Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
- Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
- Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
- McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
- Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
- Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
- Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
- Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
- Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
- Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
- Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
- Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
- Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).
