Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Aplysia Ganglia voorbereiding voor elektrofysiologische en moleculaire analyses van enkele neuronen

Published: January 13, 2014 doi: 10.3791/51075
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, Florida

Summary

Zeeslak Aplysia californica is veel gebruikt als een neurobiologisch model voor de studies op cellulaire en moleculaire basis van gedrag. Hier wordt een methodologie beschreven voor het verkennen van het zenuwstelsel van Aplysia voor de elektrofysiologische en moleculaire analyses van enkele neuronen van geïdentificeerde neurale circuits.

Abstract

Een grote uitdaging in de neurobiologie is het begrijpen van de moleculaire onderbouwing van neurale circuits die een specifiek gedrag bepalen. Zodra de specifieke moleculaire mechanismen zijn geïdentificeerd, kunnen nieuwe therapeutische strategieën worden ontwikkeld om afwijkingen in specifiek gedrag veroorzaakt door degeneratieve ziekten of veroudering van het zenuwstelsel te behandelen. De zeeslak Aplysia californica is zeer geschikt voor het onderzoeken van cellulaire en moleculaire gedragsbasis, omdat neurale circuits die ten grondslag liggen aan een specifiek gedrag gemakkelijk kunnen worden bepaald en de afzonderlijke componenten van het circuit gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd. Deze voordelen van Aplysia hebben geleid tot verschillende fundamentele ontdekkingen van neurobiologie van leren en geheugen. Hier beschrijven we een voorbereiding van het Aplysia zenuwstelsel voor de elektrofysiologische en moleculaire analyses van individuele neuronen. Kortom, ganglion ontleed uit het zenuwstelsel wordt blootgesteld aan protease om de ganglionschede te verwijderen, zodat neuronen worden blootgesteld, maar neuronale activiteit behouden zoals bij het intacte dier. Dit preparaat wordt gebruikt om elektrofysiologische metingen van enkele of meerdere neuronen uit te voeren. Belangrijk is dat na de opname met behulp van een eenvoudige methodologie, de neuronen rechtstreeks van de ganglia kunnen worden geïsoleerd voor genexpressieanalyse. Deze protocollen werden gebruikt om gelijktijdige elektrofysiologische opnames uit te voeren van L7- en R15-neuronen, hun reactie op acetylcholine te bestuderen en de expressie van creb1-gen te kwantificeren in geïsoleerde enkelvoudige L7-, L11-, R15- en R2-neuronen van Aplysia.

Introduction

Het menselijk brein is buitengewoon complex met bijna 100 miljard neuronen en biljoenen synaptische verbindingen. Er zijn bijna een gelijk aantal niet-neuronale cellen die interageren met neuronen en hun functie in de hersenen reguleren. Neuronen zijn georganiseerd in circuits die specifiek gedrag reguleren. Ondanks de vooruitgang in ons begrip van hersenfuncties en neurale circuits, is er weinig bekend over de identiteit van circuitcomponenten die een specifiek gedrag controleren. Kennis van de identiteiten van verschillende componenten van een circuit zal ons begrip van zowel cellulaire als moleculaire basis van gedrag aanzienlijk vergemakkelijken en helpen bij het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën voor neuropsychiatrische aandoeningen.

De zeeslak Aplysia californica is een werkpaard geweest voor het bepalen van neuronale circuits die ten grondslag liggen aan specifiek gedrag1-14. Het Aplysia zenuwstelsel bevat ongeveer 20.000 neuronen die zijn georganiseerd in 9 verschillende ganglia. De neuronen van Aplysia zijn groot en kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd op basis van hun grootte, elektrische eigenschappen en positie in de ganglia. Aplysia heeft een rijk repertoire aan gedragingen die bestudeerd kunnen worden. Een van de goed bestudeerde gedragingen is de kieuwontwenningsreflex (GWR). De centrale componenten van deze reflex bevinden zich in abdominale ganglia. Onderdelen van de GWR-circuits zijn in kaart gebracht en bijdragen van verschillende componenten zijn bepaald. Belangrijk is dat GWR-circuits associatief en niet-associatief leren ondergaan5,6,15-19. Tientallen jaren van onderzoek naar deze reflex hebben ook verschillende signaleringsroutes geïdentificeerd die een sleutelrol spelen in leren en geheugen20-24.

