Summary
Marin snigel Aplysia californica har använts i stor utsträckning som en neurobiologi modell för studier på cellulära och molekylära grunder av beteende. Här beskrivs en metodik för att utforska nervsystemet i Aplysia för elektrofysiologiska och molekylära analyser av enstaka nervceller av identifierade neurala kretsar.
Abstract
En stor utmaning inom neurobiologi är att förstå de molekylära underbyggnader av neurala kretsar som styr ett specifikt beteende. När de specifika molekylära mekanismerna har identifierats kan nya terapeutiska strategier utvecklas för att behandla avvikelser i specifika beteenden som orsakas av degenerativa sjukdomar eller åldrande av nervsystemet. Den marina snigeln Aplysia californica är väl lämpad för undersökningar av cellulär och molekylär grund av beteende eftersom neurala kretsar som ligger till grund för ett specifikt beteende lätt kan bestämmas och de enskilda komponenterna i kretsarna lätt kan manipuleras. Dessa fördelar med Aplysia har lett till flera grundläggande upptäckter av neurobiologi av lärande och minne. Här beskriver vi en förberedelse av Aplysia nervsystemet för elektrofysiologiska och molekylära analyser av enskilda nervceller. Kort, ganglion dissekeras från nervsystemet utsätts för protease för att ta bort ganglion mantlar så att nervceller exponeras men behålla neuronal aktivitet som i intakta djur. Denna beredning används för att utföra elektrofysiologiska mätningar av enstaka eller flera nervceller. Viktigt, efter inspelningen med hjälp av en enkel metodik, nervcellerna kan isoleras direkt från ganglierna för genuttryck analys. Dessa protokoll användes för att utföra samtidiga elektrofysiologiska inspelningar från L7 och R15 nervceller, studera deras svar på acetylkolin och kvantifierande uttryck av CREB1 genen i isolerade enskilda L7, L11, R15 och R2 nervceller av Aplysia.
Introduction
Den mänskliga hjärnan är utomordentligt komplex med nästan 100 miljarder nervceller och biljoner synaptiska anslutningar. Det finns nästan lika många icke-tonuronal celler som interagerar med nervceller och reglerar deras funktion i hjärnan. Neuroner är organiserade i kretsar som reglerar specifika beteenden. Trots framstegen i vår förståelse av hjärnfunktioner och neurala kretsar är lite känt om identiteten hos kretskomponenter som styr ett specifikt beteende. Kunskap om identiteterna på olika komponenter i en krets kommer i hög grad att underlätta vår förståelse av både cellulär och molekylär grund för beteende och hjälp med att utveckla nya terapeutiska strategier för neuropsykiatriska störningar.
Den marina snigeln Aplysia californica har varit en arbetshäst för att bestämma neuronala kretsar som ligger till grund för specifika beteenden1-14. Aplysia nervsystemet innehåller cirka 20 000 nervceller som är organiserade i 9 olika ganglier. Aplysias nervceller är stora och kan enkelt identifieras baserat på deras storlek, elektriska egenskaper och position i ganglierna. Aplysia har en rik repertoar av beteenden som kan studeras. Ett av de väl studerade beteendena är gill-abstinensreflexen (GWR). De centrala komponenterna i denna reflex ligger i buken ganglier. Komponenter i GWR-kretsarna har kartlagts och bidrag från olika komponenter har fastställts. Viktigt är att GWR-kretsar genomgår associativt och icke-associeratlärande 5,6,15-19. Årtionden av studier på denna reflex har också identifierat flera signalvägar som har en nyckelroll i lärande och minne20-24.
