Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

אקליפסיה (1991) הכנת גנגליה לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים

Published: January 13, 2014 doi: 10.3791/51075
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, Florida

Summary

חילזון ימי Aplysia californica כבר בשימוש נרחב כמודל נוירוביולוגיה למחקרים על בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות. כאן מתוארת מתודולוגיה לחקר מערכת העצבים של Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים של מעגלים עצביים מזוהים.

Abstract

אתגר מרכזי בנוירוביולוגיה הוא להבין את היסודות המולקולריים של מעגלים עצביים השולטים בהתנהגות מסוימת. לאחר זיהוי המנגנונים המולקולריים הספציפיים, ניתן לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול במומים בהתנהגויות ספציפיות הנגרמות על ידי מחלות ניווניות או הזדקנות מערכת העצבים. חילזון ימי Aplysia californica מתאים היטב לחקירות של בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות כי מעגלים עצביים שבבסיס התנהגות מסוימת ניתן לקבוע בקלות את המרכיבים הבודדים של המעגלים יכולים להיות מניפולציה בקלות. יתרונות אלה של Aplysia הובילו למספר תגליות בסיסיות של נוירוביולוגיה של למידה וזיכרון. כאן אנו מתארים הכנה של מערכת העצבים Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים. בקצרה, גנגליון מנותח ממערכת העצבים נחשף פרוטאז כדי להסיר את נדן גנגליון כך נוירונים נחשפים אבל לשמור על פעילות עצבית כמו החיה שלם. הכנה זו משמשת לביצוע מדידות אלקטרופיזיולוגיות של נוירונים בודדים או מרובים. חשוב לציין, בעקבות ההקלטה באמצעות מתודולוגיה פשוטה, הנוירונים יכולים להיות מבודדים ישירות מן הגרעינים לניתוח ביטוי גנים. פרוטוקולים אלה שימשו לביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בו זמנית של נוירונים L7 ו- R15, ללמוד את תגובתם אצטילכולין וביטוי כמותי של גן CREB1 מבודד יחיד L7, L11, R15, ו R2 נוירונים של Aplysia.

Introduction

המוח האנושי מורכב בצורה יוצאת דופן עם כמעט 100 מיליארד נוירונים וטריליוני קשרים סינפטיים. ישנם מספר כמעט שווה של תאים nonneuronal כי אינטראקציה עם נוירונים לווסת את תפקידם במוח. נוירונים מאורגנים במעגלים המווסתים התנהגויות ספציפיות. למרות ההתקדמות בהבנתנו את תפקודי המוח והמעגלים העצביים, מעט מאוד ידוע על זהותם של מרכיבי מעגלים השולטים בהתנהגות מסוימת. ידע בזהויות של מרכיבים שונים של מעגלים יקל מאוד על הבנתנו הן של הבסיס התאי והן של הבסיס המולקולרי של התנהגות וסיוע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות להפרעות נוירופסיכיאטריות.

חילזון ימי Aplysia californica כבר סוס עבודה לקביעת מעגלים עצביים ביסוד התנהגויות ספציפיות1-14. מערכת העצבים Aplysia מכיל כ 20,000 נוירונים המאורגנים לתוך 9 גרעינים שונים. הנוירונים של Aplysia הם גדולים וניתן לזהות בקלות על סמך גודלם, תכונות חשמליות, ואת המיקום הגרעיני. Aplysia יש רפרטואר עשיר של התנהגויות שניתן ללמוד. אחת ההתנהגויות הנחקרות היטב היא רפלקס משיכת הזימים (GWR). המרכיבים העיקריים של רפלקס זה ממוקמים גרעיני בטן. רכיבים של מעגלי GWR מופו ותרומות של רכיבים שונים נקבעו. חשוב לציין, מעגלי GWR עוברים למידה אסוציאטיבית ולא אסוציאטיבית5,6,15-19. עשרות שנים של מחקר על רפלקס זה זיהו גם כמה מסלולי איתות שיש להם תפקיד מפתח בלמידה וזיכרון20-24.