Verschillende preparaten van Aplysia werden gebruikt om cellulaire en moleculaire basis van geheugenopslag te bestuderen. Deze omvatten het intacte dier2,3, semi-intact preparaat1,7,13,14,16 en reconstitutie van belangrijke componenten van neurale circuits25-29. Een verminderde voorbereiding voor het verkennen van Aplysia ganglia voor de elektrofysiologische en moleculaire analyses van geïdentificeerde neuronale circuits wordt hier beschreven. De volgende vier geïdentificeerde neuronen werden bestudeerd. R15, een barstend neuron, L7 en L11, twee verschillende motorneuronen en R2, een cholinerge neuron werden bestudeerd. R2 is het grootste neuron beschreven in het ongewervelde zenuwstelsel. Kortom, deze methodologie omvat proteasebehandeling van ganglia, elektrofysiologische metingen voor en na farmacologische behandelingen en isolatie van enkele neuronen voor kwantitatieve analyse van genexpressie. Deze methodologie stelt ons in staat om moleculaire analyses te combineren met gelijktijdige opname van meerdere neuronen. Deze methodologie werd met succes gebruikt om reacties van R15- en L7-neuronen op acetylcholine (Ach) te bestuderen door gepaarde intracellulaire opnames. Na elektrofysiologische metingen werden R15 en L7 en andere geïdentificeerde neuronen zoals L11 en R2 geïsoleerd voor kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) analyse van expressie van CREB1, een transcriptiefactor die belangrijk is voor geheugenopslag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van abdominale ganglia, elektrofysiologische metingen en isolatie van enkele geïdentificeerde neuronen uit abdominale ganglion van Aplysia californica

  1. Houd Aplysia in het laboratoriumaquarium met circulerend kunstmatig zeewater (ASW) bij 16 °C onder 12:12 licht:donker.
  2. Isolatie van abdominale ganglion.
    1. Verdoof dieren door 380 mM MgCl2-oplossing gedurende 5-10 minuten te injecteren (overeenkomend met 30-35% van het lichaamsgewicht van het dier).
    2. Identificeer het abdominale ganglion op basis van zijn positie in het centrale zenuwstelsel24,28.
    3. Verwijder de ganglia door chirurgische ingreep en bewaar onmiddellijk in kunstmatig zeewater bestaande uit 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2,55 mM MgCl2,2,5 mM NaHCO3en 10 mM HEPES (pH 7,4).
  3. Protease behandeling.
    1. Incubeer abdominale ganglion gedurende 30 minuten bij 34 °C±0,5 in een Petrischaal met 0,1% protease (dispase) verdund in ASW zoals hierboven beschreven.
      OPMERKING: De hoeveelheid van het gebruikte protease moet worden gestandaardiseerd met de leeftijd en het gewicht van de dieren. Over het algemeen zouden oudere en grotere dieren meer protease nodig hebben.
  4. Verwijdering van gangliaschede.
    1. Na de enzymbehandeling de ganglia vastmaken aan de Sylgard Silicone-basis van een celkamer (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) en doordrenkt met ASW (debiet: 150 μl/min) bij kamertemperatuur (18 °C±2 ).
      OPMERKING: Om de zichtbaarheid van geïdentificeerde neuronen te vergroten, plaatst u het ganglion op de bovenkant van een polycarbonaat glazen cilinder (figuur 1) (diameter Ø = 2 mm gemodificeerde celkamer) die gemakkelijk van onderaf kan worden verlicht met behulp van een verrekijker stereomicroscoop met 20X en 40X vergroting.
    2. Verwijder voorzichtig de huls van het ganglion met behulp van tangen en microscissors.
  5. Gelijktijdige elektrofysiologische opname van twee neuronen.
    1. Identificeer neuron van belang.
    2. Impale het neuron met een enkele intracellulaire scherpe microelectrode met weerstand 10-15 MΩ gevuld met 3 M KCl oplossing.
    3. Registreer neuronale activiteit (10 kHz-bandpas) met behulp van een intracellulair opnamesysteem.
    4. Verwerk de opnamegegevens met behulp van elektrofysiologiesoftware zoals Axograph.
      OPMERKING: Men kan eenvoudig opnemen vanuit meerdere neuronen. Neuronen L7, L11 of R15 en R2 zijn gemakkelijk te identificeren op basis van hun positie. Twee versterkers en twee micromanipulatoren zijn nodig voor het gelijktijdig opnemen van twee L7- en R15-neuronen (figuur 2).
  6. Drugstoepassing.
    1. Breng het medicijn naar keuze aan in de celkamer door voorzichtig te pipetten of injecteer rechtstreeks in neuronen.
    2. Voer elektrofysiologische metingen uit.
      OPMERKING: Afhankelijk van het experimentele doel kan men verschillende elektrofysiologische parameters van neuronen meten, zoals de veranderingen in membraanpotentiaal (MP) of actiepotentiaal (AP) voor, tijdens en na de toepassing van het geneesmiddel.
  7. Isolatie van enkele neuronen.
    1. Aan het einde van de elektrofysiologische experimenten, stop de perfusie van ASW en was het ganglion met 100% ethanol.  Blootstelling aan ethanol zal de neuronen versteaaien en, met behulp van fijne tangen, het gemakkelijk maken om individuele neuronen te verwijderen zonder andere neuronen uit het ganglion te beschadigen.
    2. Verwijder enkele neuronen onder een stereomicroscoop en breng over op een kleine Eppendorf-buis met ijskoud RNA-extractiereagens van 500 μl. Geïsoleerde enkelvoudige neuronen kunnen worden opgeslagen in RNA-extractiereagens bij -80 °C voor toekomstige analyse.