Flera olika preparat av Aplysia användes för att studera cellulära och molekylära grunden för minneslagring. Dessa inkluderar det intakta djuret2,3, halv intaktförberedelse 1,7,13,14,16 och rekonstitution av viktiga komponenter i neurala kretsar25-29. En minskad förberedelse för att utforska Aplysia ganglier för elektrofysiologiska och molekylära analyser av identifierade neuronal kretsar beskrivs här. Följande fyra identifierade nervceller studerades. R15, en sprängande neuron, L7 och L11, två olika motoriska nervceller och R2, studerades en kolinerga neuron. R2 är den största neuron som beskrivs i ryggradslösa nervsystemet. Kortfattat innebär denna metod proteas behandling av ganglier, elektrofysiologiska mätningar före och efter farmakologiska behandlingar och isolering av enskilda nervceller för kvantitativ analys av genuttryck. Denna metodik gör det möjligt för oss att kombinera molekylära analyser med samtidig inspelning från flera nervceller. Denna metod användes framgångsrikt för att studera svar från R15 och L7 nervceller till acetylkolin (Ach) av parade intracellulära inspelningar. Efter elektrofysiologiska mätningar R15 och L7 och andra identifierade nervceller såsom L11 och R2 isolerades för kvantitativa polymeras kedjereaktion (qPCR) analys av uttryck av CREB1, en transkription faktor som är viktig för minnes lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av buken Ganglier, elektrofysiologiska mätningar och isolering av enstaka identifierade nervceller från buken Ganglion av Aplysia californica
- Behåll Aplysia i laboratorieakvariet med cirkulerande artificiellt havsvatten (ASW) vid 16 °C under 12:12 ljus:mörka förhållanden.
- Isolering av buken ganglion.
- Bedöva djur genom att injicera 380 mM MgCl2-lösning i 5-10 min (motsvarande 30-35% av djurets kroppsvikt).
- Identifiera buken ganglion baserat på dess position i centrala nervsystemet24,28.
- Ta bort ganglierna genom kirurgisk operation och förvara omedelbart i konstgjort havsvatten bestående av 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2,55 mM MgCl2,2,5 mM NaHCO3och 10 mM HEPES (pH 7,4).
- Proteas behandling.
- Inkubera buken ganglion i 30 min vid 34 °C±0,5 i en petriskål med 0,1% proteas (dispas) utspädd i ASW beskrivs ovan.
OBS: Mängden proteas som används måste standardiseras med djurens ålder och vikt. I allmänhet skulle äldre och större djur kräva mer proteas.
- Inkubera buken ganglion i 30 min vid 34 °C±0,5 i en petriskål med 0,1% proteas (dispas) utspädd i ASW beskrivs ovan.
- Avlägsnande av ganglia mantling.
- Efter enzymbehandlingen, fäst ganglierna på Sylgard Silikonbasen i en cellkammare (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) och granska med ASW (flödeshastighet: 150 μl/min) vid rumstemperatur (18 °C±2 ).
OBS: För att öka synligheten hos identifierade nervceller, placera ganglionen på toppen av en polykarbonatglascylinder(figur 1) (diameter Ø= 2 mm modifierad cellkammare) som lätt kan belysas från botten med hjälp av ett binokulärt stereomikroskop med 20X och 40X förstoring. - Ta försiktigt bort hylsan från ganglionen med hjälp av tång och mikroscissorer.
- Efter enzymbehandlingen, fäst ganglierna på Sylgard Silikonbasen i en cellkammare (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) och granska med ASW (flödeshastighet: 150 μl/min) vid rumstemperatur (18 °C±2 ).
- Samtidig elektrofysiologisk inspelning från två nervceller.
- Identifiera neuron av intresse.
- Spetsa neuronen med en enda intracellulär skarp mikroelektrod med resistans 10-15 MΩ fylld med 3 M KCl-lösning.
- Registrera neuronal aktivitet (10 kHz bandpass) med hjälp av ett intracellulärt inspelningssystem.
- Bearbeta inspelningsdata med hjälp av elektrofysiologi programvara som Axograph.
OBS: Man kan enkelt utföra inspelning från flera nervceller. Nervcellerna L7, L11 eller R15 och R2 identifieras enkelt baserat på deras position. Två förstärkare och två mikromanipulatorer krävs för samtidig registrering från två L7- och R15-nervceller (figur 2).
- Drogapplikation.
- Applicera valfrit läkemedel i cellkammaren genom att skonsam pipetting eller injicera direkt i nervceller.
- Utför elektrofysiologiska mätningar.
OBS: Beroende på det experimentella målet kan man mäta olika elektrofysiologiska parametrar för nervceller såsom förändringar i membranpotential (MP) eller åtgärdspotential (AP) före, under och efter läkemedelsapplikationen.
- Isolering av enstaka nervceller.
- Vid slutet av de elektrofysiologiska experimenten, stoppa perfusionen av ASW och tvätta ganglionen med 100% etanol. Exponering för etanol kommer att förstena nervcellerna och, med hjälp av fina tångar, göra det enkelt att ta bort enskilda nervceller utan att skada andra nervceller från ganglion.
