Summary
海洋カタツムリ のアプリシアカリフォルニカ は、細胞および分子ベースの行動に関する研究のための神経生物学モデルとして広く使用されている。ここでは、同定された神経回路の単一ニューロンの電気生理学的および分子的分析のための Aplysia の神経系を探索するための方法論が記載されている。
Abstract
神経生物学における大きな課題は、特定の行動を支配する神経回路の分子基盤を理解することです。特定の分子機構が特定されると、変性疾患や神経系の老化によって引き起こされる特定の行動の異常を治療するための新しい治療戦略を開発することができます。海洋カタツムリ のAplysiaカリフォルニカ は、特定の行動の根底にある神経回路を容易に決定することができ、回路の個々の構成要素を容易に操作できるため、細胞および分子ベースの行動の調査に適しています。 Aplysia のこれらの利点は、学習と記憶の神経生物学のいくつかの基本的な発見につながっています。.ここでは、個々のニューロンの電気生理学的および分子的分析のための Aplysia 神経系の調製について説明する。簡単に言えば、神経系から解剖された神経節は、ニューロンが露出されるが、無傷の動物のように神経細胞活動を保持するように神経節鞘を除去するためにプロテアーゼにさらされる。この調製物は、単一または複数のニューロンの電気生理学的測定を行うために使用される。重要なことに、単純な方法論を用いた記録に続いて、ニューロンは遺伝子発現解析のために神経節から直接単離されることができた。これらのプロトコルは、L7およびR15ニューロンからの同時電気生理学的記録を行い、アセチルコリンに対する応答を研究し 、APlysiaの単一の単一のL7、L11、R15、およびR2ニューロンにおけるCREB1遺伝子の定量発現を研究するために使用された。
Introduction
人間の脳は、ほぼ1000億個のニューロンと何兆ものシナプス接続を持つ非常に複雑です。ニューロンと相互作用し、脳内の機能を調節する非神経細胞のほぼ同じ数があります。.ニューロンは、特定の動作を調節する回路に編成されています。脳機能や神経回路の理解が進んでいますが、特定の行動を制御する回路コンポーネントのアイデンティティについてはほとんど知られていません。回路の様々な構成要素のアイデンティティの知識は、細胞と分子の行動の両方の理解を大幅に促進し、神経精神疾患の新しい治療戦略を開発するのに役立ちます。
海洋カタツムリのAplysiaカリフォルニカは、特定の行動の基礎となる神経回路を決定するための主力となっています1-14.Aplysia神経系には、9つの異なる神経節に編成された約20,000個のニューロンが含まれています。Aplysiaのニューロンは大きく、その大きさ、電気的特性、および神経節内の位置に基づいて容易に識別することができる。Aplysiaは、研究することができる行動の豊富なレパートリーを持っています。よく研究された行動の一つは、ギル離脱反射(GWR)です。この反射の中心成分は腹部神経節に位置する。GWR回路のコンポーネントがマッピングされ、さまざまな成分の寄与が決定されました。重要なことに、GWR回路は、自動調整および非関連の学習を受ける5,6,15-19.この反射に関する数十年にわたる研究はまた、学習と記憶20-24において重要な役割を持ついくつかのシグナル伝達経路を同定した。
Aplysiaのいくつかの異なる調製物は、記憶記憶の細胞および分子ベースを研究するために使用された。これらには、無傷の動物2,3、半無傷の調製1,7,13,14,16および神経回路25-29の主要成分の再構成が含まれる。同定された神経回路の電気生理学的および分子的分析のためのAplysia神経節を探索するための還元された準備をここに説明する。次の4つの同定されたニューロンが研究された。R15は、バーストニューロン、L7およびL11、2つの異なる運動ニューロンとR2、コリン作動性ニューロンを研究した。R2は無脊椎動物神経系に記載されている最大のニューロンである。簡単に言えば、この方法論は、神経節のプロテアーゼ治療、薬理学的治療の前後の電気生理学的測定、および遺伝子発現の定量的分析のための単一ニューロンの単一のニューロンの単一の分離を含む。この方法論により、分子解析と複数のニューロンからの同時記録を組み合わせるようになっています。この方法論は、細胞内の記録を組み合わせてアセチルコリン(Ach)に対するR15およびL7ニューロンの応答を研究するために成功して使用されました。電気生理学的測定R15およびL7およびL11およびR2のような他の同定されたニューロンは、CREB1の発現の定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)分析のために単離された、記憶記憶に重要な転写因子である。
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Protocol
1. 腹部神経節の調製、電気生理学的測定、および単一同定ニューロンの単一同定された神経節の分離
- 12:12光:暗い条件下で16 °Cで循環人工海水(ASW)と実験室の水槽で Aplysia を維持します。
- 腹部神経節の隔離。
- 5-10分間(動物の体重の30〜35%に相当)のために380 mM MgCl2 溶液を注入することによって動物を麻酔します。
- 中枢神経系24,28におけるその位置に基づいて腹部神経節を同定する。
- 手術によって神経節を取り除き、450 mM NaCl、10 mM KCl、10 mM CaCl 2、55 mM MgCl2、2.5mM NaHCO3、および10 mM HEPES(pH 7.4)からなる人工海水にすぐに保管します。
- プロテアーゼ処理。
- 上記のASWで0.1%プロテアーゼ(ジスパーゼ)を希釈したペトリ皿で34°C±0.5で30分間腹部神経節をインキュベートする。
注:使用されるプロテアーゼの量は、動物の年齢と体重で標準化する必要があります。一般に、古くて大きな動物は、より多くのプロテアーゼを必要とします。
- 上記のASWで0.1%プロテアーゼ(ジスパーゼ)を希釈したペトリ皿で34°C±0.5で30分間腹部神経節をインキュベートする。
- 神経節鞘の除去。
- 酵素処理後、細胞チャンバーのシルガードシリコーンベース(Ø= 1cm;vol.= 0.3 ml)に神経節を固定し、室温(18°C±2)でASW(流量:150μl/min)をパーフューズします。
注:同定されたニューロンの視認性を高めるために、20Xおよび40X倍率の双眼体顕微鏡を使用して底部から容易に照らすことができるポリカーボネートガラスシリンダー(図1)(直径Ø = 2mm改変細胞室)の上部に神経節を置きます。 - 鉗子とマイクロシザーを使用して、ガングリオンから慎重にシースを取り外します。
- 酵素処理後、細胞チャンバーのシルガードシリコーンベース(Ø= 1cm;vol.= 0.3 ml)に神経節を固定し、室温(18°C±2)でASW(流量:150μl/min)をパーフューズします。
- 2つのニューロンからの同時電気生理学的記録。
- 目的のニューロンを特定します。
- 抵抗10-15 MΩを有する単一の細胞内鋭利な微小電極を有するニューロンを3M KCl溶液で満たした。
- 細胞内記録システムを用いてニューロン活動(10kHzバンドパス)を記録する。
- Axographなどの電気生理学ソフトウェアを使用して記録データを処理します。
注:1つは簡単に複数のニューロンからの記録を行うことができます。ニューロンL7、L11またはR15およびR2は、その位置に基づいて容易に同定される。2 つの L7 および R15 ニューロンから同時に録音するには、2 つのアンプと 2 つのマイクロマニピュレータが必要です (図 2)。
- 薬物適用。
- 穏やかなピペットによって細胞室に選択の薬物を適用するか、ニューロンに直接注入します。
- 電気生理学的測定を行う。
注:実験目的に応じて、膜電位(MP)または作用電位(AP)の変化など、薬物塗布の前後の異なる電気生理学的パラメータを測定することができます。
- 単一ニューロンの分離.
- 電気生理学的実験の終わりに、ASWの灌流を止め、100%エタノールでガングリオンを洗浄する。 エタノールへの暴露はニューロンを石化し、細かい鉗子を使用して、神経節から他のニューロンを損傷することなく、個々のニューロンを除去することが容易になります。
- 単一のニューロンを実体顕微鏡で除去し、氷冷500μl RNA抽出試薬を含む小さなエペンドルフチューブに移します。分離された単一のニューロンは、将来の分析のために-80°CのRNA抽出試薬に保存することができます。
2. 定量的リアルタイムPCR(qPCR)による単一ニューロンからのRNA分離と遺伝子発現解析
- RNA分解を最小限に抑えるための注意事項:
リボヌクレアーゼ(RNases)はRNAを分解し、非常に安定した活性酵素です。RNA の処理中に次の手順を実行します。- RNase非アクティブ化剤で作業領域と器具を清掃します。
- RNAを扱いながら常に手袋を着用し、手袋を頻繁に交換してください。
- RNAを扱うためにRNaseの自由なプラスチックだけを使用してください。
- 単一ニューロンから総RNAを分離する:
- RNA分離のための標準トリゾールプロトコルは、単一のニューロンからRNAを分離するために使用することができます。簡単にトリゾールにクロロホルムの20%v /vを追加し、短い渦によってよく混ぜます。
- 4 °Cで10分間、回転器にチューブを置きます。 トリゾールクロロホルムミックスを12,000 x gで4°Cで15分間回転させます。
- 水相を収集し、新鮮なチューブに転送します。
- 酢酸ナトリウム溶液(pH 5.5)を0.3M、100ng/mlのコ沈降剤グリコブルー、2.5容量の100%エタノールを添加してRNAを沈殿させます。
- サンプルをよく混ぜ、一晩で-80°Cでインキュベートします。
- 4°Cで20分間12,000 x gでサンプルを回転させ、小さな青いペレットがチューブの底に見えます。
- 上清を取り除き、75%の氷冷エタノール850μlでペレットを12,000 x gで4°Cで10分間洗浄します。
- 上清を慎重に取り除き、最大7〜10分間RNAペレットを空気乾燥させます。
注:RNAペレットを乾燥させると可溶化が非常に困難になります- RNAが乾燥するために長い間放置されないようにしてください。 - 乾燥したら、RNAペレットを10μlのRNAAseフリー水で再懸濁し、RNA濃度を決定します。
注:分光光度計を使用してRNA濃度を決定します。すぐに使用しない場合は、-80°CでRNAを保存してください。
- 単一ニューロンからのaRNA合成:
- 市販のリニアRNA増幅システムを用いてRNA(実験目的に応じて1または2ラウンド)を増幅する。
注:単一ニューロンからのRNAの合計は〜10〜60 ngの範囲でした。第1回増幅の期待収量は〜100〜300ngであり、第2の増幅はRNAの〜0.8〜1.5μgである。
- 市販のリニアRNA増幅システムを用いてRNA(実験目的に応じて1または2ラウンド)を増幅する。
- RNAの逆転写:
- aRNAからcDNAを生成するには、逆転写反応の20 μlで1.0 μgのaRNAを使用します。この目的のために、いくつかのキットが市販されています。
注:cDNAはサーマルサイクラーで次の設定を使用して、メーカーのプロトコルに従って合成されました。
25°Cで5分
42°Cで30分
85°Cで5分
4 °Cでホールド - 逆転写ステップの後、cDNAを-20°Cで長期保存のために保管します。
- aRNAからcDNAを生成するには、逆転写反応の20 μlで1.0 μgのaRNAを使用します。この目的のために、いくつかのキットが市販されています。
- プライマー設計と標準化:
リアルタイム増幅のためのプライマーを設計するためのいくつかの優れたソフトウェアプログラムが無料で利用可能です。- 70-110 bpアンプリコンを生成し、市販のソースを使用してプライマーを合成する18-24のマーオリゴヌクレオチドを選択します。
注:2~3個のプライマーペアは、対象遺伝子ごとに設計する必要があります。各プライマー セットは qPCR によって標準化する必要があります。遺伝子 CREB1 (図 4) に使用されたフォワードおよびリバースプライマーのペアは、以下のとおりです。
プライマーセット1
フォワード:5'-TGATCTGACGCAAAAAAGA-3'
リバース:5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
プライマーセット2
フォワード:5'-アグガートクトCGATGAAGAA-3'
リバース:5'-ガカカカガガグタットGCCAAA-3' - 下流解析に使用する最適なプライマーを選択するには、Ct 値と増幅曲線の形状を qPCR で監視します。
注: PCR の指数相の 40 ラウンド増幅と滑らかな曲線の間で Ct (サイクル閾値) 値を 10 ~ 35 の間で与えるプライマーは、遺伝子発現解析に最適です。
- 70-110 bpアンプリコンを生成し、市販のソースを使用してプライマーを合成する18-24のマーオリゴヌクレオチドを選択します。
- 定量リアルタイム PCR (qPCR):
注: qPCR マシンと互換性のある適切なチューブまたはプレートを使用してください。- ヌクレアーゼフリー水でcDNAを5倍に希釈します。
- 希釈したcDNAを2μlに、2μlのH2Oを含むqPCRマスターミックスを8μl、2x SYBRグリーンマスターミックスの5μl、1.0 μlの10 μM(それぞれ)前方および逆プライマーを加えます。
- cDNAとマスターミックスをピペットした後、チューブを閉じてプレートを密封します。1,500 rpmで30秒間、穏やかなタップとスピンダウンで内容を混ぜます。
- qPCR マシンのセットアップに進みます。
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Representative Results
この研究で使用された動物の重量は100〜200gの範囲であった。記載されたプロトコルに従い、2-5gから200〜300gの範囲の動物から分離された腹部神経節のニューロンの電気生理学的測定および分子解析を行った。
プロテアーゼ処理の標準化は、神経節におけるニューロンの電気生理学的測定を成功させるために重要である。当初、複数のプロテアーゼ(Dispase)濃度および持続時間が使用され、R15ニューロンからのバースト作用電位が26,31を記録した。これらの測定値を、インタクトガンリアからの直接(プロテアーゼ処理なし)記録と比較した。プロテアーゼの濃度(0.1%プロテアーゼ、ステップ1.3参照)は、その後の実験で使用されたプロテアーゼを用いずに、露出した神経節から得られたものと同等のバースト電位を生成した。
記載されたプロトコルを用いて、R15へのAch曝露に応答したアクション電位(AP)、コリン作動性ニューロンおよびL7、Achに反応しない運動ニューロンが記録された。予想通り、同時電気生理学的記録は、AchがR15で脱分極を誘導するのに対し、L7の焼成に変化が生じなかったことを示している。 図2 は、細胞室へのアセチルコリン(Ach)の直接の適用を示す。1 M Ach(容積0.3 μl)を直接マイクロピペットを使用してチャンバ内に塗布し、チャンバー内で最終的な1mM濃度を得る。
痛いは、灌流によって浴から洗い流され、R15ニューロンから再び記録された。 図3 は、Ach効果が可逆的であることを示唆する波形を示す。制御中のパラメータAPの分析、脱分極中及び洗浄後の解析が示されている。脱分極の間振幅が減少し、APの持続時間が著しく増加した。
電気生理学的測定の後、R15およびL7ニューロンを単離し、RNAをqPCR分析のために調製した。アンビオンからのMessageAmp II aRNA増幅キットを用いたリニアT7 RNAポリメラーゼ-駆動転写を用いて、単一ニューロンからRNAを増幅するために使用されました。比較のために、同定されたニューロンR2およびL11および成人(生後6〜9ヶ月)および若年動物(1〜2ヶ月)からの腹部神経節全体も研究された。qPCR増幅は、7900HT高速リアルタイムPCRシステムで行った:10分間95°C、15秒の95°Cの40サイクル、1分間60°Cの後に行った。実験には4つの生物学的複製があった。各生物学的複製は、qPCR セットアップで 4 つの技術的複製を持っていました。4つの反復からのCt値を平均化し、各サンプル中のCREB1の絶対発現レベルを求めるために1/Ctを計算した(図4)。若年および成人 のAplysia 神経節におけるCREB1遺伝子の絶対発現レベルの推定と、そして4つの同定された単一ニューロンにおいて、qPCR測定から得られたCt値によってモニタリングされた。
開始mRNA濃度は、若年および成人腹部神経節の両方で同じであった。同じ前方および逆CREB1プライマーセットは、神経節および単一ニューロンを使用した研究の両方で、すべてのqPCRで使用されました。Ct値は、若年と成人の腹部神経節の間で非常に類似しています。同様に、Ct値は、開始総mRNA濃度が低く、2ラウンドの増幅がcDNA合成のための良好な量のRNAをもたらした単一ニューロンの場合に測定した。CREB1増幅のCt値は、R15およびL7ニューロンにおけるCREB1発現が同等であるのに対し、R2およびL11はL7またはR15(スチューデントTテスト、p<0.05)と比較して発現に有意な差を示したことを示唆した(図4)。
図 1.神経節電気生理学のための顕微鏡ステージと灌流システム。灌流システムおよび段階はプレキシグラスを使用して作られ、透明である。このセットアップは、位置を保持するために(図示せず)金属ブロックに取り付けられています。金属ブロックはサンプルが底から照らされるように設計されている。R15ニューロンから記録されたサンプル電気生理学的破裂パターンが示されている。
図 2.腹腔神経節のL7とR15ニューロンからの同時記録。()L7およびR15ニューロンの位置を示す腹部神経節の漫画(Kandel 2001から改変され、AAASの許可を得て転載)。また、腹部神経節におけるR2およびL11の位置も示される。(B)L7およびR15からの代表的な細胞内記録。矢印は、Achアプリケーションの時間を示します。1つは、8〜10時間、これらの測定値を継続することができます。
図 3.アッハはR15の作用電位(AP)の変化を誘発した。AP波形は、Ach露光の前、中、および後に分析された。代表的な波形が表示されます。ms: ミリ秒, mV: ミリボルト.
図 4.腹部神経節および単一同定ニューロンにおけるCREB1の発現のqPCR分析(A) APlysiaの若年および成人腹部神経節におけるCREB1転写物の絶対定量化。全RNAは、方法に記載されているように標準的なトリゾールプロトコルを用いて単離した。総RNAの1 μgを使用してcDNAを合成し、続いてCREB1プライマーを用いたリアルタイムPCR増幅を行った。(B) 古いAplysiaの同定された単一ニューロンにおける CREB1 転写産物の絶対定量化 。総RNAは、cDNA合成の前に2ラウンドのインビトロ増幅を行った。1 μgのaRNAを使用してcDNAを合成し、続いてCREB1プライマーを用いたリアルタイムPCR増幅を行った。
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Discussion
ニューロンR15は、心血管、消化器、呼吸器、および生殖システム30の調節に関与している。AP の定期的なリズミカルなバースト活動は、R15 の機能です。結果セクションに示すように、R15とL7の対の記録は、神経節調製がR15ニューロンの活性を保持していることを示す。R15およびL7ニューロンはAchに適切に反応した。この神経節製剤は8〜10時間まで維持することができ、電気生理学的活性を継続的に監視することができた。したがって、短い神経伝達物質暴露(特定のニューロンまたはお風呂に局所的に曝露される)の電気生理学的効果を長期間研究することができた。さらに, 1 つは、複数の神経伝達物質への暴露の効果を研究することができます (同時にまたは並行して) 自分自身またはフォロワーニューロンまたはその両方の発火特性に同じニューロンに.