מספר תכשירים שונים של Aplysia שימשו כדי ללמוד בסיס תאי ומולקולרי של אחסון זיכרון. אלה כוללים את החיה שלם2,3, הכנה שלם למחצה1,7,13,14,16 ו reconstitution של מרכיבים עיקריים של מעגלים עצביים25-29. הכנה מופחתת לחקר הגרעינים Aplysia עבור ניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של מעגלים עצביים מזוהים מתואר כאן. ארבעת הנוירונים הבאים שזוהו נחקרו. R15, נוירון מתפרץ, L7 ו L11, שני נוירונים מוטוריים שונים R2, נוירון שימוש נחקרו. R2 הוא הנוירון הגדול ביותר המתואר במערכת העצבים חסרי החוליות. בקצרה, מתודולוגיה זו כוללת טיפול פרוטאז של גרעינים, מדידות אלקטרופיזיולוגיות לפני ואחרי טיפולים תרופתיים, ובידוד של נוירונים בודדים לניתוח כמותי של ביטוי גנים. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו לשלב ניתוחים מולקולריים עם הקלטה בו זמנית של נוירונים מרובים. מתודולוגיה זו שימשה בהצלחה כדי ללמוד את התגובות של נוירונים R15 ו L7 אצטילכולין (Ach) על ידי זיווג הקלטות תאיים. בעקבות מדידות אלקטרופיזיולוגיות R15 ו- L7 ותאי עצב מזוהים אחרים כגון L11 ו- R2 בודדו לניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) של ביטוי CREB1, גורם שעתוק חשוב לאחסון זיכרון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת גנגליה בטן, מדידות אלקטרופיזיולוגיות, ובידוד של נוירונים בודדים שזוהו מגנגליון הבטן של Aplysia californica

  1. שמור על Aplysia באקווריום המעבדה עם מי ים מלאכותיים במחזור (ASW) ב 16 °C (60 °F) תחת 12:12 אור:תנאים כהים.
  2. בידוד של גנגליון בטן.
    1. הרדמה בעלי חיים על ידי הזרקת 380 mM MgCl2 פתרון במשך 5-10 דקות (שווה ערך 30-35% ממשקל הגוף של החיה).
    2. זהה את גנגליון הבטן בהתבסס על מיקומו במערכת העצבים המרכזית24,28.
    3. הסר את הגרעינים על ידי פעולה כירורגית ולאחסן מיד במי ים מלאכותיים המורכבים 450 מ"מ NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2.5 מ"מ NaHCO3, ו 10 mM HEPES (pH 7.4).
  3. טיפול פרוטאז.
    1. דגירה גנגליון בטן במשך 30 דקות ב 34 °C±0.5 בצלחת פטרי עם 0.1% פרוטאז (dispase) מדולל ASW המתואר לעיל.
      הערה: כמות הפרוטאז המשמש צריך להיות סטנדרטי עם הגיל והמשקל של בעלי החיים. באופן כללי, בעלי חיים מבוגרים וגדולים יותר ידרשו יותר פרוטאז.
  4. הסרת נדן גרעיני.
    1. לאחר הטיפול באנזים, הצמד את הגרעינים לבסיס סיליקון סילגרד של תא תא (Ø = 1 ס"מ; vol. = 0.3 מיליליטר) ולחלחל עם ASW (קצב זרימה: 150 μl / min) בטמפרטורת החדר (18 °C (18 °F±2).
      הערה: על מנת להגביר את הראות של נוירונים מזוהים, הנח את הגנגליון על החלק העליון של גליל זכוכית פוליקרבונט (איור 1) (קוטר Ø = תא תא שונה 2 מ"מ) שניתן להאיר בקלות מלמטה באמצעות סטריאומיקרוסקופ משקפת עם הגדלה של פי 20 ו- 40.
    2. הסר בזהירות את הנדן מהגנגליון באמצעות מלקחיים ומיקרוסיסורים.
  5. הקלטה אלקטרופיזיולוגית בו זמנית משני נוירונים.
    1. לזהות נוירון של עניין.
    2. לשפד את הנוירון עם מיקרואלקטרודה חדה תאית אחת עם התנגדות 10-15 MΩ מלא פתרון 3 M KCl.
    3. הקלט פעילות עצבית (מעבר רצועה של 10 kHz) באמצעות מערכת הקלטה תאית.
    4. עבד את נתוני ההקלטה באמצעות תוכנת אלקטרופיזיולוגיה כגון אקסוגרף.
      הערה: ניתן לבצע בקלות הקלטה מתאי עצב מרובים. נוירונים L7, L11 או R15 ו R2 מזוהים בקלות על סמך מיקומם. שני מגברים ושני מיקרו-מניפולטורים נדרשים להקלטה בו זמנית משני נוירונים L7 ו-R15(איור 2).
  6. יישום סמים.
    1. החל תרופה של בחירה לתוך תא התא על ידי pipetting עדין או להזריק ישירות לתוך נוירונים.
    2. בצע מדידות אלקטרופיזיולוגיות.
      הערה: בהתאם למטרה הניסיונית, ניתן למדוד פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים שונים של נוירונים כגון השינויים בפוטנציאל הממברנה (MP) או פוטנציאל הפעולה (AP) לפני, במהלך ואחרי יישום התרופה.
  7. בידוד של נוירונים בודדים.
    1. בסיום הניסויים האלקטרופיזיולוגיים, לעצור את הזחילה של ASW ולשטוף את הגנגליון עם 100% אתנול.  חשיפה לאתנול תפחיד את הנוירונים, ובאמצעות מלקחיים עדינים, תקל על הסרת נוירונים בודדים מבלי לפגוע בנוירונים אחרים מהגנגליון.
    2. הסר נוירונים בודדים תחת סטריאומיקרוסקופ ולהעביר צינור קטן Eppendorf המכיל קר כקרח 500 μl מיצוי RNA מגיב. נוירונים בודדים מבודדים ניתן לאחסן ריאגנט מיצוי RNA ב -80 מעלות צלזיוס לניתוח עתידי.

2. בידוד RNA מתאי עצב בודדים וניתוח ביטוי גנים על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qPCR)

  1. אמצעי זהירות כדי למזער את השפלת RNA:
    ריבונוקלאאזות (RNases) משפילות RNA והן אנזימים יציבים ופעילים מאוד. בצע את השלבים הבאים במהלך הטיפול ב- RNAs.
    1. נקה את אזור העבודה ואת המכשירים עם סוכני השבתת RNase.
    2. ללבוש כפפות בכל עת בעת טיפול RNA ולהחליף כפפות לעתים קרובות.
    3. השתמש רק בפלסטיק ללא RNase לטיפול ב- RNAs.
  2. בידוד סה"כ RNA מתאי עצב בודדים:
    1. פרוטוקול טריזול סטנדרטי לבידוד RNA יכול לשמש לבידוד RNAs מתאי עצב בודדים. בקצרה להוסיף 20% v / v של כלורופורם כדי Trizol, לערבב היטב על ידי מערבולת קצרה.
    2. מניחים את הצינורות על מסובב במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. סובבו את תערובת טריזול-כלורופורם ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. לאסוף את השלב מימית ולהעביר צינור טרי.
    4. הוסף פתרון אצטט נתרן (pH 5.5) לריכוז הסופי של 0.3 M, 100 ng/ml של גליקובלו coprecipitant, ו 2.5 כרכים של 100% אתנול כדי לזרז RNA.
    5. מערבבים היטב את הדגימות ומדגירה ב -80 מעלות צלזיוס לילה.
    6. סובב את הדגימות ב 12,000 x g במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס גלולה כחולה קטנה יהיה גלוי בתחתית הצינור.
    7. הסר את supernatant ולשטוף את גלולה עם 850 μl של 75% אתנול קר כקרח ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    8. הסר את supernatant בזהירות אוויר לייבש את גלולת RNA במשך 7-10 דקות, מקסימום.
      הערה: ודא כי RNA לא נשאר זמן רב להתייבש כמו מעל-ייבוש גלולה RNA עושה solubilization קשה מאוד.
    9. לאחר התייבשות, resuspend גלולת RNA ב 10 μl של מים RNAse חינם ולקבוע ריכוז RNA.
      הערה: לקבוע ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. כאשר לא משתמשים מיד, לאחסן RNA ב -80 מעלות צלזיוס.
  3. סינתזת ארנ"א מתאי עצב בודדים:
    1. הגבר את ה-RNA (סיבוב אחד או שניים בהתאם למטרה הניסיונית) באמצעות מערכת הגברה ליניארית RNA זמינה מסחרית.
      הערה: סך ה-RNA של נוירונים בודדים נע בין ~ 10-60 ng. התשואה הצפויה של הסיבוב הראשון של הגברה היא ~ 100-300 ng ואת הסיבוב השני של הגברה הוא ~ 0.8-1.5 מיקרוגרם של RNA.
  4. שעתוק הפוך של RNA:
    1. כדי ליצור cDNA מ- aRNA, השתמש 1.0 מיקרוגרם של aRNA ב 20 μl של תגובת שעתוק הפוכה. מספר ערכות זמינות מסחרית למטרה זו.