2. RNA-isolatie van enkele neuronen en genexpressieanalyse door kwantitatieve real-time PCR (qPCR)

  1. Voorzorgsmaatregelen om RNA-afbraak te minimaliseren:
    Ribonucleases (RNases) degraderen RNA en zijn zeer stabiele en actieve enzymen. Neem de volgende stappen tijdens het hanteren van RNA's.
    1. Reinig het werkgebied en de instrumenten met RNase deactiverende middelen.
    2. Draag te allen tijde handschoenen tijdens het hanteren van RNA en wissel handschoenen vaak.
    3. Gebruik alleen RNase-vrije kunststoffen om RNA's te verwerken.
  2. Isoleren van totaal RNA van enkele neuronen:
    1. Standaard Trizol protocol voor RNA isolatie kan worden gebruikt om RNA's te isoleren van enkele neuronen. Voeg kort 20% v/v chloroform toe aan Trizol, meng goed door korte vortexing.
    2. Plaats de buizen 10 min op rotator bij 4 °C. Draai de Trizol-Chloroform mix op 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.
    3. Verzamel de waterfase en breng over naar een verse buis.
    4. Voeg natriumacetaatoplossing (pH 5,5) toe aan een eindconcentratie van 0,3 M, 100 ng/ml coprecipitant GlycoBlue en 2,5 volumes 100% ethanol om RNA te precipitaten.
    5. Meng de monsters goed en incubeer 's nachts bij -80 °C.
    6. Draai de monsters op 12.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C en een kleine blauwe pellet is zichtbaar aan de onderkant van de buis.
    7. Verwijder het supernatant en was de pellet met 850 μl 75% ijskoude ethanol op 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    8. Verwijder het supernatant voorzichtig en droog de RNA-pellet maximaal 7-10 minuten aan de lucht.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat RNA niet lang wordt laten drogen als over-het drogen van de RNA-pellet maakt solubilisatie erg moeilijk.
    9. Eenmaal gedroogd, resuspend de RNA pellet in 10 μl RNAse vrij water en bepaal de RNA concentratie.
      OPMERKING: Bepaal de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer. Wanneer u RNA niet meteen gebruikt, bewaar RNA dan bij -80 °C.
  3. aRNA-synthese uit enkele neuronen:
    1. Versterk het RNA (één of twee rondes afhankelijk van de experimentele doelstelling) met behulp van een in de handel verkrijgbaar lineair RNA-versterkingssysteem.
      OPMERKING: Het totale RNA van enkele neuronen varieerde van ~10-60 ng. De verwachte opbrengst van de eerste versterkingsronde is ~100-300 ng en de tweede versterkingsronde is ~0,8-1,5 μg RNA.
  4. Omgekeerde transcriptie van RNA:
    1. Gebruik 1,0 μg aRNA in 20 μl van een omgekeerde transcriptiereactie om cDNA uit aRNA te genereren. Hiervoor zijn verschillende kits in de handel verkrijgbaar.

      OPMERKING: cDNA is gesynthetiseerd volgens het protocol van de fabrikant met behulp van de volgende instellingen op thermische cycler.
      5 min bij 25 °C
      30 min bij 42 °C
      5 min bij 85 °C
      Vasthouden bij 4 °C
    2. Sla na de omgekeerde transcriptiestap de cDNA op bij -20 °C voor langdurige opslag.
  5. Primer ontwerp en standaardisatie:
    Verschillende uitstekende softwareprogramma's zijn gratis beschikbaar voor het ontwerpen van primers voor realtime versterkingen.
    1. Selecteer 18-24 mer oligonucleotiden die 70-110 bp amplicons produceren en synthetiseren de primers met behulp van commerciële bronnen.
      OPMERKING: Voor elk interessant gen moeten twee tot drie primerparen worden ontworpen. Elke primerset moet gestandaardiseerd worden door qPCR. De voorwaartse en omgekeerde primerparen die werden gebruikt voor gen CREB1 (figuur 4) staan hieronder:

      Primer set 1
      Voorwaarts: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3'
      Achteruit: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
      Primer set 2
      Voorwaarts: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'

      Achteruit: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'
    2. Om de beste primer te selecteren die voor de downstreamanalyses moet worden gebruikt, controleert u de Ct-waarde en de vorm van de versterkingscurve in qPCR.
      OPMERKING: Primers die Ct (Cycle threshold) waarden geven tussen 10-35 in de 40 ronde versterking en vloeiende curven tijdens de exponentiële fase van de PCR gevolgd door een glad plateau zijn optimaal voor genexpressieanalyses.
  6. Kwantitatieve Real Time PCR (qPCR):
    Opmerking: Gebruik geschikte buizen of platen die compatibel zijn met de qPCR-machine.
    1. Verdun cDNA tot 5x met nucleasevrij water.
    2. Voeg aan 2 μl verdund cDNA 8 μl van een qPCR-mastermix toe met 2 μl H2O, 5 μl 2x SYBR Green mastermix en 1,0 μl 10 μM (elk) voorwaartse en omgekeerde primer.
    3. Sluit de buizen en sluit de plaat af na het pipetten van cDNA en mastermix. Meng de inhoud door zachtjes te tikken en 30 sec. bij 1.500 tpm naar beneden te draaien.
    4. Ga verder met het instellen van de qPCR-machine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De gewichten van dieren die in deze studie werden gebruikt, varieerden van 100-200 g. Volgens de beschreven protocollen voerden we elektrofysiologische metingen en moleculaire analyse uit van neuronen van abdominale ganglia geïsoleerd van dieren variërend van 2-5 g tot 200-300 g.

Standaardisatie van proteasebehandeling is belangrijk voor succesvolle elektrofysiologische metingen van neuronen in de ganglia. Aanvankelijk werden meerdere proteaseconcentraties (Dispase) en duur gebruikt en bursting action potentials van R15 neuron werden geregistreerd26,31. Deze metingen werden vergeleken met directe (zonder proteasebehandeling) opname van de intacte ganglia. Concentratie van het protease (0,1% protease, zie stap 1.3) dat barstende potentialen produceerde die vergelijkbaar waren met die verkregen uit blootgesteld ganglion zonder protease, werden gebruikt in de daaropvolgende experimenten.

Met behulp van het beschreven protocol werden actiepotentiaal (AP) geregistreerd als reactie op Ach-blootstelling aan R15, een cholinerge neuron en L7, een motorneuron dat niet reageert op Ach. Zoals verwacht tonen gelijktijdige elektrofysiologische opnames aan dat Ach depolarisatie induceert in R15, terwijl er geen verandering was in het afvuren van L7. Figuur 2 toont de toepassing van Acetylcholine (Ach) direct in de celkamer. 1 M Ach (volume 0,3 μl) werd rechtstreeks in de kamer aangebracht met behulp van micropipet om een uiteindelijke concentratie van 1 mM in de kamer te verkrijgen.

Ach werd door perfusie uit het bad gewassen en opnieuw opgenomen uit R15 neuronen. Figuur 3 toont golfvormen die suggereren dat ach-effect omkeerbaar is. Analyse van de parameters AP in controle, tijdens depolarisatie en na het wassen wordt getoond. Tijdens depolarisatie wordt de amplitude verminderd en de duur van AP aanzienlijk verhoogd.

Na elektrofysiologische metingen werden R15- en L7-neuronen geïsoleerd en werden RNA's voorbereid voor qPCR-analyses. Een lineaire T7 RNA Polymerase-gedreven transcriptie met Behulp van MessageAmp II aRNA Amplification Kit van Ambion werd gebruikt voor het versterken van RNA's van enkele neuronen. Ter vergelijking, geïdentificeerde neuronen R2 en L11 en de hele abdominale ganglia van volwassen (6-9 maanden oud) en jonge dieren (1-2 maanden oud) werden ook bestudeerd. qPCR-versterking werd uitgevoerd in een 7900HT Fast Real-Time PCR-systeem onder de volgende omstandigheden: 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 15 sec, 60 °C gedurende 1 min. Er waren vier biologische replica's in het experiment. Elke biologische replica had vier technische replica's in de qPCR-opstelling. Ct-waarden van vier replica's werden gemiddeld en 1/Ct werd berekend om het absolute expressieniveau van CREB1 in elk monster te vinden (figuur 4). Een schatting van de absolute expressieniveaus van creb1-gen bij jonge en volwassen Aplysia ganglia, en in vier geïdentificeerde enkelvoudige neuronen werd gecontroleerd door de Ct-waarde verkregen uit qPCR-metingen.

De beginnende mRNA-concentratie was hetzelfde bij zowel jonge als volwassen abdominale ganglia. Dezelfde voorwaartse en omgekeerde CREB1 primer set werden gebruikt in alle qPCRs, zowel in studies met behulp van ganglia en enkele neuronen. De Ct-waarden lijken erg op die van jonge en volwassen abdominale ganglia. Evenzo werden Ct-waarden gemeten in het geval van enkelvoudige neuronen waarbij de totale mRNA-concentraties laag waren en twee versterkingsrondes een goede hoeveelheid RNA's opleverden voor cDNA-synthese. De Ct-waarden van CREB1-versterking suggereerden dat CREB1-expressie in R15- en L7-neuronen vergelijkbaar is, terwijl R2 en L11 significante verschillen in expressie vertoonden in vergelijking met L7 of R15 (Student's T-test, p<0.05) (Figuur 4).

Figure 1
Figuur 1. Microscoop stadium en perfusie systeem voor ganglia elektrofysiologie. Perfusiesysteem en podium zijn gemaakt van plexiglas en zijn transparant. Deze opstelling is gemonteerd op een metalen blok (niet afgebeeld) om de positie vast te houden. Het metalen blok is zo ontworpen dat monsters vanaf de onderkant kunnen worden verlicht. Een monster elektrofysiologisch barsten patroon geregistreerd van R15 neuron wordt getoond.

Figure 2
Figuur 2. Gelijktijdige opname van L7 en R15 neuron van abdominale ganglia. (A) Cartoon van abdominale ganglia met de positie van L7- en R15-neuronen (gewijzigd uit Kandel 2001, herdrukt met toestemming van AAAS). Ook worden de posities van R2 en L11 in de abdominale ganglia getoond. (B) Representatieve intracellulaire opnamen van L7 en R15. Pijl geeft de tijd van Ach-toepassing aan. Men zou deze metingen 8-10 uur kunnen voortzetten.

Figure 3
Figuur 3. Ach veroorzaakte veranderingen in actiepotentiaal (AP) van R15. AP-golfvormen werden geanalyseerd voor, tijdens en na ach-blootstelling. Representatieve golfvormen worden weergegeven. ms: milliseconde, mV: millivolt.

Figure 4

Figuur 4. qPCR analyse van expressie van CREB1 in abdominale ganglia en enkelvoudig geïdentificeerde neuronen. (A) Absolute kwantificering van creb1-transcriptie bij de jonge en volwassen abdominale ganglia van Aplysia. Total RNA werd geïsoleerd met behulp van standaard Trizol protocol zoals beschreven in de methoden. 1 μg totaal RNA werd gebruikt om cDNA te synthetiseren, gevolgd door real-time PCR-versterking met CREB1-primers. (B) Absolute kwantificering van CREB1 transcript in geïdentificeerde enkelvoudige neuronen van oude Aplysia. Totaal RNA werd onderworpen aan twee rondes van in vitro versterking vóór cDNA-synthese. 1 μg aRNA werd gebruikt om cDNA te synthetiseren, gevolgd door real-time PCR-versterking met CREB1-primers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het neuron R15 is betrokken bij het reguleren van cardiovasculaire, spijsverterings-, ademhalings- en voortplantingssystemen30. Een regelmatig ritmische barstende activiteit van de AP is een kenmerk van R15. Zoals getoond in de resultatensectie, laten gekoppelde opnames van R15 en L7 zien dat het gangliapreparaat de activiteit van R15-neuronen heeft behouden. R15- en L7-neuronen reageerden adequaat op Ach. Dit gangliapreparaat kon tot 8-10 uur worden gehandhaafd en elektrofysiologische activiteit kon continu worden gecontroleerd. Men zou dus de elektrofysiologische effecten van korte blootstelling aan neurotransmitters (lokaal blootgesteld aan een specifiek neuron of aan het bad) gedurende een lange periode kunnen bestuderen. Bovendien zou men de effecten van blootstelling aan meerdere neurotransmitters (gelijktijdig of in tandem) op hetzelfde neuron kunnen bestuderen op de vuureigenschappen van zichzelf of het volgneuron of beide.

Een voorbeeld van genexpressiemetingen door qPCR is weergegeven in figuur 4. Aangezien het RNA-gehalte van een enkel neuron laag is, is in vitro versterking noodzakelijk om voldoende RNA te verkrijgen voor het kwantificeren van expressie van meerdere genen. Commerciële kits zijn beschikbaar voor het in vitro transcriptieproces. De versterking van het CREB1 transcript werd direct gekwantificeerd door het aantal cycli dat nodig is om een gestandaardiseerd fluorescentiesignaal te verkrijgen, de Ct-methode31. Het versterkte RNA van een enkel neuron is voldoende voor de studies om genexpressieveranderingen in een groot aantal genen te bepalen met behulp van microarray32 en voor het hele transcriptoom door RNAseq-analyses33.

Een beperking van deze techniek is dat dit preparaat mogelijk niet alle synaptische verbindingen van de neuronen van de abdominale ganglia behoudt. Verschillende neuronen vormen synapsen met neuronen in andere ganglia en in de gangliavoorbereiding zullen deze langeafstandsverbindingen worden gemist. De hier beschreven methodologie kan echter gemakkelijk worden gewijzigd om het volledige CZS op te nemen of kan gemakkelijk worden geïntegreerd in semi-intact preparaat13,14,16 dat werd beschreven om cellulaire en elektrofysiologische veranderingen in de kieuw- en sifonontwenningsreflex te bestuderen.

Recente vooruitgang in genomicstechnieken stelt ons nu in staat om een diepgaand inzicht te krijgen in de dynamiek van expressie van codering en niet-coderende RNA 's34. Het verminderde preparaat dat hier wordt beschreven, is ideaal voor het bestuderen van temporele veranderingen van genexpressie in combinatie met elektrofysiologische metingen. Men zou bijvoorbeeld farmacologische middelen kunnen toepassen en hun effecten op elektrische eigenschappen van individuele neuronen of meerdere neuronen die deel uitmaken van hetzelfde neurale circuit kunnen meten en individuele neuronen op verschillende tijdstippen kunnen isoleren voor RNA-isolatie. Het effect van manipulatie van een enkel neuron (zoals elektrische stimulatie, of blootstelling aan farmacologische agentia) op het gehele geïdentificeerde circuit kan worden bestudeerd op het niveau van veranderingen in expressie van specifieke genen in afzonderlijke neuronen. Aldus vergemakkelijkt deze methodologie succesvolle integratie van elektrofysiologische en genomische methodologieën om neurale circuits in Aplysia te bestuderen.

Deze aanpak kan gemakkelijk worden uitgebreid tot de studie van andere ongewervelde modellen zoals naaktweekdier Tritonia, vijverslak Lymnaea en terrestrische slak Helix waarvan het zenuwstelsel verschillende geïdentificeerde neuronen35-57bevat . Deze modellen worden ook veel gebruikt voor de studie van neurale controle van gedrag zoals ontsnappingszwemmen, oriëntatie van het magnetisch veld, synapsvorming, leren en geheugenopslag. De methodologie die we beschreven is een eenvoudige integratie van genomicsanalyse met fysiologische metingen van neuronale activiteit op enkelcellig niveau. Een dieper inzicht in de moleculaire en fysiologische basis van neurale controle van gedrag zou kunnen worden verkregen uit dergelijke studies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij danken de Whitehall Foundation hartelijk voor hun financiële steun en startfondsen van The Scripps Research Institute voor het uitvoeren van dit werk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O'Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Tags

Neurobiologie intracellulaire opname geïdentificeerd neuron neurale circuits genexpressie actiepotentiaal CREB Aplysia californica genomics
<em>Aplysia</em> Ganglia voorbereiding voor elektrofysiologische en moleculaire analyses van enkele neuronen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M.,… More

Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter