Summary
液体培養物を成長させたストレプトマイセスの小型不均質である菌糸体ペレットを特徴とする。ここでは、ハイスループット様式で、このようなペレットを分析し、分類する方法を記載する。これらのペレットは、成長の不均一性を理解し、制御するためのリードを提供し、更なる分析のために使用することができる。
Abstract
ストレプトミセス、酵素および抗生物質の産生のために産業界で使用されている糸状土壌細菌である。バイオリアクター中で増殖させた場合、これらの生物は、サイズが不均一であるペレットとして知られている相互接続された菌糸のネットワークを形成する。ここでは、複合オブジェクトパラメトリック·アナライザおよびソーター（COPAS）を使用して菌糸体ペレットを分析し、ソートする方法を説明します。詳細な手順は、機器の使用やデータの基本統計分析のために与えられている。我々はさらに、ペレットは、このようなRNAまたはタンパク質含有量の分析として、下流の処理を可能にする、ユーザー定義の設定に応じて並べ替えることができます方法について説明します。異質な成長の基礎となるメカニズムが取り組むことができるこの方法を使用して。これは、生産性ペレットサイズと相関することを考慮し、セルファクトリーとしてストレプトミセスを改善するための器械であろう。
Introduction
放線菌は、糸状土壌ウェル抗生物質を作るためにそれらの技能のために知られている細菌、ならびに免疫抑制剤として使用され得るか、または真菌感染または癌と闘うために、1,2の化合物である。加えて、これらの生物は、工業的用途3広範囲の関心のある酵素を産生する。これらの商業的に興味深い化合物のほとんどは、バイオリアクター中で産生される。バイオリアクターにおける放線菌の成長は、塊又はペレットとして知られている相互接続された菌糸の複雑な構造の形成によって特徴付けられる。これらの多細胞構造は、サイズが4に関して非常に不均一であり、そのような大腸菌や枯草菌などの単細胞の細菌よりも以上万回大きいサイズに到達することができます。異質性は、自然生物系5で有益な形質とみなされているが、業界では生産の落とし穴と考えられている。バイオ原子炉の栽培は可能な限り高い収率を得る再現可能かつ制御可能でなければならない。バイオリアクター中のペレットタイプのそれぞれの役割についての詳細な理解は、細胞工場としてストレプトミセスを向上させることが非常に重要です。
フローサイトメトリーは、一般集団6に個々の細胞を分析するために使用される。フローサイトメーターは、同時に（例えば、大きさ、密度、および多色蛍光のような）細胞の特徴を測定することによって、マルチパラメータ情報を取得することができる。このようにして、電池特性ことにより培養し、細胞内で異質6の別個の集団の存在についての我々の理解に寄与する相関させることができる。より専門的な楽器により、ユーザが定義したパラメータに応じて細胞を選別することを可能にした。例えば、変異体をスクリーニングすることができる。ソーティングの後、このような変異体細胞は、さらなる特徴付けのために培養することができる。これはすでに、とりわけ、有用であることが証明されている、株7,8の生産性を向上させる。フローサイトメーターのノズルは、一般的に約10μmの最大直径を持つ細胞を通過させる。従って、ストレプトミセスのペレットは、通常のフローサイトメーターで分析することができない。しかしながら、それらは複合オブジェクトパラメトリックアナライザーソーター（COPAS）で分析することができる。定期的なフローサイトメータと同様に、COPASは、ハイスループット様式での粒子のマルチパラメータデータを取得することができる。 COPASの種類に応じて10-1,500ミクロンサイズの粒子を分析することができる。また、例えば、DNA、RNA、またはタンパク質の単離などの栽培又は下流の分析に使用することができる個々の粒子の選別を可能にする。 COPASは当初、このような線虫線虫（Caenorhabditis elegans）9、およびショウジョウバエの胚および幼虫10の小さな多細胞生物の分析およびソートのために設計されました。器具はまた、ゼブラフィッシュ11aが使用されてきた糸状菌12,13のために購入する。後者の生物はまた、糸状菌によって形成されるものよりもさらに大きい菌糸ペレットを形成する。我々は最近、COPASの使用は、ストレプト4についても可能であることを実証した。ここでは、サイズに応じて、ペレットをソートする方法論上の詳細を含め、 ストレプトマイセス·ペレットの不均一性を評価するためにCOPASを使用するための実験手順について説明します。この方法はまた、他のペレットを形成するストレプトミセスの分析のために使用され得ることは、注意してください。
Protocol
2日齢の液体増殖させた培養物からのペレットを分析し、ソートストレプトマイセスするための手順を模式的に図1に示されている。方法の詳細は以下の通りである。
1。 （メディアとバッファの作成を含む）の成長
- （; pH7.4に調整し、蒸留水1Lに80グラムのNaCl、2mMのKCl、14.4グラムのNa 2 HPO 4、2.4グラムのKH 2 PO 4 PBS）10×リン酸緩衝生理食塩水を1リットル調製する。使用時にPBSを1 Lを得るために、蒸留水900ミリリットルに10倍のPBS 100ミリリットルを追加。
- YEME培地1L（3グラムDifco酵母エキス、5グラムバクトペプトン、3グラムオキソイド麦芽エキス、10グラムのブドウ糖、340グラムのスクロース、1Lの蒸留水まで）および2.5MのMgCl 2を 100ミリリットルを用意します。オートクレーブで両方のソリューションを殺菌。また、他のストレプトミセスメディアは4,14を使用することができることに注意してください。
- に100ミリリットルYEME培地および0.2ミリリットルの2.5MのMgCl 2を追加します。無菌250ミリリットルの三角フラスコは、金属コイルばねを装備。勉強する細菌サンプルと同じ数のフラスコを準備します。
- 10 6胞子/ mlの胞子濃度を得るために、 ストレプトマイセス 10 8胞子を各フラスコに接種する。 180rpmで振盪しながら30℃で2日間細菌を成長させる。
2。サンプリング
- 無菌5ミリリットルピペットを用いて15ミリリットルファルコンチューブに各培養物から5ミリリットルのサンプルを転送します。サンプル全体の文化を代表することを確実にするためにサンプルを採取しながら、ゆっくりと文化を振る。
- サンプルはCOPASで直ちに分析されたら、[いいえサンプル調製手順は必要ありません。氷の上にサンプルを保持し、このプロトコルの3.1に進みます。サンプルは、後の時点で分析すると、このプロトコルの工程2.3-2.5に記載されるようにペレットを修正する。適切analys後に洗浄しない場合にも、固定管系における細菌の増殖を阻止することに注意してくださいES。ホルムアルデヒドとの固定は、下流分析を妨げていないことを確認してください。例えば、RNAをホルムアルデヒドで固定した後、真菌のペレットから分離することができませんでした。対照的に、RNAが正常の70％エタノールで固定した12後に単離した。
- 試料5mlに37％ホルムアルデヒド600μLを加え、チューブ3回転倒混和。 30分間氷上でサンプルを修正します。
- 遠心分離機10分間4℃で固定ローターで2500×gでのサンプル。慎重に上清を除去し、PBS 5mlでペレットを洗う。
- ペレットをPBS 2Xで洗浄されるように、ステップ2.4を繰り返します。試料は、数週間、4℃でPBS中に保存することができる。
3。 COPAS分析
- COPASプラス、ポンプ、コンピュータおよび488nmのアルゴンレーザーがオンになってBiosortソフトウェアを起動していることを確認します。オンが、レーザーは、まだスタンバイモデュスになります。
- シース液ボトルがいっぱいでないか確認してください廃液ボトルが空になっています。
- 上にスタンバイから488 nmのアルゴンレーザーを切り替えて「開始」を押した後に「RUN」をクリックします。レーザーがオンのときにしてから約60秒で、[完了]をクリックします。
- 圧力計を確認してください。 「シース」のための圧力は、「サンプル」、「ソーター」と「クリーン」は、それぞれの周りに4.0、0.5、2.7、および10.9をお読みください。
- 次の「圧力OK」のチェックボックスをクリックします。次に、システムは、フローセルをプライミングし、使用する準備ができている。
- 標準設定は11で、「遅延」と「幅」7と想定されます。しきい値は、飛行時間を表すTOFで、「TOF最小 'の'信号 'の50と40に設定されている。 （完全を期すために：すべての '利益'が1に設定され、トリガが2.50 MHzのが選択されている「スキャンレートを選択して「下のEXT（絶滅）にし、「構成」タブで設定されている一致が「強化」に設定されています）。
- サンプルカップのANから残った水を除去D（50ミリリットル程度）のPBSと一緒にカップにステップ2.2または2.5からのストレプトマイセス·サンプルの0.1ミリリットルを追加。サンプルカップが適切に閉じられていることを確認します。
- データの収集を開始するには、[取得]をクリックします。毎秒30〜50のイベントの間で取得するために流速を管理します。流量が高すぎる場合、試料カップにPBSを追加する。流速が低すぎる場合、より多くのサンプルを追加する。
- 少なくとも2500のイベントは、クリック 'stop'を収集しているとき。すべてのデータを保存するには、「ストア」をクリックして、その後の統計分析のためのあなたのファイルを保存します。 Biosortソフトウェアは、。txtファイルは、その後の分析に使用される、そのうちの4つのファイル内のデータを保存します。
- 50ミリリットルの注射器と水2Xで洗浄してサンプルを除去することにより、試料カップを清掃してください。
- すべてのサンプルが分析されるまで繰り返して3.7から3.10を繰り返します。
4。データ解析
- txtファイルを開いて、（例えば、MS Excel用を使用して）25よりも低く、EXTを使用してデータを破棄します。この4,12（ アスペルギルスニガーのために150よりも低く、EXTとすべてのデータが破棄される）破片とゆるい菌糸断片に対応しています。その後、平野'。TXT」ファイルに1列のすべてのTOFを保存（：多くのデータのためには、これはから入手できるプログラミング言語R、自動化することができるファイルhttp://www.r-project.org ）。
- あるSciLab（http://www.scilab.org/からバージョン5.3.2以降）が、一緒に説明書と、提供されています 'fittools」ライブラリと共にインストールさからのものであることを確認してください。
http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip
http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual％20fittools.pdf - あるSciLabを起動し、データをモデル化するためにfittoolsライブラリの必要な機能を実行します。要するに：（一度だけ必要とされる）取扱説明書に示されているようfittoolsライブラリをインストールします。
- fittoolsライブラリをロードします。
- あるSciLabにデータ（ '。TXT」ファイル）をお読みください。
- （自然対数は、デフォルトのログ機能である）データを変換ログインします。
- データへの2集団のモデルに適合。
- ヒストグラムとモデル（オプション）とのグラフをプロットします。
- データ（千回の反復）のブートストラップ。
- ブートストラップデータセットにモデルを当てはめる。
- 5パラメータの推定値の間隔の信頼を得る。これは集団の参加率（P）については、その2手段（μ1、μ2）および添付の標準偏差（α1とα2）を提供します。さらに、95％信頼区間（千回の反復）12,13,15をブートストラップした後にモデルと再装着によって決定されます。平均の信頼区間が重複しないとpの信頼区間は0.025から0.975の間にある場合、データセットは正規分布の二つの集団の組み合わせとして説明することができる。 （TH注大型ペレットの参加は1であるのに対し、小さなペレットの参加割合で、Pである- P）TOFおよびストレプトマイセス·ペレットの直径との関係は、0.57×TOF + 159ミクロン4に等しい。
- 場合、2つの集団は、平均のTOFはその後、大小のペレットを並べ替えるには上限と下限としてCOPASのパラメータを並べ替えるなどの用途が見出されている。また、他の仕分けパラメーターは、ユーザーの要求に応じて選択することができることに留意されたい。
5。ペレット選別
- ステップ3.7で説明したようにソートする必要があるストレプトミセス·サンプルをロードします。
- 「制限のソート」に設定し、最小限の（LO）および最大（HI）のTOF値についての詳細を提供します。別の方法として、「地域」を押した後に所望の寸法や特性を持つペレットを選択するために「ゲート領域を規定する」を選択することで、領域を設定。
- 50 mlチューブをソートパラメータを満たす複数のペレットを収集します。あるいは、マイクロタイタープレートは、個々のペレットをソートするために使用することができる。複数のペレット（10 4〜10 5）を、DNAおよびタンパク質抽出のために必要とされる。単一のペレットは、遺伝子発現のqPCR分析のために十分であるが、複数のペレットをRNA配列決定のために必要とされる。
- ソートされ、選択したパラメータのためにソートする並べ替え手動」をクリックする必要のあるペレットの数を決定し、設定します。ペレットの設定量に達すると、自動的にソートが終了する。
- サンプルカップから50ミリリットルのシリンジでサンプル上左を取り外し、水2Xでカップを洗う。他のサンプルをソートする必要がある場合は、繰り返して5.1から5.5を繰り返します。
- COPASをシャットダウンする前に、残りのペレットを除去し、70％EtOHでサンプルカップおよび/または水中の2％の次亜塩素酸をきれいに水でサンプルカップをすすいでください。システム全体をきれいにし、水でこれを繰り返すように塩素水のサンプルを実行します。空トン彼は、コンテナとクリーンをオーバーフローするか、このコンテナ内に存在するフィルターを交換してください。
- 終了したら、システムからの圧力を解放するために「停止」をクリックします。モータが停止してプログラムを閉じて、「パージせずにシャットダウン」をクリックする。その後、コンピュータ、COPAS、レーザー、ポンプのスイッチを切る。
Representative Results
ストレプトマイセス·ペレットのCOPAS測定
放線菌は、幅広いサイズを有する液体培養における菌糸体ペレットを形成する。ペレットサイズ分布を分析するために、2日齢の液体増殖させ、ストレプトミセス·コエリカラー培養物を、1mmのノズルを備えたCOPASプラスプロファイラを使用してフローサイトメトリー大きな粒子流に供した。典型的なCOPAS出力は、図2Aに可視化されるように、このような散布図である。 x軸は飛行時間型（TOF）、ペレットサイズ（ すなわち 、それは、レーザビームを通過させるように、より大きなペレット時間がかかり）と相関を表す。 y軸は、被写体の光学濃度を表す吸光度を示す。散布図の各点は、レーザービームを通過させる単一のペレットすなわち 、個々のイベントに対応しています。重要なことに、（レーザ100を超えるイベント/秒を検出したとき、すなわち ）サンプルが濃すぎる場合には、COPASは、しばしば個々のpの検出に失敗するellets。これは、高すぎる偽TOF値をもたらす。試料を希釈することは、さらに希釈がもはやインパクトTOFもしないところまで、平均TOF値が減少します。約100ペレット/秒を分析した際に、この点に到達する。
ヒストグラムにデータ点をプロットすると、サイズは通常、（ 図2B）は、分散されていないことを示しています。分布は右に歪んでいるように見える。ログは、データ·セットを変換することも、正規分布（ 図2C）には至らなかった。サイズ分布が2つの正規分布データの混合を仮定することによって説明することができるかどうかを評価することは、数学的にモデル化された12,15。モデリングは、実際のサイズ分布は、ペレットの二つの異なる集団が存在することを仮定することによって説明することができることを示した。小さなペレットの人口は、248ミクロンの平均サイズを持つすべてのペレットの92％で構成されながら、大規模なPELの人口（2集団が参加分率が2.5から97.5パーセントの間にあるときに存在すると想定されていることに注意）（すべてのペレットの8％）は319ミクロンの平均サイズを有しています。
サイズに応じて、ストレプトマイセス·ペレットの仕分け
大小のペレットの集団からのマイクロコロニーを選別した。この目的のために、2つの集団の平均ペレットサイズをソートするための境界を定義するために使用した。 319ミクロンよりも大きいペレットが大きいペレット集団（ 図3）からのものであると考えられていたのに対し、2サイズの重なり部分からペレット選別制限するように、248ミクロンよりも小さいペレットを、小さなペレット集団からであると考えられたディストリビューション。ソートされたペレットの顕微鏡分析は、その明確な大きさ（ 図3）を示した。収集されたペレットは、さらなるDNA、RNA、またはタンパク質の単離のために使用することができる。
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図1。COPASを使用して、ストレプトミセス·ペレットを測定し、分析するための実験装置の模式図。詳細については、実験手順を参照してください。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。液体成長ストレプトミセス培養におけるペレットサイズの不均一性。2日目のSのCOPAS分析コエリカラー YEME培地（A）は、（飛行時間の値として示される）、ペレットサイズが正常に配布されていないことを示しD（B）と、いずれも対数変換時に（C）そうなる。その代わりに、2のTOFで異なるペレットの集団（したがってサイズ）を検出した。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3。 （ピンク色で表示）248ミクロンより小さいサイズを有する大きさに応じて、ストレプトマイセスペレットの分画。ペレット（青色で表示）319μmと大きいペレットであると考えられたよりも大きなサイズを有するペレットのに対し、小さなペレットであると考えられた。顕微鏡分析は、大きさの違いを確認した。これらのサイズは、TOFとDの間のような関係を使用してログ変換されたデータから計算されたことに注意してください0.57×TOF + 159ミクロンに等しいストレプトマイセス·ペレットのiameter。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
Discussion
クローン集団6に異質の我々の理解に貢献した、単一の多数の細胞を高速に分析を可能にしたフローサイトメトリー。定期的なフローサイトメトリーは、放線菌や真菌の菌糸体多細胞ペレットの分析のための現実的ではありません。我々の研究は、 ストレプトマイセス·ペレットの高スループット分析がCOPASを用いて実現可能であることを実証した。ここで説明する手順は簡単、迅速、かつ再現性が高い。機器の操作中に心に留めておくべき重要なパラメータは、100イベント/秒（本プロトコールのステップ3.8）を超えないようにしてください流速、である。ペレット濃度、および従って、流速が高くなりすぎた場合、器具は、個々のペレットの検出に失敗したため、TOF値が正しく計算される。十分にPBSを添加することによって試料を希釈することで、この問題を克服する。
制限事項
COPASプラス使用ここでdは30-700ミクロンの範囲のサイズを有する粒子を測定するのに適した1mmのノズル径を有する。このノズルは、したがって、放線菌によって形成されたペレットを測定することができます。糸状菌の場合には、マイクロコロニーはCOPASプラスの一般的な適用性を制限する、大きくてもよい。 COPAS XLサイズは1500ミクロンまでの粒子を測定することができますが、径の範囲内で、その感度はCOPASプラスに比べて少ない。 COPAS PlusとCOPAS XLの両方が30ミクロン未満の粒子を分析することはできません。これは、個々の微生物の胞子または細胞を分析することができないことを意味する。また、COPAS正確胞子および細胞または非常に小さいマイクロコロニーの小さな凝集を分析しないことがあります。このために、定期的なセルアナライザーを使用する必要があります。この制限は1-1,500ミクロンの範囲の粒子を分析することができ連合BiometricaのBiosorterによって克服される。購入賞は、しかし高い。
COPASは操作が簡単で信頼性の高い測定器です。しかし、時にはペレットをサンプルカップに試料を装填し、測定を開始した後に検出されない。原因は、典型的には、容易に「クリーン」コマンドを押すことによって解決することができる詰まり入口チューブである。これはサンプルカップに戻す配管システムからのペレットを強制します。代替の理由は、蓋が適切に試料カップ上に置かれていないことかもしれません。これにより、圧力損失を検出するためのペレット付随失敗につながる。
意義と今後の方向性
ここでは、ペレットの大きさの分析に焦点を当てたが、COPASセットアップも分析することができ、並べ替えの蛍光と密度に基づいています。蛍光検出は、GFPなどのレポーターに基づく遺伝子発現を解析することを可能にします。さらに、細胞の組成物を評価することができる。さらに強力なこれらのパラメーターに応じてペレットを分離するオプションがあるTERS。ソートされたペレットは、全オミクス研究を含む下流の分析のために使用することができる。確かに、我々は以前60,000大型20万の小さなペレットをソートされ、プロテオームは、大小のペレット4の間に有意差があったことを明らかにした。この技術は、したがって、細胞工場としてストレプトミセスを向上させるために新たなリードを提供します。
COPAS技術の主な利点は、時間です。細胞ペレット上の以前の研究は、顕微鏡を用いて行われ、これは数百16まで分析することができるペレットの数を制限した。顕微鏡研究は、すでに液体成長ストレプトミセス培養 16内のペレットの2集団が存在することを示唆した。実際に、ペレットの二つの集団は、異なるストレプト4多数のかかわらず、培養条件の検出された。このサイズの不均一性は糸状放線菌に限定されるものではなく、糸状菌12で観察された</ SUP>。全ての場合において、不均一性の根本的なメカニズムはまだ知られていない。ペレットをソートする可能性は大きさや蛍光によるこのようなメカニズムを解明することを可能にします。
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COPAS Plus | Union Biometrica | PLUS | Large particle flow cytometer including lasers and software |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | PBS component |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | PBS component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | PBS component |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P9791 | PBS component |
| Difco Yeast Extract | BD Biosciences | 210933 | Media component |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | Media component |
| Oxoid Malt Extract | Fisher Scientific | OXLP0039B | Media component |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | Media component |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Media component |
| MgCl2•6H2O | Sigma Aldrich | M2670 | Media components. Add after autoclaving. |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | F8775 | Fixation of pellets |
| Sodium Hypochlorite Solution | Sigma Aldrich | 71696 | For cleaning of the instrument |
| EtOH | VWR | 20816.367 | For cleaning of the instrument |
| Erlenmeyer Flask (250 ml) | Fisher Scientific | 214-1132 | Culture flask for growing Streptomyces |
| Springs | Verenfabriek De Spiraal | Custom-Made | Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm |
| Sterile Centrifuge Tube (15 ml) | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Syringes (50 ml) | Sigma | Z683698 |
References
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