- Ta bort enstaka nervceller under ett stereomikroskop och överför till ett litet Eppendorfrör som innehåller iskallt 500 μl RNA-extraktionsreagens. Isolerade enstaka nervceller kan lagras i RNA extraktion reagens vid -80 °C för framtida analys.
2. RNA-isolering från enskilda nervceller och genuttrycksanalys av kvantitativ PCR i realtid (qPCR)
- Försiktighetsåtgärder för att minimera RNA-nedbrytning:
Ribonukleaser (RNases) försämrar RNA och är mycket stabila och aktiva enzymer. Gör följande under hantering av RNAs.- Rengör arbetsområdet och instrumenten med RNase-avaktiveringsmedel.
- Använd alltid handskar när du hanterar RNA och byt handskar ofta.
- Använd endast RNase-fri plast för att hantera RNAs.
- Isolera totalt RNA från enstaka nervceller:
- Standard Trizol protokoll för RNA isolering kan användas för att isolera RNAs från enskilda nervceller. Tillsätt kort 20% v/v kloroform till Trizol, blanda väl genom kort virvel.
- Placera rören på rotatorn i 10 min vid 4 °C. Snurra trizolkloridblandningen vid 12 000 x g i 15 min vid 4 °C.
- Samla vattenfasen och överför till ett nytt rör.
- Tillsätt natriumacetatlösning (pH 5,5) till en slutlig koncentration på 0,3 M, 100 ng/ml av den koprecipitanta GlycoBlue och 2,5 volymer 100% etanol för att fälla ut RNA.
- Blanda proverna väl och inkubera vid -80 °C över natten.
- Snurra proverna vid 12 000 x g i 20 min vid 4 °C så kommer en liten blå pellet att synas längst ner på röret.
- Ta bort supernatanten och tvätta pelleten med 850 μl 75% iskall etanol vid 12 000 x g i 10 min vid 4 °C.
- Ta bort supernaten försiktigt och lufttorka RNA-pelleten i högst 7-10 min.
OBS: Se till att RNA inte lämnas länge för att torka som över-torkning av RNA-pelleten gör löslighet mycket svårt. - När RNA-pelleten har torkats återanvänds den i 10 μl RNAse fritt vatten och RNA-koncentrationen bestämmas.
OBS: Bestäm RNA-koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer. När du inte använder direkt, lagra RNA vid -80 °C.
- aRNA syntes från enskilda nervceller:
- Förstärk RNA (en eller två rundor beroende på experimentellt mål) med kommersiellt tillgängligt linjärt RNA-förstärkningssystem.
OBS: Det totala RNA från enstaka nervceller varierade från ~ 10-60 ng. Förväntad avkastning av första omgången förstärkning är ~ 100-300 ng och den andra förstärkningsrundan är ~ 0,8-1,5 μg RNA.
- Förstärk RNA (en eller två rundor beroende på experimentellt mål) med kommersiellt tillgängligt linjärt RNA-förstärkningssystem.
- Omvänd transkription av RNA:
- För att generera cDNA från aRNA, använd 1,0 μg aRNA i 20 μl av en omvänd transkriptionsreaktion. Flera kit är kommersiellt tillgängliga för detta ändamål.
OBS: cDNA syntetiserades enligt tillverkarens protokoll med hjälp av följande inställningar på termisk cyklist.
5 min vid 25 °C
30 min vid 42 °C
5 min vid 85 °C
Håll vid 4 °C - Efter det omvända transkriptionssteget, lagra cDNA vid -20 °C för långtidslagring.
- För att generera cDNA från aRNA, använd 1,0 μg aRNA i 20 μl av en omvänd transkriptionsreaktion. Flera kit är kommersiellt tillgängliga för detta ändamål.
- Primer design och standardisering:
Flera utmärkta program finns tillgängliga, gratis, för att designa primers för realtidsförstärkningar.- Välj 18-24 mer oligonukleotider som producerar 70-110 bp ampliconer och syntetisera primers med kommersiella källor.
OBS: Två till tre primerpar bör utformas för varje gen av intresse. Varje primeruppsättning måste standardiseras av qPCR. De främre och omvända primerpar som användes för genen CREB1 (Figur 4) är nedan:
Primer set 1
Anfallare: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3'
Omvänd: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
Primer set 2
Anfallare: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'
Omvänd: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3' - Om du vill välja den bästa primern som ska användas för nedströmsanalyserna övervakar du Ct-värdet och formen på förstärkningskurvan i qPCR.
OBS: Primers som ger Ct (Cykeltröskel) värden mellan 10-35 i 40 runda förstärkning och släta kurvor under pcr:s exponentiella fas följt av en slät platå är optimala för genuttrycksanalyser.
- Välj 18-24 mer oligonukleotider som producerar 70-110 bp ampliconer och syntetisera primers med kommersiella källor.
- Kvantitativ PCR i realtid (qPCR):
Obs: Använd lämpliga rör eller plattor som är kompatibla med qPCR-maskinen.- Späd cDNA till 5x med nukleasfritt vatten.
- Tillsätt 8 μl av en qPCR-huvudblandning som innehåller 2 μl H 2 O, 5 μl 2x SYBR Green master mix och 1,0 μl 10 μM (vardera) framåt och omvänd primer till 2 μl av en mastermix av qPCR som innehåller 2 μl av H2O, 5 μl 2x SYBR Green master mix och 1,0 μl 10 μM (vardera) framåt och bakåt.
- Stäng rören och täta plattan efter rörning cDNA och master mix. Blanda innehållet genom att trycka försiktigt och snurra ner vid 1 500 varv/min i 30 sekunder.
- Fortsätt med att konfigurera qPCR-datorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vikterna hos djur som användes i denna studie varierade mellan 100-200 g. Efter de beskrivna protokollen genomförde vi elektrofysiologiska mätningar och molekylär analys av nervceller av buken ganglier isolerade från djur från 2-5 g till 200-300 g.
Standardisering av proteasbehandling är viktigt för framgångsrika elektrofysiologiska mätningar av nervceller i ganglierna. Ursprungligen användes flera proteaskoncentrationer (Dispase) och varaktigheter och sprängande åtgärdspotentialer från R15 neuron registrerades26,31. Dessa mätningar jämfördes med direkt (utan protease behandling) inspelning från intakta ganglier. Koncentrationen av proteasen (0, 1% proteas, se steg 1. 3) som producerade sprängningspotentialer som var jämförbara med de som erhållits från exponerad ganglion utan proteas användes i de efterföljande experimenten.
Med hjälp av det beskrivna protokollet registrerades åtgärdspotentialer (AP) som svar på Ach exponering för R15, en kolinerga neuron och L7, en motor neuron som inte svarar på Ach. Som förväntat visar samtidiga elektrofysiologiska inspelningar att Ach inducerar depolarisering i R15 medan det inte fanns någon förändring i avfyrningen av L7. Figur 2 visar tillämpningen av acetylkolin (Ach) direkt i cellkammaren. 1 M Ach (volym 0,3 μl) applicerades direkt i kammaren med hjälp av mikropipett för att erhålla en slutlig 1 mM koncentration inuti kammaren.
Ach tvättades bort från badet genom perfusion och registrerades igen från R15 nervceller. Figur 3 visar vågformer som tyder på att Ach-effekten är reversibel. Analys av parametrarna AP i kontroll, under depolarisering och efter tvätt visas. Under depolarization amplitud minskas och varaktigheten av AP ökas avsevärt.
Efter elektrofysiologiska mätningar isolerades R15 och L7 nervceller och RNAs utarbetades för qPCR analyser. En linjär T7 RNA Polymeras-driven transkription med MessageAmp II aRNA Amplification Kit från Ambion användes för att förstärka RNAs från enskilda nervceller. Som jämförelse studerades även identifierade nervcellerna R2 och L11 och hela buken ganglier från vuxna (6-9 månader gamla) och unga djur (1-2 månader gamla). qPCR-förstärkning utfördes i ett PCR-system på 7900HT fast realtid under följande förhållanden: 95 °C i 10 min, följt av 40 cykler på 95 °C i 15 sek, 60 °C i 1 min. Det fanns fyra biologiska replikat i experimentet. Varje biologisk replikat hade fyra tekniska replikat i qPCR-uppsättningen. Ct-värden från fyra replikat var genomsnittliga och 1/Ct beräknades för att hitta den absoluta uttrycksnivån för CREB1 i varje prov (figur 4). En uppskattning av de absoluta uttryck nivåer av CREB1 genen i unga och vuxna Aplysia ganglier, och i fyra identifierade enskilda nervceller övervakades av Ct värde erhålls från qPCR mätningar.
Start mRNA koncentrationen var densamma i både unga och vuxna buken ganglier. Samma framåt och omvända CREB1 primer set användes i alla qPCR, både i studier med ganglier och enstaka nervceller. Ct-värdena är mycket lika mellan unga och vuxna buken ganglier. På samma sätt mättes Ct värden när det gäller enskilda nervceller där start totala mRNA koncentrationer var låga och två omgångar av förstärkning gav en bra mängd RNAs för cDNA syntes. Ct-värdena för CREB1-förstärkningen föreslog att CREB1-uttryck i R15- och L7-nervceller är jämförbara medan R2 och L11 visade signifikanta skillnader i uttryck jämfört med L7 eller R15 (Studentens T-test, p<0,05) (figur 4).
Figur 1. Mikroskopstadium och perfusionssystem för ganglier elektrofysiologi. Perfusion system och stadium gjordes med plexiglas och är transparenta. Den här inställningen är monterad på ett metallblock (visas inte) för att hålla position. Metallblocket är konstruerat så att proverna kan belysas från botten. Ett prov elektrofysiologisk sprängning mönster registreras från R15 neuron visas.
Figur 2. Samtidig inspelning från L7 och R15 neuron av buken ganglier. (A) Tecknad film av buken ganglier som visar positionen för L7 och R15 nervceller (modifierade från Kandel 2001, omtryckta med tillstånd från AAAS). Också visas är positionerna för R2 och L11 i buken ganglier. B)Representativa intracellulära inspelningar från L7 och R15. Pil anger tiden för Ach-programmet. Man kan fortsätta dessa mätningar i 8-10 timmar.
Figur 3. Ach inducerade förändringar i åtgärdspotentialen (AP) av R15. AP vågformer analyserades före, under och efter Ach exponering. Representativa vågformer visas. ms: milliisekunder, mV: millivolt.
Figur 4. qPCR analys av uttryck av CREB1 i buken ganglier och enstaka identifierade nervceller. A)Absolut kvantifiering av CREB1-transkription i aplysiens unga och vuxna bukkaränger. Totalt RNA isolerades med hjälp av standard Trizol protokoll som beskrivs i metoderna. 1 μg av totalt RNA användes för att syntetisera cDNA, följt av PCR-förstärkning i realtid med CREB1 primers. B)Absolut kvantifiering av CREB1-transkription i identifierade enskilda nervceller av gammal Aplysia. Totalt RNA utsattes för två omgångar in vitro amplifiering före cDNA syntes. 1 μg aRNA användes för att syntetisera cDNA, följt av PCR-förstärkning i realtid med CREB1 primers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neuron R15 är involverad i reglering av kardiovaskulära, matsmältnings-, andnings- och reproduktionssystem30. En regelbundet rytmisk sprängningsaktivitet hos AP är en funktion i R15. Som visas i resultatavsnittet visar parinspelning av R15 och L7 att ganglipreparatet har bevarat aktiviteten hos R15-nervceller. R15 och L7 nervceller svarade lämpligt på Ach. Denna ganglia förberedelse kunde upprätthållas upp till 8-10 timmar och elektrofysiologisk verksamhet kunde övervakas kontinuerligt. Således kan man studera de elektrofysiologiska effekterna av kort neurotransmittorexponering (exponeras lokalt för en specifik neuron eller för badet) under en lång tid. Dessutom kan man studera effekterna av exponering för flera signalsubstanser (samtidigt eller i tandem) på samma neuron på avfyrningsegenskaper hos sig själv eller följaren neuron eller båda.
Ett exempel på genuttrycksmätningar av qPCR visas i figur 4. Eftersom RNA-innehållet i en enda neuron är låg, är in vitro-förstärkning nödvändig för att erhålla en tillräcklig mängd RNA för kvantifierande uttryck av flera gener. Kommersiella kit finns tillgängliga för in vitro-transkriptionsprocessen. Förstärkningen av CREB1-avskriften kvantifierades direkt av antalet cykler som krävs för att erhålla en standardiserad fluorescenssignal, Ct-metoden31. Det förstärkta RNA från en enda neuron är tillräckligt för studierna för att bestämma genuttrycksförändringar i ett stort antal gener med mikroarray32 och för hela transkriptomen av RNAseq-analyser33.
