Summary
Een kwantitatief spontane migratie van cellen te bestuderen in een eendimensionale beperkte micro beschreven. Deze methode maakt gebruik van microfabricated kanalen en kan worden gebruikt om de migratie van grote aantallen cellen te bestuderen onder verschillende omstandigheden in enkele experimenten.
Abstract
De hier beschreven methode maakt de studie van celmigratie onder opsluiting in een dimensie. Het is gebaseerd op het gebruik van microfabricated kanalen, die een gepolariseerde fenotype opleggen cellen door fysieke beperkingen. Eenmaal binnen kanalen, cellen hebben slechts twee mogelijkheden: vooruit of achteruit. Deze vereenvoudigde migratie waarbij gerichtheid beperkt vergemakkelijkt het automatisch volgen van cellen en de extractie van kwantitatieve parameters naar cel beweging te beschrijven. Deze parameters omvatten cel snelheid, veranderingen in richting en pauzes tijdens beweging. Microkanalen zijn ook compatibel met het gebruik van fluorescente merkers en zijn daarom geschikt voor lokalisatie van intracellulaire organellen en structuren bestudeerd worden celmigratie met hoge resolutie. Tenslotte kan het oppervlak van de kanalen worden gefunctionaliseerd met verschillende substraten, zodat de controle van de hechting van de kanalen of de studie van haptotaxis. Kortom, het stelsel here beschreven is bedoeld om de migratie van grote celaantallen analyseren omstandigheden waarin zowel de geometrie en de biochemische aard van de omgeving worden geregeld, de normalisatie en reproduceerbaarheid onafhankelijke experimenten vergemakkelijken.
Introduction
Migratie is een complexe cellulaire functie is belangrijk voor veel fysiologische processen in multicellulaire organismen, zoals ontwikkeling, immuunresponsen en weefselregeneratie. Bovendien zijn bepaalde pathologische situaties zoals tumor invasie en metastase afhankelijk celmotiliteit 1. Daarom is celmigratie een belangrijke vakgebied in de context van zowel fundamenteel en translationeel onderzoek. In vivo, worden de meeste weefsels gekenmerkt door een rijke extracellulaire matrix en hoge celdichtheid. Celmigratie derhalve onder fysiologische omstandigheden treedt in complexe afgesloten omgeving. Klassiek, waarschijnlijk te wijten aan historische redenen en technische grenzen, cel migratie is onderzocht in platte 2D-systemen die niet veel van de milieu eigenschappen gevonden in weefsels, zoals opsluiting niet reproduceren. Bovendien factoren celadhesie, die essentieel zijn voor motiliteit in 2D zijn, zijn onlangs bleek niet noodzakelijkerwijs teRily vereist voor migratie in vivo of in gels, wat suggereert dat de mechanismen die cel motoriek regeren in 2D en in andere omgevingen zijn te onderscheiden 2. Verschillende systemen zijn ontwikkeld om de complexe eigenschappen van weefsels, de bekendste wezen collageen gels, die erop gericht indient de eigenschappen van de extracellulaire matrix samenstelling 3 nabootsen. Microchannels Hier stellen we als een eenvoudige aanvullende methode die de studie cel migratie in een dimensie maakt het mogelijk onder een afgesloten omgeving.
In dit systeem migreren cellen langs microkanalen waarin ze binnenkomen spontaan. Migrerende cellen vervolgens te verwerven van de vorm van de kanalen, de aanneming van een buisvormige geometrie die het meest waarschijnlijk versterkt hun polariteit. De lineaire beweging van de cellen in de kanalen kan automatisch cell tracking en extractie van kwantitatieve parameters experimenten. Vanuit technisch oogpunt, dit systeem is eenvoudig en flexibel. De coating de kanaalwanden kan worden gemanipuleerd, de grootte en de vorm van de kanalen worden aangepast, en een groot aantal cellen in enkele experimenten worden geanalyseerd. Dit systeem kan ook worden opgeschaald tot middellange afstand zeefanalyse van moleculen betrokken bij celbeweeglijkheid voeren. De hier beschreven protocol is gestandaardiseerd op basis van dendritische cellen (DC) als een cellulair model. Deze cellen zijn essentieel voor het immuunsysteem zij deelnemen aan de initiatie en handhaving van specifieke immuunresponsen 4. In vitro is aangetoond DC spontaan migreren begrensde omgevingen en dus een goed model motiliteit van cellen te bestuderen in microkanalen 5,6 . Belangrijk, kan dit systeem worden uitgebreid tot migratie van andere beweeglijke celtype als T-lymfocyten, neutrofielen of tumorcellen 7-9 analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Belangrijke opmerking: Dit protocol wordt ervan uitgegaan dat de mal met de vorm voor de gewenste microkanalen is al gemaakt. Nadere informatie over de voorbereiding van de mal is reeds gepubliceerd 10. Dit protocol wordt ook aangenomen dat het beenmerg DCs cultuur is bekend.
1. Chip Fabrication
- Meng PDMS olie en verharder in een gewichtsverhouding 10:01 in een plastic beker. Meng beide verbindingen grondig.
- Wierp de mix over de mal lager microkanalen. De totale hoogte moet tussen 0.5-1 cm.
- Verwijder luchtbellen in een vacuüm pot klok gedurende 1 uur.
- Harden PDMS in de matrijs door het plaatsen daarvan in een oven gedurende 2 uur bij 65 ° C.
- Zodra de PDMS is bij kamertemperatuur, snijd een groot stuk rond de constructie met een chirurgisch mes en afschilferen van de matrijs (figuur 1A).
- Boor gaten waar de cellen worden geïnjecteerd (normaal 2 mm) en het formaat van de PDMSmet een chirurgisch mes om de grootte te passen aan glazen bodem gerechten waarin migratie zal worden beoordeeld (Figuur 1B). Voordat u verder gaat, verwijder reststof uit de schaal met behulp lensreinigingspapier. Dit bevordert de binding van PDMS aan glas in stap 1.10 beschreven.
- Reinig de verkleind PDMS chip met de kanalen door steken en peeling plakband op de structuur zijkanten.
- Ultrasone trillingen het PDMS stuks 30 sec in 70% ethanol aan stof en kleine PDMS deeltjes te verwijderen. Droog ze daarna snel door te blazen schone lucht.
- Activeer de PDMS (structuren boven) en cultuur gerechten door de lucht (of zuurstof) plasma behandeling gedurende 30 seconden bij 300 mTorr.
- Plaats beide geactiveerde oppervlakken in contact met het PDMS permanent kleven aan de ondergrond. Indien nodig, gebruik van metalen tang om iets druk op de top van de PDMS om het contact tussen het polymeer en het glas van de schotel (figuur 1C) te dwingen.
- Incubeer de chip in de oven op 65 ° C for 1 uur de binding te versterken.
2. Coating van Microkanalen
- Activeer de hele structuur door de lucht plasma bij 300 mTorr gedurende 1 minuut. Hierdoor wordt de toegang van vloeistof in de kanalen bij de volgende stap te bevorderen.
- Vul snel de vermelding gaten van de chip met fibronectine in 10 ug / ml in water. Andere substraten zoals PEG kunnen worden gebruikt om celhechting te passen aan de kanaalwanden. Let op dat de vloeistof zich verspreidt door de gehele structuur. Dit kan gemakkelijk worden gecontroleerd op het oog onder normale licht of met een gewone helder veld microscoop.
OPMERKING: In zeer kleine structuren, waarbij diffusie is moeilijker, ingang van de vloeistof in de kanalen kan worden gedwongen door het plaatsen van de structuur in een vacuüm pot klok gedurende ten minste 15 minuten. Om de efficiëntie van de bekleding fluorescerende substraten kunnen worden gebruikt (figuur 2) te verifiëren. - Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur om adsorptie van het fibronectine of andere bekleding subst toestaanpercentage op de wanden van de kanalen.
- Was de structuren 3x met PBS om de niet-gebonden substraat te verwijderen.
- Na het wassen, overgaan tot Protocol nr. 3 of bewaar de chip bij 4 ° C voor later gebruik (24 uur maximum).
3. Cel Laden
- Verwijder de PBS uit het bord en vul de microsysteem met mobiele medium. Laat incubeer gedurende 1 uur om de kanalen met het medium verzadigen.
OPMERKING: Voor experimenten met drugs zoals moleculeinhibitors, is het aangeraden om de kanalen preincubate met een medium dat het geneesmiddel op de juiste concentratie. Bovendien zijn sommige medicijnen meestal oplosbaar in de PDMS structuur die de effectieve concentratie vermindert. Sommige oplossingen zijn voorgesteld om dit probleem tegen 11-12. - Verwijder drijvende DCs en herstellen semi-hechtende cellen door te spoelen met kweekmedium. Tellen cellen met een hemocytometer.
OPMERKING: Voor kern beeldvorming, een Hoechst 33342 kleuring kan worden vooraf door bereiktcubating 2 x 10 6 cellen gedurende 30 min met de kleurstof bij 200 ng / ml in volledig medium. Was tweemaal door centrifugeren om overtollige kleurstof te verwijderen voordat u verder het protocol. - Centrifugeer de cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten (tijd en snelheid kan verschillen afhankelijk van het type cel) en het medium verwijderen. Verdun de pellet tot een concentratie van 20 x 10 6 cellen / ml bereiken.
- Verwijder het overtollige van medium van de plaat en leeg de ingang gaten in het PDMS structuur met behulp van een micropipet. Vul de items met 5 pi cel oplossing voor een bedrag van 1 x 10 5 cellen in elk gat post bereiken.
OPMERKING: hoge celdichtheid moet het contact van de cellen met de kanalen bevorderen. Lage celdichtheid slechts een laag aantal cellen binnen kanalen en falen van het experiment. - Incubeer de microchip gedurende 30 minuten bij 37 ° C in de incubator. Voeg 2 ml compleet medium aan het experiment schotel.
OPMERKING: De hele PDMS structuur moet be bedekt om uitdrogen van de cellen tijdens het experiment te vermijden. Als 2 ml niet genoeg is, voeg meer medium volledig te bedekken de PDMS structuur.
4. Imaging
- Maak de buitenkant onderkant van de gerechten met lensreinigingsdoekjes alvorens de platen onder de microscoop.
- Om migratie in groot aantal cellen te analyseren, gebruiken 10x vergroting en breed veld verlichting in een CO 2 en temperatuur uitgerust video-microscoop (figuur 3). Om cell tracking vergemakkelijken kan Hoechst kleuring en UV-licht worden gebruikt (zie stap 3.2). Migratie kan ook geanalyseerd met behulp van confocale microscopie om de hogere resolutie van cellulaire structuren bij migratie.
- Voor time-lapse microscopie bij 10X, kies een tijd frequentie volgens de verwachte cel snelheid (normaal 2 min voor dendritische cellen migreren met een snelheid van 5 micrometer / min).
Opmerking: De hier beschreven protocol doet not omvat de analyse van de celmigratie parameters. Een paar punten zijn opgenomen in de discussie aan de lezers te adviseren over hoe verder te gaan om informatie uit time-lapse filmpjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In elk experiment het oppervlak van het PDMS is bedekt met een molecuul ingericht om het belang van de studie. Figuur 2 toont kanalen bekleed met een fluorescerend molecuul, PLL-g PEG, voor en na het wassen (stap 2.4). Een dergelijke proef kan de controle van de homogeniteit van de coating in de kanalen.
Na cel laden, kan video microscopie worden uitgevoerd om celmigratie te volgen. Figuur 3A toont een voorbeeld van DC migreren in microkanalen met een dichtheid aangepast aan de cellen te volgen. Zowel fase-contrast en Hoechst kleuring kan worden gebruikt voor dit doel (zie discussie). De techniek is ook compatibel met fluorescentie confocale microscopie hogere resolutie, en kan worden gebruikt om organellen of cellulaire structuren volgen. Figuur 4B toont een voorbeeld van de dynamiek van gepolymeriseerd actine in migrerende DCs expressie LifeActGFP.
Een voorbeeld van kwantificering celmotiliteit in migrerende DCs geanalyseerd wordt getoond in figuur 5. Figuur 5A toont kymographs gegenereerd WT of Y27632 behandelde DCs. Y27632 is een goed gekarakteriseerde remmer cel contractiliteit en migratie, en werd gebruikt om het vermogen van het systeem om veranderingen te detecteren snelheid verifiëren. De kymographs kan verder worden geanalyseerd om positie en grootte van cellen als functie van de tijd te extraheren, waardoor de studie van de verschillende parameters om celmigratie te beschrijven. Figuur 5B toont de snelheid van migratie gevolgd door grafische kern positionering met een zelfgemaakte software 13. DC's hebben een gemiddelde snelheid bijna 6 um / min. Behandeling met Y27632 vermindert aanzienlijk hun snelheid. Dit voorbeeld toont de kracht van de techniek, die de kwantificering van grote aantallen cellen in enkele experimenten en de bruikbaarheid van het systeem verschillen geïnduceerd door behandeling met geneesmiddelen kan detecteren. Dit kan worden uitgebreid naar het gebruik van siRNA en screening van mole cules betrokken bij de controle van de migratie.
Figuur 1. Stappen in kanalen assemblage. PDMS chip werd gerepliceerd van een kanaal mal. (A) De chip met de kanalen werd rechtstreeks uit de matrijs. (B) De chip aangepast aan de experimentele schaal en een gat passen werd gemaakt om de invoer van de cellen mogelijk te maken. (C) De chip werd uiteindelijk geplakt bovenop de glazen schaal. (D en E) Schematische weergave van de inrichting. (D) Bovenaanzicht. (E) Zijaanzicht. Groene objecten vertegenwoordigen cellen in of uit kanalen (blauw). Bar 1 cm.
es/ftp_upload/51099/51099fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51099/51099fig2.jpg "/>
Figuur 2. Coating kanalen met een fluorescent substraat. (A) 5 micrometer x 5 micrometer kanalen geïncubeerd met fluorescerende PEG 100 ug / ml gedurende 1 uur. (B) Afbeelding vertegenwoordiger van de resterende fluorescerende PEG na PBS wassen van de kanalen. Bar 50 urn.
Figuur 3. Cellen migreren langs microkanalen. Fase contrast (grijs) en de kern kleuring (blauw) van cellen migreren in 5 micrometer x 5 micrometer microfabricated kanalen. (A) Een beeld uit een video van DCs migreren langs kanalen. (B) Montage met de verplaatsing van een selectieted DC migreren langs kanalen. Witte pijlen geven migrerende cellen. Tijdschaal 1 img / 2 min. Bar 50 urn.
Figuur 4. Voorbeeld van een hoge resolutie cellen in microkanalen. Hoge-resolutie beeldvorming van DCs migreren langs enkele microkanalen. (A) Montage van fasecontrastbeelden (1 img/20 sec) van een DC migreren in een microkanaal (100X vergroting). (B) Montage van een DC uiten lifeact (highlights gepolymeriseerd actine) toont verenigbaarheid van het systeem met fluorescentie beeldvorming (1 img/20 sec, 60x vergroting, enkele optische sectie). Gepolymeriseerde actine wordt weergegeven in zwart. Kanaal maat 10 micrometer breed x 5 micrometer hoog. Bar 10 urn.
Figuur 5. Representatieve resultaten van DCs migreren langs microkanalen. Deze figuur illustreert het soort analyse dat kan worden gedaan uit films van cellen migreren langs microkanalen. Figuur 5A toont kymographs gegenereerd op basis van time-lapse fasecontrastbeelden van WT of Y27632 behandeld DCs migreren in microkanalen (10X, 1 img / 2 min). Figuur 5B toont een voorbeeld van kwantificering cel snelheid verkregen na het volgen van de DC kern met Hoechst kleuring en een zelfgemaakte software 13. De gegevens worden geanalyseerd met een parametrische t-test (Mann-Whitney test). Bar 100 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een inrichting bestaande uit microkanalen als een methode om de trekkende eigenschappen van grote aantallen cellen in enkele experimenten bestuderen. Deze experimentele systeem bootst de beperkte milieu-eisen gevonden in weefsels door endogene migrerende cellen. Echter, door het forceren migratie in een dimensie, vergemakkelijkt automatisch cell tracking en winning van measurables (figuur 5). We tonen ook dat ons apparaat compatibel is met fluorescentie microscopie en derhalve worden aangepast organel Positioneringsstudie tijdens de verschillende fasen van celmotiliteit (figuur 4).
Een kritische stap in het protocol is de kwaliteit van de kanalen. Het is belangrijk voor de kleven van de PDMS op het glas te regelen. Wanneer de problemen van het plakken verschijnen de eerste dingen om te controleren zijn de netheid van beide oppervlakken en het een van de plasma schoner. Een andere parameter die kritisch kan zijn is the dichtheid van geladen cellen. De spontane migratie vereist nabijheid van de cellen naar de kanalen om de binnenkomst in de buizen te vergemakkelijken, en het optimale aantal moeten worden beoordeeld voor elk type cel.
Als voorbeeld hebben wij aangetoond spontane migratie van DCs, maar het systeem kan worden gebruikt om de migratie van andere celtypes analyseren. In het laboratorium hebben wij primaire T-lymfocyten, macrofagen en tumorcellijnen (gegevens niet getoond en referenties 7-9) getest.
Naar cel migratie in de kanalen te analyseren, hebben twee belangrijke protocollen getest. De eerste vereist beeldvormend fasecontrast (10X), en is gebaseerd op het automatisch detecteren en genereren van kymographs van migrerende cellen 3 (figuur 5A). Velocity, celgrootte en doorzettingsvermogen zijn onder andere parameters die van kymographs kan worden gewonnen. Dit systeem is beperkt door de kwaliteit van de kymographs en de ontwikkelingde software voor het genereren en analyseren. Een tweede, eenvoudiger manier om de gegevens te kwantificeren is het semi-geautomatiseerd volgen van de kern met Hoechst kleuring (Figuur 3). Het gebruik van fluorescentie maakt het volgen en analyseren van de migratie met standaard beeldverwerkingssoftware. Een voorbeeld van een dergelijke strategie ontwikkeld voor de eerste wereld cel ras 12.
Aangezien het oppervlak van de PDMS kan worden geadsorbeerd met vrijwel elk eiwit kunnen microkanalen worden gebruikt om het effect van extracellulaire matrixeiwitten celmigratie evalueren. De geometrie van de kanalen kan worden aangepast, de studie van de invloed van fysieke bedwingt bij celmigratie vergemakkelijken.
Tenslotte kan dit experimentele systeem worden aangepast aan verschillende omstandigheden in enkele experimenten verwerven. Dit, samen met een semi-geautomatiseerd analyse, is compatibel met medium throughput screenings voor de ontdekking van nieuwe actoren te betrekkend bij de migratie van kankercellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs sterk erkennen de PICT IBiSA platform Institut Curie (CNRS UMR144). Dit werk werd gefinancierd door subsidies van: de European Research Council om AM.LD (Strapacemi 243.103), de Association Nationale pour la Recherche (ANR-09-PIRI-0027-PCVI), de InnaBiosanté stichting (Micemico) naar MP en AM. LD en de ERC Strapacemi jonge onderzoeker subsidie aan AM.LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Package of 90% silicone base and 10% curing agent |
| Core sample cutter | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Diameter 2.5 mm |
| Glass-bottom dish | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32 G | For small samples (35 dishes). A bigger version is also available |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma Aldrich | F0895 | |
| PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
References
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines. J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).
- Steinman, R. M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).
- Faure-André, G., et al. Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain. Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).
- Renkawitz, J., et al. Adaptive force transmission in amoeboid cell migration. Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).
- Moreau, H., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay. Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).
- Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules. Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).
- Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H.
- Maiuri, P., et al. The first World Cell Race. Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).