      הערה: cDNA סונתז על פי פרוטוקול היצרן באמצעות ההגדרות הבאות על מחזור תרמי.
      5 דקות ב 25 מעלות צלזיוס
      30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס
      5 דקות ב 85 מעלות צלזיוס
      להחזיק ב 4 °C (69 °F)
    2. לאחר שלב התמלול ההפוך, אחסן את ה- cDNA ב- -20 °C (70 °F) לאחסון לטווח ארוך.
  5. עיצוב ותקינה של פריימר:
    מספר תוכנות מצוינות זמינות, ללא תשלום, עבור עיצוב פריימרים עבור הגברות בזמן אמת.
    1. בחר 18-24 מר אוליגונוקלאוטידים המייצרים 70-110 bp amplicons ולסנתז את פריימרים באמצעות מקורות מסחריים.
      הערה: שניים עד שלושה זוגות פריימר צריך להיות מתוכנן עבור כל גן של עניין. כל ערכת פריימר צריכה להיות מתוקננת לפי qPCR. זוגות פריימר קדימה והפוך ששימשו עבור הגן CREB1 (איור 4) הם להלן:

      ערכת פריימר 1
      קדימה: 5'-TGATTCTGACGAAGAAAAGA-3'
      הפוך: 5'-ACCGGAGACAGTCAGTTGTAGA-3'
      ערכת פריימר 2
      קדימה: 5'-אגאטגאטגאטגאגאגהאגה-3'

      הפוך: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'
    2. כדי לבחור את פריימר הטוב ביותר שישמש לניתוחים במורד הזרם, לפקח על ערך Ct ואת הצורה של עקומת הגברה ב qPCR.
      הערה: פריימרים המעניקים ערכי Ct (סף מחזור) בין 10-35 בהגברה העגולה 40 ועקומות חלקות במהלך השלב המעריכי של PCR ואחריו רמה חלקה הם אופטימליים לניתוח ביטוי גנים.
  6. PCR כמותי בזמן אמת (qPCR):
    הערה: השתמש בצינורות או בלוחות המתאימים התואמים למכונת qPCR.
    1. לדלל cDNA ל 5x עם מים ללא גרעין.
    2. כדי 2 μl של cDNA מדולל, להוסיף 8 μl של תערובת הורים qPCR המכיל 2 μl של H2O, 5 μl של 2x SYBR גרין מאסטר לערבב, ו 1.0 μl של 10 מיקרומטר (כל) פריימר קדימה והפוך.
    3. סגור את הצינורות ולאטום את הצלחת לאחר pipetting cDNA ותערובת הורים. ערבבו את התוכן על ידי הקשה עדינה וסיבוב כלפי מטה במהירות של 1,500 סל"ד למשך 30 שניות.
    4. המשך בהגדרת מחשב ה- qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

משקלם של בעלי החיים ששימשו במחקר זה נע בין 100-200 גרם. בעקבות הפרוטוקולים המתוארים, ערכנו מדידות אלקטרופיזיולוגיות וניתוח מולקולרי של נוירונים של גרעיני בטן מבודדים מבעלי חיים הנעים בין 2-5 גרם ל -200-300 גרם.