En begränsning av denna teknik är att detta preparat inte kan bevara alla synaptiska anslutningar av nervcellerna i buken ganglier. Flera av nervcellerna bildar synapser med nervceller i andra ganglier och i gangliförberedelserna kommer dessa långdistansanslutningar att missas. Metoden som beskrivs här kan dock lätt ändras för att inkludera hela CNS eller lätt kunna integreras till halv intaktberedning 13,14,16 som beskrevs för att studera cellulära och elektrofysiologiska förändringar i gill och sifon tillbakadragande reflex.
De senaste framstegen inom genomiktekniker gör det nu möjligt för oss att få en djup inblick i dynamiken i uttrycket av kodning och icke-kodning av RNAs34. Den reducerade preparatet som beskrivs här är idealisk för att studera temporala förändringar av genuttryck i samband med elektrofysiologiska mätningar. Till exempel kan man tillämpa farmakologiska medel och mäta deras effekter på elektriska egenskaper hos enskilda nervceller eller flera nervceller som ingår i samma neurala kretsar och isolera enskilda nervceller vid olika tidpunkter för RNA-isolering. Effekten av manipulering av en enda neuron (såsom elektrisk stimulering eller exponering för farmakologiska medel) på hela identifierade kretsar kan studeras på nivån för förändringar i uttryck av specifika gener i enskilda nervceller. Således underlättar denna metodik framgångsrik integration av elektrofysiologiska och genomiska metoder för att studera neurala kretsar i Aplysia.
Detta tillvägagångssätt kan lätt utvidgas till att omfatta studier av andra ryggradslösa modeller såsom nudibranch mollusc Tritonia, damm snigel Lymnaea och terrestra snigel Helix vars nervsystem innehåller flera identifierade nervceller35-57. Dessa modeller används också i stor utsträckning för studier av neural kontroll av beteenden som flyktsimning, magnetfältorientering, synapsbildning, lärande och minneslagring. Metoden vi beskrev är en enkel integration av genomik analys med fysiologiska mätningar av neuronal aktivitet på en cell nivå. En djupare inblick i molekylär och fysiologisk grund för neural kontroll av beteende kan erhållas från sådana studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Upphovsmännen har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar uppriktigt Whitehall Foundation för deras finansieringsstöd och startfonder från The Scripps Research Institute för att ha utfört detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aplysia | National Aplysia Resource Facility, University of Miami | ||
| NaCl | SIGMA | S 3014-1KG | |
| KCl | SIGMA | P 9333-500G | |
| CaCl2•2H2O | SIGMA | C5080- 500G | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP 214-501 | |
| NaHCO4 | SIGMA | S 6297-250G | |
| HEPES | SIGMA | H 3375-500G | |
| Protease | GIBCO | 17105-042 | |
| Trizol | Ambion | 15596-026 | |
| Chloroform | MP Biomedicals | 2194002 | |
| 100% Ethanol | ACROS | 64-17-5 | |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| 3 M NaOAc, pH 5.5 | Ambion | AM9740 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9737 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion | AM1751 | |
| qScript cDNA SuperMix | Quanta Biosciences | 95048-100 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stainless Steel Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 or | |
| 26002-20 | |||
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | Veriti Thermal Cycler | |
| 5430R Centrifuge | Eppendorf | 5430R Centrifuge | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | 7900HT Fast Real-Time PCR | |
| Amplifier | BRAMP-01R | NPI Electronics | |
| Digidata Converter | Instrutech ITC-18 | HEKA ELEKTRONIK | |
| Micro Manipulator | Patch Star | Scientifica |
References
- Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
- Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
- Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
- Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
- Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
- Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
- Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
- Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
- Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
- McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
- McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
- Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
- Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
- Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
- Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
- Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
- Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
- Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
- Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
- Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
- Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
- Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
- Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
- Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
- Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
- Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
- Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
- Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
- Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
- Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
- Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
- Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
- Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
- Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
- Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
- Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
- Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O'Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
- Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
- Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
- Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
- Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
- Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
- McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
- Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
- Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
- Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
- Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
- Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
- Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
- Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
- Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
- Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).
