Summary
A caracol marinha Aplysia californica tem sido amplamente utilizada como modelo de neurobiologia para os estudos sobre base celular e molecular do comportamento. Aqui é descrita uma metodologia para explorar o sistema nervoso da Aplysia para as análises eletrofisiológicas e moleculares de neurônios únicos de circuitos neurais identificados.
Abstract
Um grande desafio na neurobiologia é entender os fundamentos moleculares dos circuitos neurais que governam um comportamento específico. Uma vez identificados os mecanismos moleculares específicos, novas estratégias terapêuticas podem ser desenvolvidas para tratar anormalidades em comportamentos específicos causados por doenças degenerativas ou envelhecimento do sistema nervoso. O caracol marinho Aplysia californica é adequado para as investigações de base celular e molecular do comportamento porque circuitos neurais subjacentes a um comportamento específico poderiam ser facilmente determinados e os componentes individuais do circuito poderiam ser facilmente manipulados. Essas vantagens da Aplísia levaram a várias descobertas fundamentais da neurobiologia da aprendizagem e da memória. Aqui descrevemos uma preparação do sistema nervoso da Aplysia para as análises eletrofisiológicas e moleculares dos neurônios individuais. Resumidamente, o gânglio dissecado do sistema nervoso é exposto à protease para remover a baia de gânglio, de modo que os neurônios sejam expostos, mas retenham a atividade neuronal como no animal intacto. Esta preparação é usada para realizar medições eletrofisiológicas de neurônios únicos ou múltiplos. É importante ressaltar que, após o registro utilizando uma metodologia simples, os neurônios poderiam ser isolados diretamente dos gânglios para análise de expressão genética. Esses protocolos foram utilizados para realizar gravações eletrofisiológicas simultâneas de neurônios L7 e R15, estudar sua resposta à acetilcolina e à expressão quantitante do gene CREB1 em neurônios isolados L7, L11, R15 e R2 da Aplysia.
Introduction
O cérebro humano é extraordinariamente complexo com quase 100 bilhões de neurônios e trilhões de conexões sinápticas. Há quase um número igual de células nonneuronas que interagem com neurônios e regulam sua função no cérebro. Os neurônios são organizados em circuitos que regulam comportamentos específicos. Apesar dos avanços em nossa compreensão das funções cerebrais e circuitos neurais, pouco se sabe sobre a identidade dos componentes dos circuitos que controlam um comportamento específico. O conhecimento das identidades de vários componentes de um circuito facilitará muito nossa compreensão da base celular e molecular do comportamento e ajudará no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para distúrbios neuropsiquiátricos.
O caracol marinho Aplysia californica tem sido um cavalo de trabalho para determinar circuitos neuronais subjacentes a comportamentos específicos1-14. O sistema nervoso da Aplysia contém aproximadamente 20.000 neurônios que são organizados em 9 gânglios diferentes. Os neurônios da Aplísia são grandes e podem ser facilmente identificados com base em seu tamanho, propriedades elétricas e posição no gânglio. A Aplysia tem um rico repertório de comportamentos que podem ser estudados. Um dos comportamentos bem estudados é o reflexo de retirada de brânquias (GWR). Os componentes centrais deste reflexo estão situados em gânglios abdominais. Componentes do circuito GWR foram mapeados e contribuições de vários componentes determinados. É importante ressaltar que o circuito GWR sofre aprendizado associativo e não associativo5,6,15-19. Décadas de estudo sobre esse reflexo também identificaram diversas vias de sinalização que têm um papel fundamental na aprendizagem e na memória20-24.