סטנדרטיזציה של טיפול פרוטאז חשוב למדידות אלקטרופיזיולוגיות מוצלחות של נוירונים בגרעינים. בתחילה, ריכוזים מרובים פרוטאז (Dispase) משכי זמן שימשו פוטנציאל פעולה מתפרץ מ R15 נוירון נרשמו26,31. מדידות אלה הושוו להקלטה ישירה (ללא טיפול פרוטאז) מהגרעונים שלמים. ריכוז הפרוטאז (0.1% פרוטאז, ראו שלב 1.3) שיצר פוטנציאל מתפרץ שהיה דומה לאלה שהתקבלו מגנגליון חשוף ללא פרוטאז שימשו בניסויים הבאים.

באמצעות הפרוטוקול המתואר, פוטנציאל פעולה (AP) בתגובה לחשיפה Ach R15, נוירון שימוש L7, נוירון מוטורי שאינו מגיב Ach נרשמו. כצפוי, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בו זמנית מראות כי Ach לגרום depolarization ב R15 ואילו לא היה שינוי בירי של L7. איור 2 מציג את היישום של אצטילכולין (Ach) ישירות לתוך תא התא. 1 M Ach (נפח 0.3 μl) הוחל ישירות לתוך התא באמצעות micropipette על מנת להשיג ריכוז סופי 1 מ"מ בתוך התא.

Ach נשטף מהאמבטיה על ידי זלוף ונרשם שוב מתאי עצב R15. איור 3 מציג צורות גל המצביעות על כך שאפקט Ach הפיך. ניתוח הפרמטרים AP בשליטה, במהלך depolarization ואחרי לשטוף מוצג. במהלך דפולריזציה משרעת הוא ירד ומשך AP גדל באופן משמעותי.

בעקבות מדידות אלקטרופיזיולוגיות, נוירונים R15 ו- L7 היו מבודדים ו- RNAs הוכנו לניתוחי qPCR. פולימראז T7 RNA ליניארי – שעתוק מונע באמצעות ערכת הגברה של MessageAmp II aRNA מ- Ambion שימש להגברת RNAs מתאי עצב בודדים. לשם השוואה, נוירונים מזוהים R2 ו L11 ואת כל הגרעינים הבטן ממבוגר (6-9 חודשים) ובעלי חיים צעירים (1-2 חודשים) נחקרו גם. הגברה qPCR בוצעו במערכת PCR מהירה בזמן אמת 7900HT בתנאים הבאים: 95 °C (75 °F) במשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 95 °C (65 °F) במשך 15 שניות, 60 °C (60 °F) במשך 1 דקות. היו ארבעה משכפלים ביולוגיים בניסוי. לכל שכפול ביולוגי היו ארבעה משכפלים טכניים בהגדרת qPCR. ערכי Ct מארבעה שכפולים היו ממוצעים ו- 1/Ct חושב כדי למצוא את רמת הביטוי המוחלטת של CREB1 בכל מדגם (איור 4). הערכה של רמות הביטוי המוחלטות של גן CREB1 בגרמיות Aplysia צעירות ובוגרות, ובארבעה נוירונים בודדים שזוהו נוטרה על ידי ערך ה- Ct המתקבל ממדידות qPCR.