qPCRによる遺伝子発現測定の例を 図4に示す。単一ニューロンのRNA含有量が低いため、 インビトロ 増幅は、複数の遺伝子の発現を定量するために十分な量のRNAを得る必要がある。市販キットは、 インビトロ 転写プロセスに使用できます。CREB1転写物の増幅は、標準化された蛍光シグナルを得るために必要なサイクル数によって直接定量した、Ct方法31。単一ニューロンからの増幅されたRNAは、マイクロアレイ32 を用いた多数の遺伝子の遺伝子発現変化を決定する研究と、RNAseq分析33による全転写物に対する研究に十分である。
この技術の制限は、この調製は腹部神経節のニューロンのすべてのシナプス接続を維持しないかもしれないということです.ニューロンのいくつかは、他の神経節のニューロンとシナプスを形成し、神経節の準備では、これらの長距離接続が見逃されます。しかし、ここで説明する方法論は、CNS全体を含むように容易に変更することができ、または、ギルおよびサイフォン離脱反射の細胞および電気生理学的変化を研究するために記載された半無傷調製物13,14,16 に容易に統合することができる。
ゲノミクス技術の最近の進歩は、我々はコーディングおよび非コーディングRNA34の発現のダイナミクスに深い洞察を得ることを可能にする。ここで説明する還元製剤は、電気生理学的測定と組み合わせて遺伝子発現の時間的変化を研究するのに理想的です。例えば、薬理学的薬剤を適用し、同じ神経回路の一部である個々のニューロンまたは複数のニューロンの電気特性に対する影響を測定し、RNA分離のために異なる時間に個々のニューロンを分離することができます。特定された回路全体に対する単一のニューロン(電気刺激、薬理学的薬剤への暴露など)の操作の効果は、単一ニューロンにおける特定の遺伝子の発現変化のレベルで研究することができる。したがって、この方法論は、電気生理学的およびゲノム的方法論の統合を促進し 、Aplysiaで神経回路を研究する。
このアプローチは、ニューディブランチ軟体動物トリトニア、池カタツムリナエア、および神経系がいくつかの同定されたニューロン35-57を含む陸生カタツムリヘリックスなどの他の無脊椎動物モデルの研究に容易に拡張することができる。これらのモデルは、遊泳、磁場の向き、シナプス形成、学習、記憶記憶などの行動の神経制御の研究のために広く使用されています。我々が述べた方法論は、単一細胞レベルでの神経活動の生理学的測定とゲノミクス分析の単純な統合である。このような研究から、神経行動制御の分子および生理学的基礎に関するより深い洞察を得ることができる。
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Disclosures
著者は、競合する財政的利益を持っていません。
Acknowledgments
ホワイトホール財団は、この作業を行ったスクリプス研究所からの資金援助とスタートアップ資金に心から感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aplysia | National Aplysia Resource Facility, University of Miami | ||
| NaCl | SIGMA | S 3014-1KG | |
| KCl | SIGMA | P 9333-500G | |
| CaCl2•2H2O | SIGMA | C5080- 500G | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP 214-501 | |
| NaHCO4 | SIGMA | S 6297-250G | |
| HEPES | SIGMA | H 3375-500G | |
| Protease | GIBCO | 17105-042 | |
| Trizol | Ambion | 15596-026 | |
| Chloroform | MP Biomedicals | 2194002 | |
| 100% Ethanol | ACROS | 64-17-5 | |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| 3 M NaOAc, pH 5.5 | Ambion | AM9740 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9737 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion | AM1751 | |
| qScript cDNA SuperMix | Quanta Biosciences | 95048-100 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stainless Steel Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 or | |
| 26002-20 | |||
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | Veriti Thermal Cycler | |
| 5430R Centrifuge | Eppendorf | 5430R Centrifuge | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | 7900HT Fast Real-Time PCR | |
| Amplifier | BRAMP-01R | NPI Electronics | |
| Digidata Converter | Instrutech ITC-18 | HEKA ELEKTRONIK | |
| Micro Manipulator | Patch Star | Scientifica |
References
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