Várias preparações diferentes da Aplysia foram usadas para estudar base celular e molecular do armazenamento de memória. Estes incluem o animal intacto2,3, preparação semi-intacta1,7,13,14,16 e reconstituição dos principais componentes do circuito neural25-29. Uma preparação reduzida para explorar a Aplysia gânglios para as análises eletrofisiológicas e moleculares de circuitos neuronais identificados é descrita aqui. Foram estudados os quatro neurônios identificados a seguir. R15, um neurônio estourando, L7 e L11, dois neurônios motores diferentes e R2, um neurônio colinérgico foram estudados. R2 é o maior neurônio descrito no sistema nervoso invertebrado. Resumidamente, essa metodologia envolve o tratamento protease de gânglios, medidas eletrofisiológicas antes e depois de tratamentos farmacológicos e isolamento de neurônios únicos para análise quantitativa da expressão genética. Essa metodologia nos permite combinar análises moleculares com gravação simultânea de múltiplos neurônios. Esta metodologia foi utilizada com sucesso para estudar respostas de neurônios R15 e L7 à acetilcolina (Ach) por gravações intracelulares emparelhadas. Após medições eletrofisiológicas R15 e L7 e outros neurônios identificados como L11 e R2 foram isolados para análise quantitativa da reação em cadeia de polimerase (qPCR) da expressão do CREB1, fator de transcrição importante para o armazenamento da memória.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de Gânglios Abdominais, Medidas Eletrofisiológicas e Isolamento de Neurônios Identificados Únicos do Gânglio Abdominal da Aplysia californica
- Mantenha a Aplysia no aquário de laboratório com água do mar artificial circulante (ASW) a 16 °C sob 12:12 claras:condições escuras.
- Isolamento do gânglio abdominal.
- Anestesiar animais injetando 380 mM MgCl2 solução por 5-10 min (equivalente a 30-35% do peso corporal do animal).
- Identificar o gânglio abdominal com base em sua posição no sistema nervoso central24,28.
- Remova o gânglio por operação cirúrgica e armazene imediatamente em água do mar artificial composta por 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3e 10 mM HEPES (pH 7.4).
- Tratamento protease.
- Incubar o gânglio abdominal por 30 min a 34 °C±0,5 em uma placa de Petri com 0,1% de protease (dispase) diluída em ASW descrita acima.
NOTA: A quantidade da protease utilizada precisa ser padronizada com a idade e o peso dos animais. Em geral, animais mais velhos e maiores exigiriam mais protease.
- Incubar o gânglio abdominal por 30 min a 34 °C±0,5 em uma placa de Petri com 0,1% de protease (dispase) diluída em ASW descrita acima.
- Remoção da baia de gânglio.
- Após o tratamento enzimante, fixe o gânglio na base de silicone sylgard de uma câmara celular (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) e perfuse com ASW (taxa de fluxo: 150 μl/min) à temperatura ambiente (18 °C±2 ).
NOTA: Para aumentar a visibilidade dos neurônios identificados, coloque o gânglio na parte superior de um cilindro de vidro de policarbonato(Figura 1) (diâmetro Ø= câmara celular modificada de 2 mm) que pode ser facilmente iluminado a partir da parte inferior usando um estereómico binóculo com ampliação de 20X e 40X. - Remova cuidadosamente a bainha do gânglio usando fórceps e microscisores.
- Após o tratamento enzimante, fixe o gânglio na base de silicone sylgard de uma câmara celular (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) e perfuse com ASW (taxa de fluxo: 150 μl/min) à temperatura ambiente (18 °C±2 ).
- Gravação eletrofisiológica simultânea de dois neurônios.
- Identifique neurônio de interesse.
- Empalear o neurônio com uma única microeletrância afiada intracelular com resistência de 10-15 MΩ preenchida com solução de 3 M KCl.
- Registre a atividade neuronal (passe de banda de 10 kHz) usando um sistema de gravação intracelular.
- Processe os dados de gravação usando softwares de eletrofisiologia, como o Axograph.
NOTA: Pode-se facilmente realizar a gravação de múltiplos neurônios. Os neurônios L7, L11 ou R15 e R2 são facilmente identificados com base em sua posição. Dois amplificadores e dois micromanipuladores são necessários para o registro simultanea de dois neurônios L7 e R15(Figura 2).
- Aplicação de drogas.
- Aplique a droga de escolha na câmara celular por tubulação suave ou injete diretamente nos neurônios.
- Realizar medições eletrofisiológicas.
NOTA: Dependendo do objetivo experimental, pode-se medir diferentes parâmetros eletrofisiológicos de neurônios, como as alterações no potencial de membrana (MP) ou potencial de ação (AP) antes, durante e depois da aplicação da droga.
- Isolamento de neurônios únicos.
- Ao final dos experimentos eletrofisiológicos, pare a perfusão do ASW e lave o gânglio com 100% de etanol. A exposição ao etanol petrificará os neurônios e, usando fórceps finos, facilitará a remoção de neurônios individuais sem danificar outros neurônios do gânglio.
- Remova neurônios únicos sob um estereótipo e transfira para um pequeno tubo Eppendorf contendo reagente de extração de RNA gelado de 500 μl. Neurônios únicos isolados podem ser armazenados no reagente de extração de RNA a -80 °C para análise futura.
2. Isolamento de RNA de neurônios únicos e análise de expressão genética por PCR em tempo real quantitativo (qPCR)
- Precauções para minimizar a degradação do RNA:
As ribonucleases (RNases) degradam o RNA e são enzimas muito estáveis e ativas. Tome as seguintes etapas durante o manuseio de RNAs.- Limpe a área de trabalho e os instrumentos com agentes desativadores da RNase.
- Use luvas o tempo todo enquanto manuseia RNA e troque as luvas com frequência.
- Use apenas plásticos livres RNase para lidar com RNAs.
- Isolando o RNA total de neurônios únicos:
- O protocolo Trizol padrão para isolamento de RNA pode ser usado para isolar RNAs de neurônios únicos. Adicione brevemente 20% v/v de clorofórmio ao Trizol, misture bem por um breve vórtice.
- Coloque os tubos no rotador por 10 min a 4 °C. Gire a mistura Trizol-Cloroforme a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
- Pegue a fase aquosa e transfira para um tubo fresco.
- Adicione a solução de acetato de sódio (pH 5.5) a uma concentração final de 0,3 M, 100 ng/ml do coprecipitante GlycoBlue, e 2,5 volumes de 100% de etanol para precipitar RNA.
- Misture bem as amostras e incubar a -80 °C durante a noite.
- Gire as amostras a 12.000 x g por 20 min a 4 °C e uma pequena pelota azul será visível na parte inferior do tubo.
- Retire o supernasce e lave a pelota com 850 μl de 75% de etanol gelado a 12.000 x g por 10 min a 4 °C.
- Remova o supernatante cuidadosamente e seque a pelota de RNA por 7-10 min, no máximo.
NOTA: Certifique-se de que o RNA não é deixado por muito tempo para secar como mais-a secagem da pelota de RNA torna a solubilização muito difícil. - Uma vez seco, resuspenque a pelota de RNA em 10 μl de água livre RNAse e determine a concentração de RNA.
NOTA: Determine a concentração de RNA usando um espectotômetro. Quando não estiver usando imediatamente, armazene o RNA a -80 °C.
- síntese de aRNA de neurônios únicos:
- Amplie o RNA (uma ou duas rodadas dependendo do objetivo experimental) usando sistema de amplificação linear de RNA comercialmente disponível.
NOTA: O RNA total de neurônios únicos variou de ~10-60 ng. O rendimento esperado da primeira rodada de amplificação é de ~100-300 ng e a segunda rodada de amplificação é ~0,8-1,5 μg de RNA.
- Amplie o RNA (uma ou duas rodadas dependendo do objetivo experimental) usando sistema de amplificação linear de RNA comercialmente disponível.
- Transcrição reversa do RNA:
- Para gerar cDNA a partir de aRNA, use 1,0 μg de aRNA em 20 μl de uma reação de transcrição reversa. Vários kits estão disponíveis comercialmente para este fim.
NOTA: o cDNA foi sintetizado de acordo com o protocolo do fabricante usando as seguintes configurações no cicloviário térmico.
5 min a 25 °C
30 min a 42 °C
5 min a 85 °C
Mantenha a 4 °C - Após a etapa de transcrição reversa, armazene o cDNA a -20 °C para armazenamento a longo prazo.
- Para gerar cDNA a partir de aRNA, use 1,0 μg de aRNA em 20 μl de uma reação de transcrição reversa. Vários kits estão disponíveis comercialmente para este fim.
- Design e padronização do primer:
Vários excelentes programas de software estão disponíveis, gratuitamente, para projetar primers para amplificações em tempo real.- Selecione 18-24 mer oligonucleotídeos que produzem amplicons de 70-110 bp e sintetize os primers usando fontes comerciais.
NOTA: Dois a três pares de primer devem ser projetados para cada gene de interesse. Cada conjunto de primer precisa ser padronizado por qPCR. Os pares de primer dianteiro e reverso que foram usados para gene CREB1 (Figura 4) estão abaixo:
Conjunto de primer 1
Atacante: 5'TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3'
Reverso: 5'-ACCGTGAGCAGAGAGTTGTAGA-3'
Conjunto de primer 2
Atacante: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'
Reverso: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAA-3' - Para selecionar o melhor primer a ser usado para as análises a jusante, monitore o valor do TC e a forma da curva de amplificação em qPCR.
NOTA: Os primers que dão valores ct (limiar de ciclo) entre 10-35 na amplificação redonda de 40 rodadas e curvas suaves durante a fase exponencial do PCR seguido de um platô liso são ideais para análises de expressão genética.
- Selecione 18-24 mer oligonucleotídeos que produzem amplicons de 70-110 bp e sintetize os primers usando fontes comerciais.
- PCR em tempo real quantitativo (qPCR):
Nota: Utilize tubos ou placas apropriados compatíveis com a máquina qPCR.- Diluir cDNA para 5x com água livre de nuclease.
- A 2 μl de cDNA diluído, adicione 8 μl de uma mistura mestre qPCR contendo 2 μl de H2O, 5 μl de 2x SYBR Green master mix e 1,0 μl de 10 μM (cada) primer para frente e reverso.
- Feche os tubos e sele a placa após a pipetação cDNA e a mistura mestre. Misture o conteúdo tocando suavemente e girando a 1.500 rpm por 30 segundos.
- Prossiga para a configuração da máquina qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os pesos dos animais utilizados neste estudo variaram de 100 a 200 g. Seguindo os protocolos descritos, realizamos medições eletrofisiológicas e análise molecular de neurônios de gânglios abdominais isolados de animais que variam de 2-5 g a 200-300 g.
A padronização do tratamento protease é importante para medições eletrofisiológicas bem sucedidas de neurônios nos gânglios. Inicialmente, foram utilizadas concentrações e durações de protease múltipla (Dispase) e potenciais de ação de estouro do neurônio R1526,31. Essas medidas foram comparadas ao registro direto (sem tratamento protease) do gânglio intacto. A concentração do protease (0,1% protease, ver passo 1.3) que produziu potenciais estourados que eram comparáveis aos obtidos de gânglio exposto sem protease foram utilizados nos experimentos subsequentes.
Usando o protocolo descrito, foram registrados potenciais de ação (AP) em resposta à exposição de Ach ao R15, um neurônio colinérgico e L7, um neurônio motor que não responde a Ach. Como esperado, gravações eletrofisiológicas simultâneas mostram que Ach induz a despolarização em R15, enquanto não houve alteração no disparo de L7. A Figura 2 mostra a aplicação de Acetilcolina (Ach) diretamente na câmara celular. 1 M Ach (volume 0,3 μl) foi aplicado diretamente na câmara usando micropipette para obter uma concentração final de 1 mM dentro da câmara.
Ach foi lavado do banho por perfusão e registrado novamente a partir de neurônios R15. A Figura 3 mostra formas de onda sugerindo que o efeito Ach é reversível. A análise dos parâmetros AP em controle, durante a despolarização e após a lavagem é mostrada. Durante a despolarização a amplitude é diminuída e a duração da AP aumentou significativamente.
Após medições eletrofisiológicas, os neurônios R15 e L7 foram isolados e as RNAs foram preparadas para análises qPCR. Uma transcrição linear de RNA T7 Polymerase — baseada em MessageAmp II aRNA Amplification Kit de Ambion foi usada para amplificar RNAs de neurônios únicos. Para comparação, também foram estudados os neurônios identificados R2 e L11 e todo o gânglio abdominal adulto (6-9 meses) e animais jovens (1-2 meses de idade). a amplificação qPCR foi realizada em um sistema PCR rápido em tempo real de 7900HT nas seguintes condições: 95 °C para 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C para 15 seg, 60 °C por 1 min. Havia quatro réplicas biológicas no experimento. Cada réplica biológica teve quatro réplicas técnicas no qPCR configurado. Os valores ct de quatro réplicas foram mediados e 1/Ct foi calculado para encontrar o nível absoluto de expressão do CREB1 em cada amostra (Figura 4). Uma estimativa dos níveis absolutos de expressão do gene CREB1 em gânglios de Aplysia jovens e adultos, e em quatro neurônios únicos identificados foi monitorada pelo valor de TC obtido a partir de medições qPCR.
A concentração inicial de mRNA foi a mesma em gânglios abdominais jovens e adultos. O mesmo conjunto de primer CREB1 dianteiro e reverso foi utilizado em todas as qPCRs, tanto em estudos utilizando gânglios e neurônios únicos. Os valores da Tomografia Computadorizada são muito semelhantes entre gânglios abdominais jovens e adultos. Da mesma forma, os valores de TC foram medidos no caso de neurônios únicos onde as concentrações totais de mRNA iniciais eram baixas e duas rodadas de amplificação renderam uma boa quantidade de RNAs para síntese de CDNA. Os valores ct da amplificação CREB1 sugeriram que a expressão CREB1 em neurônios R15 e L7 são comparáveis, enquanto R2 e L11 apresentaram diferenças significativas de expressão quando comparados ao L7 ou R15 (teste T do aluno, p<0,05) (Figura 4).
Figura 1. Estágio de microscópio e sistema de perfusão para eletrofisiologia gânglio. O sistema de perfusão e o estágio foram feitos usando Plexiglas e são transparentes. Esta configuração é montada em um bloco de metal (não mostrado) para manter a posição. O bloco de metal é projetado para que as amostras possam ser iluminadas a partir da parte inferior. Um padrão de estouro eletrofisiológico de amostra registrado a partir do neurônio R15 é mostrado.
Figura 2. Gravação simultânea de L7 e R15 neurônio de gânglios abdominais. (A) Desenho animado de gânglios abdominais mostrando a posição de neurônios L7 e R15 (modificados a partir de Kandel 2001, reimpressos com permissão da AAAS). Também são mostradas as posições de R2 e L11 no gânglio abdominal. (B) Gravações intracelulares representativas de L7 e R15. A seta indica o tempo de aplicação Ach. Pode-se continuar essas medições por 8-10 horas.
Figura 3. Ach induziu alterações no potencial de ação (AP) de R15. As formas de onda AP foram analisadas antes, durante e depois da exposição a Ach. Formas de onda representativas são mostradas. ms: milissegundo, mV: millivolt.
Figura 4. qPCR análise de expressão de CREB1 em gânglios abdominais e neurônios identificados únicos. (A) Quantificação absoluta da transcrição do CREB1 no gânglio abdominal jovem e adulto da Aplysia. O RNA total foi isolado utilizando o protocolo Trizol padrão, conforme descrito nos métodos. 1 μg de RNA total foi usado para sintetizar cDNA, seguido por amplificação PCR em tempo real usando primers CREB1. (B) Quantificação absoluta da transcrição DO CREB1 em neurônios únicos identificados da antiga Aplysia. O RNA total foi submetido a duas rodadas de amplificação in vitro antes da síntese de CDNA. 1 μg de aRNA foi usado para sintetizar cDNA, seguido de amplificação pcr em tempo real usando primers CREB1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O neurônio R15 está envolvido na regulação dos sistemas cardiovascular, digestivo, respiratório e reprodutivo30. Uma atividade de estouro regularmente rítmico do AP é uma característica do R15. Como mostrado na seção de resultados, a gravação emparelhada de R15 e L7 mostra que a preparação de gânglios preservou a atividade dos neurônios R15. Os neurônios R15 e L7 responderam apropriadamente ao Ach. Esta preparação de gânglios poderia ser mantida até 8-10 horas e a atividade eletrofisiológica poderia ser continuamente monitorada. Assim, pode-se estudar os efeitos eletrofisiológicos da breve exposição ao neurotransmissor (exposto localmente a um neurônio específico ou ao banho) por um longo período de tempo. Além disso, pode-se estudar os efeitos da exposição a múltiplos neurotransmissores (simultaneamente ou em conjunto) no mesmo neurônio sobre propriedades de disparo de si mesmo ou do neurônio seguidor ou ambos.
Um exemplo de medições de expressão genética por qPCR é mostrado na Figura 4. Uma vez que o teor de RNA de um único neurônio é baixo, a amplificação in vitro é necessária para obter uma quantidade suficiente de RNA para a expressão quantitante de múltiplos genes. Kits comerciais estão disponíveis para o processo de transcrição in vitro. A amplificação da transcrição do CREB1 foi quantificada diretamente pelo número de ciclos necessários para a obtenção de um sinal de fluorescência padronizado, o Método CT31. O RNA amplificado de um único neurônio é suficiente para que os estudos determinem mudanças na expressão genética em um grande número de genes usando microarray32 e para todo o transcriptome pela RNAseq analisa33.
Uma limitação dessa técnica é que essa preparação pode não preservar todas as conexões sinápticas dos neurônios dos gânglios abdominais. Vários dos neurônios formam sinapses com neurônios em outros gânglios e na preparação de gânglios essas conexões de longa distância serão perdidas. No entanto, a metodologia aqui descrita poderia ser facilmente modificada para incluir toda a CNS ou poderia ser facilmente integrada à preparação semi-intacta13,14,16 que foi descrita para estudar alterações celulares e eletrofisiológicas no reflexo de abstinência de brânquias e sifão.
Os recentes avanços nas técnicas de genômica agora nos permitem obter uma visão profunda da dinâmica de expressão da codificação e não codificação RNAs34. A preparação reduzida descrita aqui é ideal para estudar alterações temporais da expressão genética em conjunto com medições eletrofisiológicas. Por exemplo, pode-se aplicar agentes farmacológicos e medir seus efeitos sobre propriedades elétricas de neurônios individuais ou múltiplos neurônios que fazem parte do mesmo circuito neural e isolar neurônios individuais em momentos diferentes para o isolamento do RNA. O efeito da manipulação de um único neurônio (como estimulação elétrica, ou exposições a agentes farmacológicos) em todo o circuito identificado poderia ser estudado no nível de mudanças na expressão de genes específicos em neurônios únicos. Assim, essa metodologia facilita a integração bem-sucedida de metodologias eletrofisiológicas e genômicas para estudar circuitos neurais na Aplísia.
Essa abordagem poderia ser facilmente estendida ao estudo de outros modelos invertebrados, como o molusco nudibranch Tritonia, o caracol da lagoa Lymnaea e o caracol terrestre Helix cujos sistemas nervosos contêm vários neurônios identificados35-57. Esses modelos também são amplamente utilizados para o estudo do controle neural de comportamentos como natação de fuga, orientação de campo magnético, formação de sinapse, aprendizado e armazenamento de memória. A metodologia que descrevemos é uma simples integração da análise genômica com medições fisiológicas da atividade neuronal a nível único celular. Uma visão mais profunda sobre a base molecular e fisiológica do controle neural do comportamento poderia ser obtida a partir de tais estudos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos sinceramente à Fundação Whitehall por seu apoio ao financiamento e fundos de startup do Scripps Research Institute para a realização deste trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aplysia | National Aplysia Resource Facility, University of Miami | ||
| NaCl | SIGMA | S 3014-1KG | |
| KCl | SIGMA | P 9333-500G | |
| CaCl2•2H2O | SIGMA | C5080- 500G | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP 214-501 | |
| NaHCO4 | SIGMA | S 6297-250G | |
| HEPES | SIGMA | H 3375-500G | |
| Protease | GIBCO | 17105-042 | |
| Trizol | Ambion | 15596-026 | |
| Chloroform | MP Biomedicals | 2194002 | |
| 100% Ethanol | ACROS | 64-17-5 | |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| 3 M NaOAc, pH 5.5 | Ambion | AM9740 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9737 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion | AM1751 | |
| qScript cDNA SuperMix | Quanta Biosciences | 95048-100 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stainless Steel Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 or | |
| 26002-20 | |||
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | Veriti Thermal Cycler | |
| 5430R Centrifuge | Eppendorf | 5430R Centrifuge | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | 7900HT Fast Real-Time PCR | |
| Amplifier | BRAMP-01R | NPI Electronics | |
| Digidata Converter | Instrutech ITC-18 | HEKA ELEKTRONIK | |
| Micro Manipulator | Patch Star | Scientifica |
References
- Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
- Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
- Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
- Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
- Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
- Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
- Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
- Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
- Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
- McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
- McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
- Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
- Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
- Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
- Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
- Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
- Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
- Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
- Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
- Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
- Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
- Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
- Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
- Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
- Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
- Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
- Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
- Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
- Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
- Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
- Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
- Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
- Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
- Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
- Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
- Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
- Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
- Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O'Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
- Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
- Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
- Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
- Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
- Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
- McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
- Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
- Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
- Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
- Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
- Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
- Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
- Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
- Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
- Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).