ריכוז ה-mRNA ההתחלתי היה זהה בגנונים צעירים ובוגרים כאחד. אותה ערכת פריימרים של CREB1 קדימה והפוך שימשו בכל qPCRs, הן במחקרים באמצעות גרעינים והן בנוירונים בודדים. ערכי ה-Ct דומים מאוד בין גרעיני בטן צעירים למבוגרים. באופן דומה, ערכי Ct נמדדו במקרה של נוירונים בודדים שבהם ריכוזי ה- mRNA הכוללים ההתחלתיים היו נמוכים ושני סבבי הגברה הניבו כמות טובה של RNAs לסינתזת cDNA. ערכי ה- Ct של הגברה CREB1 הראו כי ביטוי CREB1 בנוירונים R15 ו- L7 דומים ואילו R2 ו- L11 הראו הבדלים משמעותיים בביטוי בהשוואה ל- L7 או R15 (מבחן T של סטודנט, p<0.05) (איור 4).

Figure 1
איור 1. שלב מיקרוסקופ ומערכת זלוף לאלקטרופיזיולוגיה גרעינית. מערכת זלוף ושלב נעשו באמצעות פרספקס והם שקופים. התקנה זו נטענת על בלוק מתכת (לא מוצג) כדי להחזיק מיקום. בלוק המתכת מתוכנן כך שניתן להאיר דגימות מלמטה. דוגמה דפוס פיצוץ אלקטרופיזיולוגי נרשם נוירון R15 מוצג.

Figure 2
איור 2. הקלטה בו זמנית מ L7 ו R15 נוירון של גרעיני בטן. ( A )קריקטורהשל גרעיני בטן המציגים את המיקום של נוירונים L7 ו- R15 (שונה מקנדל 2001, הודפס מחדש באישור AAAS). כמו כן מוצגים התנוחות של R2 ו- L11 בג הגרעינים הבטן. (ב)הקלטות תאיות מייצגות מ-L7 ו-R15. החץ מציין את השעה של יישום Ach. אפשר להמשיך את המדידות האלה במשך 8-10 שעות.

Figure 3
איור 3. Ach גרם לשינויים בפוטנציאל הפעולה (AP) של R15. צורות גל AP נותחו לפני, במהלך ואחרי החשיפה Ach. צורות גל מייצגות מוצגות. ms: אלפית השנייה, mV: מילי וולט.

Figure 4

איור 4. qPCR ניתוח של ביטוי של CREB1 גרעיני בטן נוירונים בודדים מזוהים. (A)כימות מוחלט של תעתיק CREB1 בג הגרעינים הבטן הצעירים והמבוגרים של Aplysia. סה"כ RNA בודד באמצעות פרוטוקול Trizol סטנדרטי כמתואר בשיטות. 1 מיקרוגרם של RNA הכולל שימש לסנתז cDNA, ואחריו הגברה PCR בזמן אמת באמצעות פריימרים CREB1. (B)כימות מוחלט של תעתיק CREB1 בנוירונים בודדים שזוהו של Aplysiaהישן . סה"כ RNA היה נתון לשני סבבים של הגברה במבחנה לפני סינתזת cDNA. 1 מיקרוגרם של aRNA שימש לסנתז cDNA, ואחריו הגברה PCR בזמן אמת באמצעות פריימרים CREB1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הנוירון R15 מעורב בוויסות מערכות לב וכלי דם, עיכול, נשימה ורבייה30. פעילות מתפוצצת קצבית באופן קבוע של AP היא תכונה של R15. כפי שמוצג בסעיף התוצאות, הקלטה מזווגת של R15 ו- L7 מראה כי הכנת הגרעינים שמרה על פעילות של נוירונים R15. נוירונים R15 ו- L7 הגיבו כראוי לאח. הכנה גרעינית זו יכולה להישמר עד 8-10 שעות ופעילות אלקטרופיזיולוגית יכולה להיות במעקב רציף. לכן, אפשר לחקור את ההשפעות האלקטרופיזיולוגיות של חשיפה נוירוטרנסמיטר קצר (נחשף באופן מקומי לנוירון מסוים או לאמבטיה) במשך תקופה ארוכה של זמן. יתר על כן, אפשר לחקור את ההשפעות של חשיפה נוירוטרנסמיטורים מרובים (בו זמנית או במשולב) על אותו נוירון על תכונות ירי של עצמו או נוירון חסיד או שניהם.

דוגמה למדידות ביטוי גנים לפי qPCR מוצגת באיור 4. מאז התוכן RNA של נוירון יחיד הוא נמוך, הגברה במבחנה יש צורך להשיג כמות מספקת של RNA עבור ביטוי כמותי של גנים מרובים. ערכות מסחריות זמינות עבור תהליך שעתוק במבחנה. ההגברה של תעתיק CREB1 כומתה ישירות על ידי מספר המחזורים הדרושים להשגת אות פלואורסצנטי מתוקננת, Ct-method31. RNA מוגברת של נוירון יחיד מספיק למחקרים כדי לקבוע שינויים ביטוי גנים במספר רב של גנים באמצעות microarray32 ועל התמלול כולו על ידי ניתוחים RNAseq33.

מגבלה של טכניקה זו היא כי הכנה זו לא יכול לשמר את כל הקשרים הסינפטיים של הנוירונים של הגרעינים הבטן. כמה נוירונים טופס סינפסות עם נוירונים גרעינים אחרים ובהכנת הגרעינים אלה קשרים למרחקים ארוכים יחסרו. עם זאת, המתודולוגיה המתוארת כאן ניתן לשנות בקלות כדי לכלול את מערכת העצבים המרכזית כולה או יכול להיות משולב בקלות הכנה שלם למחצה13,14,16 שתואר לחקור שינויים הסלולר electrophysiological רפלקס נסיגה גיל ו siphon.

ההתקדמות האחרונה בטכניקות גנומיות מאפשרת לנו כעת לקבל תובנה עמוקה על הדינמיקה של ביטוי של קידוד ו- RNAs34ללא קידוד . ההכנה המופחתת המתוארת כאן היא אידיאלית לחקר שינויים זמניים של ביטוי גנים בשילוב עם מדידות אלקטרופיזיולוגיות. לדוגמה, ניתן ליישם סוכנים תרופתיים ולמדוד את השפעתם על תכונות חשמליות של נוירונים בודדים או נוירונים מרובים שהם חלק מאותם מעגלים עצביים ולבודד נוירונים בודדים בזמנים שונים לבידוד RNA. ההשפעה של מניפולציה של נוירון יחיד (כגון גירוי חשמלי, או חשיפות לסוכנים תרופתיים) על המעגלים המזוהים כולו ניתן ללמוד ברמה של שינויים בביטוי של גנים ספציפיים נוירונים בודדים. לכן מתודולוגיה זו מאפשרת שילוב מוצלח של מתודולוגיות אלקטרופיזיולוגיות וגנומיות לחקר מעגלים עצביים ב Aplysia.

גישה זו יכולה להתרחב בקלות לחקר מודלים חסרי חוליות אחרים כגון רכיכה nudibranch טריטוניה, חילזון בריכה Lymnaea, סליל חילזון יבשתי שמערכות העצבים שלו מכילות מספר נוירונים מזוהים35-57. מודלים אלה משמשים גם בהרחבה לחקר השליטה העצבית בהתנהגויות כגון שחייה בבריחה, אוריינטציה של שדה מגנטי, היווצרות סינפסה, למידה ואחסון זיכרון. המתודולוגיה שתיארנו היא שילוב פשוט של ניתוח גנומיקה עם מדידות פיזיולוגיות של פעילות עצבית ברמת התא הבודד. תובנה עמוקה יותר על בסיס מולקולרי ופיזיולוגי של שליטה עצבית בהתנהגות יכולה להתקבל ממחקרים כאלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים מעומק הלב לקרן וייטהול על תמיכתם במימון וקרנות הסטארט-אפ ממכון המחקר סקריפס על ביצוע עבודה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O'Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Tags

נוירוביולוגיה גיליון 83 הקלטה תאית נוירון מזוהה מעגלים עצביים ביטוי גנים פוטנציאל פעולה CREB Aplysia californica גנומיקה
<em>אקליפסיה (1991)</em> הכנת גנגליה לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M.,… More

Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter