Summary
L’escargot marin Aplysia californica a été largement utilisé comme modèle de neurobiologie pour les études sur la base cellulaire et moléculaire du comportement. Ici, une méthodologie est décrite pour explorer le système nerveux d’Aplysia pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones uniques de circuits neuronaux identifiés.
Abstract
Un défi majeur en neurobiologie est de comprendre les fondements moléculaires des circuits neuronaux qui régissent un comportement spécifique. Une fois que les mécanismes moléculaires spécifiques sont identifiés, de nouvelles stratégies thérapeutiques peuvent être développées pour traiter les anomalies dans des comportements spécifiques causés par des maladies dégénératives ou le vieillissement du système nerveux. L’escargot marin Aplysia californica est bien adapté aux investigations de la base cellulaire et moléculaire du comportement parce que les circuits neuronaux sous-jacents à un comportement spécifique pourraient être facilement déterminés et les composants individuels des circuits pourraient être facilement manipulés. Ces avantages de l’Aplysia ont conduit à plusieurs découvertes fondamentales de la neurobiologie de l’apprentissage et de la mémoire. Ici, nous décrivons une préparation du système nerveux d’Aplysia pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires des neurones individuels. En bref, le ganglion disséqué du système nerveux est exposé à la protéase pour enlever la gaine ganglionnaire de telle sorte que les neurones soient exposés mais conservent l’activité neuronale comme chez l’animal intact. Cette préparation est utilisée pour effectuer des mesures électrophysiologiques de neurones simples ou multiples. Il est important de noter qu’après l’enregistrement à l’aide d’une méthodologie simple, les neurones pourraient être isolés directement des ganglions pour l’analyse de l’expression génique. Ces protocoles ont été utilisés pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques simultanés à partir de neurones L7 et R15, étudier leur réponse à l’acétylcholine et quantifier l’expression du gène CREB1 dans des neurones L7, L11, R15 et R2 uniques isolés d’Aplysia.
Introduction
Le cerveau humain est extraordinairement complexe avec près de 100 milliards de neurones et des billions de connexions synaptiques. Il existe un nombre presque égal de cellules non neuroneuronales qui interagissent avec les neurones et régulent leur fonction dans le cerveau. Les neurones sont organisés en circuits qui régulent des comportements spécifiques. Malgré les progrès réalisés dans notre compréhension des fonctions cérébrales et des circuits neuronaux, on sait peu de choses sur l’identité des composants des circuits qui contrôlent un comportement spécifique. La connaissance des identités de divers composants d’un circuit facilitera grandement notre compréhension de la base cellulaire et moléculaire du comportement et aidera à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les troubles neuropsychiatriques.
L’escargot marin Aplysia californica a été un cheval de bataille pour déterminer les circuits neuronaux sous-jacents à des comportements spécifiques1-14. Le système nerveux d’Aplysia contient environ 20 000 neurones qui sont organisés en 9 ganglions différents. Les neurones de l’Aplysia sont grands et peuvent être facilement identifiés en fonction de leur taille, propriétés électriques, et la position dans les ganglions. Aplysia a un riche répertoire de comportements qui peuvent être étudiés. L’un des comportements bien étudiés est le réflexe de retrait des branchies (GWR). Les composants centraux de ce réflexe sont situés dans les ganglions abdominaux. Les composantes des circuits de la régression pondérée géographiquement ont été cartographiées et les contributions de divers composants ont été déterminées. Il est important de faire en charge les circuits de régression pondérée géographiquement par5,6,15-19. Des décennies d’étude sur ce réflexe ont également identifié plusieurs voies de signalisation qui ont un rôle clé dans l’apprentissage et la mémoire20-24.
Plusieurs préparations différentes d’Aplysia ont été employées pour étudier la base cellulaire et moléculaire du stockage de mémoire. Il s’agit notamment de l’animal intact2,3,de la préparation semi-intacte1,7,13,14,16 et de la reconstitution des principaux composants des circuits neuronaux25-29. Une préparation réduite pour explorer des ganglions d’aplysie pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires des circuits neuronaux identifiés est décrite ici. Les quatre neurones identifiés suivants ont été étudiés. R15, un neurone éclatant, L7 et L11, deux neurones moteurs différents et R2, un neurone cholinergique ont été étudiés. R2 est le plus grand neurone décrit dans le système nerveux des invertébrés. En bref, cette méthodologie implique le traitement de la protéase des ganglions, des mesures électrophysiologiques avant et après les traitements pharmacologiques, et l’isolement des neurones simples pour l’analyse quantitative de l’expression des gènes. Cette méthodologie nous permet de combiner des analyses moléculaires avec l’enregistrement simultané de plusieurs neurones. Cette méthodologie a été avec succès employée pour étudier des réponses des neurones R15 et L7 à l’acétylcholine (Ach) par les enregistrements intracellulaires appariés. Après des mesures électrophysiologiques R15 et L7 et d’autres neurones identifiés tels que L11 et R2 ont été isolés pour l’analyse quantitative de l’amplification en chaîne par réaction (qPCR) de l’expression de CREB1, un facteur de transcription important pour le stockage de mémoire.
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Protocol
1. Préparation des ganglions abdominaux, mesures électrophysiologiques et isolement de neurones identifiés uniques à partir du ganglion abdominal d’Aplysia californica
- Maintenir Aplysia dans l’aquarium de laboratoire avec de l’eau de mer artificielle circulante (ASW) à 16 °C dans des conditions claires:sombres à 12:12.
- Isolement de ganglion abdominal.
- Anesthésier les animaux en injectant une solution de MgCl2 de 380 mM pendant 5 à 10 minutes (équivalent à 30 à 35% du poids corporel de l’animal).
- Identifier le ganglion abdominal en fonction de sa position dans le système nerveux central24,28.
- Enlever les ganglions par opération chirurgicale et les stocker immédiatement dans de l’eau de mer artificielle composée de 450 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 10 mM deCaCl2,55 mMMgCl2,2,5 mM de NaHCO3 et 10 mM d’HEPES (pH 7,4).
- Traitement de la protéase.
- Incuber un ganglion abdominal pendant 30 min à 34 °C±0,5 dans une boîte de Petri avec de la protéase à 0,1 % (dispase) diluée dans de l’ASW décrit ci-dessus.
REMARQUE: La quantité de protéase utilisée doit être normalisée en avec l’âge et le poids des animaux. En général, les animaux plus âgés et plus gros auraient besoin de plus de protéase.
- Incuber un ganglion abdominal pendant 30 min à 34 °C±0,5 dans une boîte de Petri avec de la protéase à 0,1 % (dispase) diluée dans de l’ASW décrit ci-dessus.
- Enlèvement de gaine de ganglions.
- Après le traitement enzymatique, épinglez les ganglions à la base en silicone Sylgard d’une chambre cellulaire (Ø = 1 cm; vol. = 0,3 ml) et perfuser avec de l’ASW (débit: 150 μl/min) à température ambiante (18 °C±2).
REMARQUE: Afin d’augmenter la visibilité des neurones identifiés, placez le ganglion sur le dessus d’un cylindre en verre polycarbonate(Figure 1)(diamètre Ø = chambre cellulaire modifiée de 2 mm) qui peut être facilement éclairé par le bas à l’aide d’un stéréomicroscope binoculaire à grossissement 20X et 40X. - Retirez soigneusement la gaine du ganglion à l’aide de pinces et de microscisseurs.
- Après le traitement enzymatique, épinglez les ganglions à la base en silicone Sylgard d’une chambre cellulaire (Ø = 1 cm; vol. = 0,3 ml) et perfuser avec de l’ASW (débit: 150 μl/min) à température ambiante (18 °C±2).
- Enregistrement électrophysiologique simultané de deux neurones.
- Identifier le neurone d’intérêt.
- Empaler le neurone avec une seule microélectrode pointue intracellulaire avec une résistance 10-15 MΩ remplie d’une solution de KCl 3 M.
- Enregistrer l’activité neuronale (passe de bande de 10 kHz) à l’aide d’un système d’enregistrement intracellulaire.
- Traiter les données d’enregistrement à l’aide d’un logiciel d’électrophysiologie tel qu’Axograph.
REMARQUE: On peut facilement effectuer l’enregistrement de plusieurs neurones. Les neurones L7, L11 ou R15 et R2 sont facilement identifiables en fonction de leur position. Deux amplificateurs et deux micromanipulateurs sont nécessaires pour enregistrer simultanément à partir de deux neurones L7 et R15(Figure 2).
- Demande de médicament.
- Appliquer le médicament de choix dans la chambre cellulaire par pipetage doux ou injecter directement dans les neurones.
- Effectuer des mesures électrophysiologiques.
REMARQUE: Selon l’objectif expérimental, on pourrait mesurer différents paramètres électrophysiologiques des neurones tels que les changements de potentiel membranaire (MP) ou de potentiel d’action (AP) avant, pendant et après l’application du médicament.
- Isolement des neurones uniques.
- À la fin des expériences électrophysiologiques, arrêtez la perfusion d’ASW et lavez le ganglion avec de l’éthanol à 100%. L’exposition à l’éthanol pétrifiera les neurones et, à l’aide d’une pince fine, facilitera l’enlever des neurones individuels sans endommager d’autres neurones du ganglion.
- Retirez les neurones simples sous un stéréomicroscope et transférez-les dans un petit tube Eppendorf contenant un réactif d’extraction d’ARN glacé de 500 μl. Des neurones isolés peuvent être stockés dans un réactif d’extraction d’ARN à -80 °C pour une analyse future.
2. Isolement de l’ARN à partir de neurones uniques et analyse de l’expression génique par PCR quantitative en temps réel (qPCR)
- Précautions à prendre pour minimiser la dégradation de l’ARN :
Les ribonucléèses (RNases) dégradent l’ARN et sont des enzymes très stables et actives. Suivez les étapes suivantes lors de la gestion des ARN.- Nettoyez la zone de travail et les instruments avec des agents de désactivation RNase.
- Portez des gants en tout temps tout en manipulant l’ARN et changez souvent de gants.
- Utilisez uniquement des plastiques sans RNase pour manipuler les ARN.
- Isoler l’ARN total des neurones simples:
- Le protocole standard trizol pour l’isolement de l’ARN peut être utilisé pour isoler les ARN à partir de neurones uniques. Ajouter brièvement 20% v/v de chloroforme à Trizol, bien mélanger par un bref vortex.
- Placer les tubes sur rotateur pendant 10 min à 4 °C. Faire tourner le mélange Trizol-Chloroforme à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Recueillir la phase aqueuse et le transférer dans un tube frais.
- Ajouter une solution d’acétate de sodium (pH 5,5) à une concentration finale de 0,3 M, 100 ng/ml du coprecipitant GlycoBlue et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % pour précipiter l’ARN.
- Bien mélanger les échantillons et incuber à -80 °C pendant la nuit.
- Faites tourner les échantillons à 12 000 x g pendant 20 min à 4 °C et une petite pastille bleue sera visible au fond du tube.
- Retirer le surnageant et laver le culot avec 850 μl d’éthanol glacé à 75 % à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Retirez soigneusement le surnageant et séchez à l’air la pastille d’ARN pendant 7-10 min, maximum.
REMARQUE: Assurez-vous que l’ARN n’est pas laissé longtemps à sécher comme plus- leséchage de la pastille d’ARN rend la solubilisation très difficile. - Une fois séché, ressusciter la pastille d’ARN dans 10 μl d’eau exempte de RNAse et déterminer la concentration d’ARN.
REMARQUE: Déterminer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre. Lorsque vous n’utilisez pas immédiatement, stockez l’ARN à -80 °C.
- Synthèse de l’ARN à partir de neurones uniques :
- Amplifier l’ARN (un ou deux tours selon l’objectif expérimental) en utilisant un système d’amplification linéaire de l’ARN disponible dans le commerce.
REMARQUE: L’ARN total des neurones simples variait de ~ 10-60 ng. Le rendement attendu du premier cycle d’amplification est d’environ 100-300 ng et le deuxième cycle d’amplification est d’environ 0,8-1,5 μg d’ARN.
- Amplifier l’ARN (un ou deux tours selon l’objectif expérimental) en utilisant un système d’amplification linéaire de l’ARN disponible dans le commerce.
- Transcription inverse de l’ARN :
- Pour générer de l’ADNc à partir d’ARN, utilisez 1,0 μg d’ARN dans 20 μl d’une réaction de transcription inverse. Plusieurs kits sont disponibles dans le commerce à cet effet.
REMARQUE: L’ADNc a été synthétisé selon le protocole du fabricant en utilisant les paramètres suivants sur le cycleur thermique.
5 min à 25 °C
30 min à 42 °C
5 min à 85 °C
Maintenir à 4 °C - Après l’étape de transcription inverse, stockez l’ADNc à -20 °C pour un stockage à long terme.
- Pour générer de l’ADNc à partir d’ARN, utilisez 1,0 μg d’ARN dans 20 μl d’une réaction de transcription inverse. Plusieurs kits sont disponibles dans le commerce à cet effet.
- Conception et normalisation de l’apprêt :
Plusieurs excellents logiciels sont disponibles, gratuitement, pour concevoir des amorces pour des amplifications en temps réel.- Sélectionnez 18 à 24 oligonucléotides mer qui produisent des amplicons de 70 à 110 pb et synthétisez les amorces à l’aide de sources commerciales.
REMARQUE : Deux à trois paires d’amorces doivent être conçues pour chaque gène d’intérêt. Chaque ensemble d’amorces doit être normalisé par qPCR. Les paires d’amorces avant et arrière qui ont été utilisées pour le gène CREB1 (Figure 4) sont ci-dessous :
Jeu d’amorces 1
Avant: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3'
Revers : 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
Jeu d’amorces 2
Avant: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'
Inverse: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3' - Pour sélectionner la meilleure amorce à utiliser pour les analyses en aval, surveillez la valeur Ct et la forme de la courbe d’amplification en qPCR.
REMARQUE: Les amorces qui donnent des valeurs Ct (seuil de cycle) comprises entre 10 et 35 dans l’amplification ronde 40 et des courbes lisses pendant la phase exponentielle de la PCR suivie d’un plateau lisse sont optimales pour les analyses d’expression génique.
- Sélectionnez 18 à 24 oligonucléotides mer qui produisent des amplicons de 70 à 110 pb et synthétisez les amorces à l’aide de sources commerciales.
- PCR quantitative en temps réel (qPCR) :
Remarque : Utilisez des tubes ou des plaques appropriés compatibles avec la machine qPCR.- Diluer l’ADNc à 5x avec de l’eau sans nucléase.
- À 2 μl d’ADNc dilué, ajouter 8 μl d’un mélange maître qPCR contenant 2 μl deH2O,5 μl de 2x mélange maître SYBR Green et 1,0 μl de 10 μM (chacun) d’amorce avant et arrière.
- Fermez les tubes et scellez la plaque après avoir pipeté l’ADNc et le mélange maître. Mélanger le contenu en tapotant doucement et en tournant vers le bas à 1 500 tr / min pendant 30 secondes.
- Passez à la configuration de la machine qPCR.
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Representative Results
Le poids des animaux utilisés dans cette étude variait de 100 à 200 g. Suivant les protocoles décrits, nous avons effectué des mesures électrophysiologiques et l’analyse moléculaire des neurones des ganglions abdominaux isolés chez les animaux s’étendant de 2-5 g à 200-300 g.
La normalisation du traitement de protéase est importante pour des mesures électrophysiologiques réussies des neurones dans les ganglions. Initialement, des concentrations et des durées multiples de protéase (Dispase) ont été employées et des potentiels d’action d’éclatement du neurone R15 ont été enregistrés26,31. Ces mesures ont été comparées à l’enregistrement direct (sans traitement de protéase) des ganglions intacts. La concentration de la protéase (protéase à 0,1%, voir étape 1.3) qui a produit des potentiels d’éclatement comparables à ceux obtenus à partir d’un ganglion exposé sans protéase a été utilisée dans les expériences ultérieures.
Utilisant le protocole décrit, des potentiels d’action (AP) en réponse à l’exposition d’Ach à R15, un neurone cholinergique et à L7, un neurone moteur qui ne répond pas à Ach ont été enregistrés. Comme prévu, les enregistrements électrophysiologiques simultanés montrent qu’Ach induit la dépolarisation dans R15 alors qu’il n’y avait aucun changement dans le tir de L7. La figure 2 montre l’application de l’acétylcholine (Ach) directement dans la chambre cellulaire. 1 M Ach (volume 0,3 μl) a été directement appliqué dans la chambre à l’aide d’une micropipette afin d’obtenir une concentration finale de 1 mM à l’intérieur de la chambre.
L’Ach a été lavé du bain par perfusion et enregistré de nouveau des neurones R15. La figure 3 montre des formes d’onde suggérant que l’effet Ach est réversible. L’analyse des paramètres AP en contrôle, lors de la dépolarisation et après lavage est montrée. Pendant la dépolarisation, l’amplitude est diminuée et la durée de l’AP augmentée de manière significative.
Après des mesures électrophysiologiques, des neurones R15 et L7 ont été isolés et des ARN ont été préparés pour des analyses de qPCR. Une transcription linéaire pilotée par l’ARN polymérase T7 à l’aide du kit d’amplification de l’ARN MessageAmp II d’Ambion a été utilisée pour amplifier les ARN à partir de neurones uniques. À titre de comparaison, les neurones identifiés R2 et L11 et les ganglions abdominaux entiers de l’adulte (6-9 mois) et des jeunes animaux (1-2 mois) ont été également étudiés. L’amplification qPCR a été réalisée dans un système de PCR rapide en temps réel 7900HT dans les conditions suivantes: 95 °C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de 95 °C pendant 15 secondes, 60 °C pendant 1 min. Il y a eu quatre répétitions biologiques dans l’expérience. Chaque répétition biologique avait quatre répétitions techniques dans le qPCR mis en place. La moyenne des valeurs ct de quatre répétitions a été calculée et 1/Ct a été calculé pour trouver le niveau d’expression absolu de CREB1 dans chaque échantillon(figure 4). Une estimation des niveaux absolus d’expression du gène CREB1 dans les ganglions jeunes et adultes d’Aplysia, et dans quatre neurones simples identifiés a été surveillée par la valeur de Ct obtenue à partir des mesures de qPCR.
La concentration de départ d’ADN messagère était identique dans les ganglions abdominaux jeunes et adultes. Le même ensemble d’amorces CREB1 avant et arrière a été utilisé dans tous les qPCRs, à la fois dans les études utilisant des ganglions et des neurones simples. Les valeurs de Ct sont très semblables entre les ganglions abdominaux jeunes et adultes. De même, des valeurs de Ct ont été mesurées dans le cas des neurones simples où les concentrations totales de départ d’ADN messagère étaient basses et deux tours d’amplification ont rapporté une bonne quantité d’ARN pour la synthèse de cDNA. Les valeurs ct de l’amplification CREB1 ont suggéré que l’expression CREB1 dans les neurones R15 et L7 sont comparables tandis que R2 et L11 ont montré des différences significatives dans l’expression par rapport à L7 ou R15 (test T de Student, p<0,05) (Figure 4).
Figure 1. Étape de microscope et système de perfusion pour l’électrophysiologie des ganglions. Le système et le stade de perfusion ont été fabriqués à l’aide de plexiglas et sont transparents. Cette configuration est montée sur un bloc métallique (non représenté) pour maintenir la position. Le bloc métallique est conçu de manière à ce que les échantillons puissent être éclairés par le bas. Un modèle de rupture électrophysiologique d’échantillon enregistré du neurone R15 est montré.
Figure 2. Enregistrement simultané du neurone L7 et R15 des ganglions abdominaux. (A) Dessin animé de ganglions abdominaux montrant la position des neurones L7 et R15 (modifié à partir de Kandel 2001, réimprimé avec la permission de l’AAAS). Sont également montrées les positions de R2 et L11 dans les ganglions abdominaux. (B) Enregistrements intracellulaires représentatifs de L7 et R15. La flèche indique l’heure de l’application Ach. On pourrait continuer ces mesures pendant 8-10 heures.
Figure 3. Ach a induit des changements du potentiel d’action (AP) de R15. Des formes d’onde AP ont été analysées avant, pendant et après l’exposition d’Ach. Des formes d’onde représentatives sont affichées. ms: milliseconde, mV: millivolt.
Figure 4. Analyse de qPCR de l’expression de CREB1 dans les ganglions abdominaux et les neurones identifiés simples. (A) Quantification absolue de la transcription CREB1 dans les ganglions abdominaux jeunes et adultes de l’aplysie. L’ARN total a été isolé à l’aide du protocole standard trizol tel que décrit dans les méthodes. 1 μg d’ARN total a été utilisé pour synthétiser l’ADNc, suivi d’une amplification par PCR en temps réel à l’aide d’amorces CREB1. (B) Quantification absolue de la transcription CREB1 dans les neurones uniques identifiés de l’ancienne Aplysia. L’ARN total a été soumis à deux tours d’amplification in vitro avant la synthèse de cDNA. 1 μg d’ARN a été utilisé pour synthétiser l’ADNc, suivi d’une amplification par PCR en temps réel à l’aide d’amorces CREB1.
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Discussion
Le neurone R15 est impliqué dans la régulation des systèmes cardiovasculaire, digestif, respiratoire et reproducteur30. Une activité d’éclatement régulièrement rythmique de l’AP est une caractéristique de R15. Comme le montre la section des résultats, l’enregistrement apparié de R15 et L7 montre que la préparation des ganglions a préservé l’activité des neurones R15. Les neurones R15 et L7 ont répondu convenablement à Ach. Cette préparation de ganglions a pu être maintenue jusqu’à 8-10 heures et l’activité électrophysiologique a pu être continuellement surveillée. Ainsi, on pourrait étudier les effets électrophysiologiques d’une brève exposition de neurotransmetteurs (exposé localement à un neurone spécifique ou au bain) pendant une longue période de temps. En outre, on pourrait étudier les effets de l’exposition à plusieurs neurotransmetteurs (simultanément ou en tandem) sur le même neurone sur les propriétés de tir de lui-même ou le neurone suiveur ou les deux.
Un exemple de mesures d’expression génique par qPCR est illustré à la figure 4. Étant donné que la teneur en ARN d’un seul neurone est faible, une amplification in vitro est nécessaire pour obtenir une quantité suffisante d’ARN pour quantifier l’expression de plusieurs gènes. Des kits commerciaux sont disponibles pour le processus de transcription in vitro. L’amplification de la transcription CREB1 a été quantifiée directement par le nombre de cycles nécessaires pour obtenir un signal de fluorescence standardisé, la méthode Ct31. L’ARN amplifié d’un seul neurone est suffisant pour que les études déterminent les changements d’expression génique dans un grand nombre de gènes à l’aide du microréseau32 et pour l’ensemble du transcriptome par les analyses RNAseq33.
Une limitation de cette technique est que cette préparation peut ne pas préserver toutes les connexions synaptiques des neurones des ganglions abdominaux. Plusieurs des neurones forment des synapses avec des neurones dans d’autres ganglions et dans la préparation des ganglions, ces connexions à longue distance seront manquées. Cependant, la méthodologie décrite ici pourrait être facilement modifiée pour inclure l’ensemble du SNC ou pourrait être facilement intégrée à la préparation semi-intacte13,14,16 qui a été décrite pour étudier les changements cellulaires et électrophysiologiques dans le réflexe de retrait des branchies et des siphons.
Les progrès récents des techniques génomiques nous permettent maintenant d’obtenir un aperçu approfondi de la dynamique d’expression des ARN codants et non codants34. La préparation réduite qui est décrite ici est idéale pour étudier les changements temporels de l’expression des gènes en conjonction avec des mesures électrophysiologiques. Par exemple, on pourrait appliquer des agents pharmacologiques et mesurer leurs effets sur les propriétés électriques de neurones individuels ou de neurones multiples qui font partie du même circuit neuronal et isoler des neurones individuels à différents moments pour l’isolement de l’ARN. L’effet de la manipulation d’un seul neurone (comme la stimulation électrique, ou l’exposition à des agents pharmacologiques) sur l’ensemble des circuits identifiés pourrait être étudié au niveau des changements dans l’expression de gènes spécifiques dans des neurones uniques. Ainsi, cette méthodologie facilite l’intégration réussie des méthodologies électrophysiologiques et génomiques pour étudier les circuits neuronaux dans Aplysia.
Cette approche pourrait être facilement étendue à l’étude d’autres modèles d’invertébrés tels que le mollusque nudibranche Tritonia, l’escargot d’étang Lymnaea et l’escargot terrestre Helix dont le système nerveux contient plusieurs neurones identifiés35-57. Ces modèles sont également largement utilisés pour l’étude du contrôle neuronal de comportements tels que la natation d’échappement, l’orientation du champ magnétique, la formation de synapses, l’apprentissage et le stockage de la mémoire. La méthodologie que nous avons décrite est une simple intégration de l’analyse génomique avec des mesures physiologiques de l’activité neuronale au niveau unicellulaire. Un aperçu plus profond de la base moléculaire et physiologique du contrôle neuronal du comportement pourrait être obtenu de telles études.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions sincèrement la Fondation Whitehall pour son soutien financier et les fonds de démarrage du Scripps Research Institute pour la réalisation de ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aplysia | National Aplysia Resource Facility, University of Miami | ||
| NaCl | SIGMA | S 3014-1KG | |
| KCl | SIGMA | P 9333-500G | |
| CaCl2•2H2O | SIGMA | C5080- 500G | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP 214-501 | |
| NaHCO4 | SIGMA | S 6297-250G | |
| HEPES | SIGMA | H 3375-500G | |
| Protease | GIBCO | 17105-042 | |
| Trizol | Ambion | 15596-026 | |
| Chloroform | MP Biomedicals | 2194002 | |
| 100% Ethanol | ACROS | 64-17-5 | |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| 3 M NaOAc, pH 5.5 | Ambion | AM9740 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9737 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion | AM1751 | |
| qScript cDNA SuperMix | Quanta Biosciences | 95048-100 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stainless Steel Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 or | |
| 26002-20 | |||
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | Veriti Thermal Cycler | |
| 5430R Centrifuge | Eppendorf | 5430R Centrifuge | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | 7900HT Fast Real-Time PCR | |
| Amplifier | BRAMP-01R | NPI Electronics | |
| Digidata Converter | Instrutech ITC-18 | HEKA ELEKTRONIK | |
| Micro Manipulator | Patch Star | Scientifica |
References
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