Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

की छंटनी Published: February 13, 2014 doi: 10.3791/51178
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Microbial Biotechnology, Institute Biology Leiden, Leiden University, 2Microbiology, Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation, Utrecht University

Summary

लिक्विड देसी Streptomyces संस्कृतियों आकार में विषम हैं कि mycelial छर्रों की विशेषता है. हम यहाँ का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन है और एक उच्च throughput ढंग से सॉर्ट ऐसे छर्रों. इन छर्रों विकास विविधता को समझने और नियंत्रित करने के लिए सुराग प्रदान करेगा जो आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

Streptomycetes एंजाइमों और एंटीबायोटिक दवाओं के उत्पादन के लिए उद्योग में उपयोग किया जाता है कि filamentous मिट्टी बैक्टीरिया होते हैं. बायोरिएक्टर में हो, इन जीवों का आकार में विषम हैं जो छर्रों, के रूप में जाना परस्पर hyphae, के नेटवर्क के रूप में. यहाँ हम का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन है और सॉर्ट mycelial छर्रों एक जटिल वस्तु पैरामीट्रिक विश्लेषक और सॉर्टर (Copas) का उपयोग कर. विस्तृत निर्देश साधन और डेटा की बुनियादी सांख्यिकीय विश्लेषण के उपयोग के लिए दिया जाता है. हम इसके अलावा ऐसे शाही सेना या प्रोटीन सामग्री के विश्लेषण के रूप में डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण में सक्षम बनाता है, जो उपयोगकर्ता परिभाषित सेटिंग्स के अनुसार छर्रों हल किया जा सकता का वर्णन कैसे. इस पद्धति का उपयोग तंत्र अंतर्निहित विषम विकास घेरने की कोशिश की जा सकती है. यह उत्पादकता गोली आकार के साथ संबद्ध है कि इस तथ्य पर विचार, एक सेल कारखाने के रूप में streptomycetes में सुधार के लिए सहायक होगा.

Introduction

Streptomycetes filamentous मिट्टी अच्छी तरह से एंटीबायोटिक दवाओं के बनाने के लिए उनकी दक्षता के लिए जाना जाता है कि बैक्टीरिया, साथ ही immunosuppressants के रूप में या फंगल संक्रमण या कैंसर 1,2 मुकाबला करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि यौगिक हैं. इसके अलावा, इन जीवों औद्योगिक अनुप्रयोगों 3 की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए ब्याज की हैं कि एंजाइमों का उत्पादन. इन व्यावसायिक रूप से दिलचस्प यौगिकों के अधिकांश बायोरिएक्टर में उत्पादित कर रहे हैं. बायोरिएक्टर में streptomycetes की ग्रोथ clumps या छर्रों के रूप में जाना परस्पर hyphae की जटिल संरचना के गठन की विशेषता है. ये बहुकोशिकीय संरचनाओं आकार 4 के संबंध में अत्यधिक विषम रहे हैं और इस तरह कोलाई या दण्डाणु subtilis के रूप में एक एक कोशिकीय जीवाणु से एक लाख से अधिक बार बड़े होते हैं जो आकार तक पहुँच सकते हैं. विविधता प्राकृतिक जैविक प्रणालियों 5 में एक लाभकारी विशेषता के रूप में माना जाता है, यह उद्योग में एक उत्पादन ख़तरा माना जाता है. बायोरिएक्टर cultivations उच्चतम संभव पैदावार प्राप्त करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और चलाया होना है. एक बायोरिएक्टर में गोली प्रकार से प्रत्येक की भूमिका की एक विस्तृत समझ एक सेल कारखाने के रूप में streptomycetes सुधार करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है.

प्रवाह cytometry सामान्यतः एक जनसंख्या 6 में व्यक्ति की कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रवाह cytometers एक साथ (जैसे आकार, घनत्व, और बहुरंगा प्रतिदीप्ति के रूप में) कोशिकाओं की विशेषताओं को मापने के द्वारा multiparametric जानकारी प्राप्त कर सकते हैं. इस तरह, सेल गुण जिससे हमारी एक संस्कृति के भीतर विविधता की समझ और कोशिकाओं 6 की अलग आबादी के अस्तित्व के लिए योगदान दे सहसंबद्ध किया जा सकता है. अधिक विशेष उपकरणों उपयोगकर्ता के तय मानकों के अनुसार यह संभव कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए बनाया है. उदाहरण के लिए, म्यूटेंट जांच की जा सकती है. छंटाई के बाद, ऐसे उत्परिवर्ती कोशिकाओं आगे लक्षण वर्णन के लिए खेती की जा सकती. यह पहले से ही अन्य लोगों के बीच, उपयोगी साबित हो गया है,उपभेदों 7,8 की उत्पादकता में सुधार करने के लिए. प्रवाह cytometers की नलिका आम तौर पर लगभग 10 मीटर की अधिकतम व्यास के साथ कोशिकाओं के पारित होने के लिए अनुमति देते हैं. इसलिए, streptomycetes के छर्रों नियमित प्रवाह cytometers के साथ विश्लेषण नहीं किया जा सकता. उन्होंने, हालांकि, जटिल वस्तु पैरामीट्रिक विश्लेषक और सॉर्टर (Copas) के साथ विश्लेषण किया जा सकता है. नियमित प्रवाह cytometers तरह, Copas एक उच्च throughput ढंग से कणों का multiparametric डेटा प्राप्त कर सकते हैं. Copas के प्रकार पर निर्भर 10-1,500 माइक्रोन आकार के कणों का विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अलावा, यह डीएनए, आरएनए, या प्रोटीन के अलगाव के रूप में खेती या नीचे की ओर विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि व्यक्ति के कणों की छँटाई के लिए अनुमति देता है. Copas शुरू में इस तरह के निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस 9, और ड्रोसोफिला भ्रूण और लार्वा के रूप में 10 छोटे बहुकोशिकीय जीव, का विश्लेषण और छँटाई के लिए डिजाइन किया गया था. यंत्र भी zebrafish 11 एक के लिए इस्तेमाल किया गया हैएन डी filamentous कवक 12,13 के लिए. उत्तरार्द्ध जीवों भी filamentous बैक्टीरिया द्वारा गठित उन से भी बड़ा कर रहे हैं कि mycelial छर्रों के रूप में. हमने हाल ही में Copas का उपयोग भी streptomycetes 4 के लिए संभव है कि प्रदर्शन किया है. हम यहाँ आकार के अनुसार छर्रों सॉर्ट करने के कार्यप्रणाली पर विवरण सहित Streptomyces coelicolor में गोली विविधता का आकलन करने के लिए Copas प्रयोग करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन. इस विधि भी अन्य गोली के गठन streptomycetes के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि, कृपया ध्यान दें.

Protocol

एक दो दिन पुरानी तरल देसी संस्कृति से सॉर्ट Streptomyces छर्रों का विश्लेषण करने के लिए और प्रक्रिया schematically चित्र 1 में प्रतिनिधित्व किया है. विधि के लिए विवरण नीचे दिया गया है.

1. (मीडिया और बफ़र की तैयारी सहित) ग्रोथ

  1. 10x फॉस्फेट बफर खारा के 1 एल तैयार (पीबीएस, 80 ग्राम NaCl, 2 जी KCl, 14.4 जी 2 4 HPO, 7.4 पीएच को समायोजित आसुत जल का 1 एल में 2.4 जी के.एच. 2 पीओ 4 ना). उपयोग के समय पीबीएस के 1 एल प्राप्त करने के लिए आसुत पानी की 900 मिलीलीटर के लिए 10x पीबीएस के 100 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. Yeme माध्यम के 1 एल तैयार (3 जी Difco खमीर निकालने, 5 ग्राम Bacto peptone, 3 जी OXOID माल्ट निकालने, 10 ग्राम ग्लूकोज, 340 ग्राम सूक्रोज, 1 एल आसुत जल ऊपर) और 2.5 एम 2 MgCl की 100 मिलीलीटर. Autoclaving द्वारा दोनों समाधान जीवाणुरहित. भी अन्य Streptomyces मीडिया 4,14 इस्तेमाल किया जा सकता है ध्यान दें.
  3. एक के लिए 100 मिलीलीटर Yeme मध्यम और 0.2 मिलीलीटर 2.5 एम 2 MgCl जोड़ेंबाँझ 250 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क धातु coiled स्प्रिंग्स के साथ सुसज्जित. अध्ययन करने के लिए बैक्टीरिया के नमूने के रूप में कई बोतल तैयार करें.
  4. 10 6 spores / एमएल के एक बीजाणु एकाग्रता प्राप्त करने के लिए Streptomyces की 10 8 बीजाणुओं के साथ प्रत्येक कुप्पी टीका लगाना. 180 rpm पर मिलाते हुए, जबकि 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए बैक्टीरिया बढ़ने.

2. सैम्पलिंग

  1. एक बाँझ 5 एमएल पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब के लिए प्रत्येक संस्कृति से एक 5 मिलीलीटर नमूना हस्तांतरण. नमूना पूरी संस्कृति के लिए प्रतिनिधि है कि यह सुनिश्चित करने के लिए नमूना लेने के दौरान धीरे संस्कृति हिला.
  2. नमूने Copas साथ तुरंत विश्लेषण कर रहे हैं जब कोई नमूना तैयार कदम जरूरी हैं. बर्फ पर नमूना रखें और इस प्रोटोकॉल का 3.1 कदम आगे बढ़ना. नमूने एक बाद में समय बिंदु पर विश्लेषण कर रहे हैं, तो कदम इस प्रोटोकॉल का 2.3-2.5 में वर्णित के रूप में छर्रों को ठीक. ठीक से analys के बाद साफ नहीं जब निर्धारण भी ट्यूबिंग सिस्टम में बैक्टीरिया की वृद्धि को रोकता है कि नोटतों. Formaldehyde के बहाव के विश्लेषण में बाधा नहीं है के साथ कि निर्धारण सुनिश्चित करें. उदाहरण के लिए, शाही सेना formaldehyde के साथ निर्धारण के बाद फंगल छर्रों से अलग नहीं किया जा सका. इसके विपरीत, शाही सेना सफलतापूर्वक 70% इथेनॉल के साथ 12 निर्धारण के बाद अलग किया गया था.
  3. नमूना के 5 एमएल 37% formaldehyde के 600 μl जोड़ें और ट्यूब 3x inverting द्वारा मिश्रण. 30 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों को ठीक करें.
  4. अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित रोटर में 2,500 XG पर नमूने. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ छर्रों धो लो.
  5. छर्रों पीबीएस 2x से धो रहे हैं तो उस कदम 2.4 दोहराएँ. नमूने कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता है.

3. Copas विश्लेषण

  1. Copas प्लस, पंप, कंप्यूटर और 488 एनएम आर्गन लेजर चालू है और Biosort सॉफ्टवेयर शुरू कर रहे हैं सुनिश्चित करें. पर बदल गया है, लेजर अभी स्टैंड बाय ढंग में किया जाएगा.
  2. म्यान तरल पदार्थ की बोतल भरा है और अगर जांच करेंबेकार की बोतल खाली है.
  3. पर को स्टैंडबाय से 488 एनएम आर्गन लेजर स्विच करने के लिए फिर 'आरंभ' और 'रन' पर क्लिक करें. लेजर पर जब बाद लगभग 60 सेकंड, 'संपन्न' पर क्लिक करें.
  4. दबाव गेज की जाँच करें. 'म्यान' के लिए दबाव है, 'नमूना', 'सॉर्टर' और 'साफ' क्रमशः 4.0, 0.5, 2.7, और 10.9 पढ़ना चाहिए.
  5. अगले 'दबाव ठीक' करने के लिए चेकबॉक्स क्लिक करें. व्यवस्था तो प्रवाह सेल primes और उपयोग के लिए तैयार है.
  6. मानक सेटिंग 11 में 'देरी' और 'चौड़ाई' 7 के साथ ग्रहण कर रहे हैं. सीमारेखा समय की उड़ान का प्रतिनिधित्व TOF के साथ, 'TOF न्यूनतम' के लिए 'सिग्नल' के लिए 50 और 40 पर सेट कर रहे हैं. (पूर्णता के लिए: सभी 'लाभ' 1 पर सेट कर रहे हैं, ट्रिगर 2.50 मेगाहर्ट्ज चुना जाता है 'स्कैन दर का चयन करें' Ext (विलुप्त) पर और के तहत 'विन्यास' टैब में सेट कर दिया जाता संयोग 'बढ़ी' के लिए निर्धारित है.).
  7. नमूना कप एक से बचे हुए पानी निकालेंडी एक साथ (50 एमएल) के चारों ओर पीबीएस के साथ कदम 2.2 या कप में 2.5 से Streptomyces नमूना की 0.1 मिलीलीटर जोड़ें. सुनिश्चित करें कि नमूना कप ठीक से बंद हो गया है.
  8. डेटा संग्रह शुरू करने के लिए 'मोल' पर क्लिक करें. प्रति सेकंड 30-50 घटनाओं के बीच प्राप्त करने के लिए प्रवाह की गति की व्यवस्था करें. प्रवाह बहुत अधिक है, नमूना कप के लिए पीबीएस जोड़ने. प्रवाह की गति बहुत कम है, अधिक नमूना जोड़ें.
  9. कम से कम 2,500 घटनाओं क्लिक 'स्टॉप' एकत्र कर रहे हैं. सभी डेटा क्लिक 'स्टोर' बचाने के लिए और बाद में सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अपने को सुरक्षित करना है. Biosort सॉफ्टवेयर केवल. Txt फ़ाइल बाद के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, जिनमें से चार फ़ाइलों में डेटा की बचत होगी.
  10. एक 50 मिलीलीटर सिरिंज और पानी 2x से धोने के साथ नमूना हटाने से नमूना कप साफ करें.
  11. सभी नमूनों का विश्लेषण कर रहे हैं जब तक दोहराएँ 3.7-3.10 कदम.

4. डेटा विश्लेषण

  1. . Txt फ़ाइल को खोलने और (उदाहरण एमएस एक्सेल के लिए प्रयोग) 25 से कम एक एक्सटेंशन के साथ डेटा त्यागें. यह4,12 (Aspergillus के लिए नाइजर 150 से कम एक एक्सटेंशन के साथ सभी डेटा निकाल दिया जाता है) मलबे और ढीली hyphal टुकड़े से मेल खाती है. '. Txt' तो, (: कई डेटा के लिए फ़ाइलें इस से उपलब्ध प्रोग्रामिंग भाषा अनुसंधान, में स्वचालित किया जा सकता है एक सादा में एक स्तंभ में फ़ाइल सभी TOFs बचाने http://www.r-project.org ).
  2. यकीन साइलैब (संस्करण 5.3.2 या नए http://www.scilab.org/ से) से एक साथ मैनुअल के साथ उपलब्ध है जो 'fittools' पुस्तकालय,,, के साथ मिलकर स्थापित है:
    http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip
    http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf
  3. साइलैब शुरू करें और डेटा मॉडल पर fittools पुस्तकालय के आवश्यक कार्य चला. संक्षेप में: (केवल एक बार की जरूरत है) पुस्तिका के रूप में दिखाया fittools पुस्तकालय स्थापित करें.
    1. Fittools पुस्तकालय लोड.
    2. साइलैब में डेटा ('. Txt' फ़ाइल) पढ़ें.
    3. (प्राकृतिक प्रवेश डिफ़ॉल्ट प्रवेश समारोह है) डेटा बदल लॉग इन करें.
    4. आंकड़ों के 2 आबादी के मॉडल फिट.
    5. हिस्टोग्राम और मॉडल (वैकल्पिक) के साथ एक ग्राफ साजिश.
    6. डेटा (1,000 replicates) bootstrap.
    7. बूटस्ट्रैप डेटासेट के लिए मॉडल फिट.
    8. आत्मविश्वास 5 मापदंडों के अनुमान के अंतराल हो जाओ. यह आबादी, उनके 2 साधन (μ 1 और μ 2) और साथ मानक विचलन (α 1 और 2 α) की भागीदारी के अंश (पी) के बारे में जानकारी प्रदान करेगा. इसके अलावा, 95% विश्वास अंतराल 12,13,15 (1000 replicates) bootstrapping के बाद मॉडल के साथ refitting द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. साधन का विश्वास अंतराल ओवरलैप नहीं है और पी के विश्वास अंतराल 0.025-0.975 के बीच है जब डाटासेट सामान्य वितरण की दो आबादी का एक संयोजन के रूप में समझाया जा सकता है. (ध नोटबड़े छर्रों की भागीदारी 1 है, जबकि छोटे छर्रों की भागीदारी के अंश पर पी, है -. पी) TOF और एक Streptomyces गोली का व्यास के बीच रिश्ते 0.57 × TOF + 159 माइक्रोन 4 बराबर होती है.
  4. मामले में दो आबादी ऊपरी रूप Copas में मापदंडों छँटाई के रूप में उपयोग औसत TOFs पाए जाते हैं और बाद में छोटे और बड़े छर्रों सॉर्ट करने के लिए बाध्य कम. भी अन्य छँटाई मापदंडों उपयोगकर्ता की मांग के आधार पर चुना जा सकता है कि नोट.

5. गोली छंटनी

  1. कदम 3.7 में वर्णित के रूप में हल किया जाना चाहिए कि Streptomyces नमूना लोड.
  2. 'सीमा छंटनी' सेट और न्यूनतम (लो) और अधिक से अधिक (नमस्ते) TOF मूल्यों के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं. वैकल्पिक रूप से, 'क्षेत्र' और फिर वांछित आयाम या गुणों के साथ छर्रों को चुनने के लिए 'गेट क्षेत्र को परिभाषित' का चयन करके एक क्षेत्र की स्थापना की.
  3. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को जगहछँटाई मापदंडों को पूरा करने वाले कई छर्रों इकट्ठा. वैकल्पिक रूप से, एक माइक्रो अनुमापांक थाली व्यक्ति छर्रों सॉर्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एकाधिक छर्रों (10 4 -10 5) डीएनए और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए आवश्यक हैं. एक भी गोली जीन अभिव्यक्ति की qPCR विश्लेषण के लिए पर्याप्त है, लेकिन कई छर्रों शाही सेना अनुक्रमण के लिए आवश्यक हैं.
  4. तय है और हल किया जा करने की जरूरत है कि छर्रों की संख्या निर्धारित करने और चयनित मानदंडों के लिए सॉर्ट करने के लिए 'के आधार पर क्रमबद्ध मैन्युअल' पर क्लिक करें. छर्रों की निर्धारित राशि तक पहुँच जाता है, छँटाई स्वतः समाप्त हो जाती है.
  5. नमूना कप से एक 50 मिलीलीटर सिरिंज के साथ नमूना पर छोड़ दिया निकालें और पानी 2x साथ कप धो लो. अन्य नमूनों से हल किया जा करने की जरूरत है अगर दोहराएँ 5.1-5.5 कदम.
  6. बंद करने से पहले Copas शेष छर्रों को हटाने और 70% EtOH और / या पानी में 2% हाइपोक्लोराइट साथ नमूना कप साफ करने के लिए पानी के साथ नमूना कप कुल्ला. पूरे सिस्टम को साफ और पानी के साथ यह दोहराना क्लोरीनयुक्त पानी का एक नमूना चलाएँ. खाली Tवह कंटेनर और स्वच्छ अतिप्रवाह या इस कंटेनर में रहता है कि फिल्टर की जगह.
  7. जब समाप्त हो, सिस्टम से दबाव जारी करने के लिए 'स्टॉप' पर क्लिक करें. मोटर बंद हो जाता कार्यक्रम को बंद करने और 'मिटाने के बिना शटडाउन' क्लिक करते हैं. फिर कंप्यूटर, Copas, लेजर, और पंप बंद.

Representative Results

Streptomyces छर्रों की Copas माप
Streptomycetes आकार की एक विस्तृत श्रृंखला है कि तरल संस्कृतियों में mycelial छर्रों के रूप में. गोली आकार के वितरण का विश्लेषण करने के लिए, एक 2 दिन पुराने तरल उगाया Streptomyces coelicolor संस्कृति एक 1 मिमी नोक से लैस एक Copas प्लस Profiler का उपयोग cytometry बड़े कण प्रवाह के अधीन था. एक ठेठ Copas उत्पादन चित्रा 2A में खुद के रूप में एक तितर बितर साजिश है. एक्स अक्ष गोली आकार (यानी यह लेजर बीम पारित करने के लिए बड़ा छर्रों के लिए अब लगता है) के साथ संबद्ध है, जो समय की उड़ान (TOF) का प्रतिनिधित्व करता है. Y-अक्ष वस्तु की ऑप्टिकल घनत्व का प्रतिनिधित्व करता है जो विलुप्त होने को दिखाती है. तितर बितर साजिश में प्रत्येक बिंदु लेजर बीम गुजर एक भी गोली यानी, एक व्यक्ति घटना से मेल खाती है. नमूना भी ध्यान केंद्रित किया है जब (लेजर 100 से अधिक घटनाओं / सेकंड का पता लगाता है जब आईई) महत्वपूर्ण बात है,, Copas अक्सर व्यक्तिगत पी का पता लगाने में विफल रहता हैellets. यह बहुत अधिक हैं कि झूठी TOF मूल्यों की ओर जाता है. नमूना गिराए आगे गिराए नहीं रह प्रभाव TOF करता है, जहां एक बिंदु तक, औसत TOF मूल्यों को कम करता है. लगभग 100 छर्रों / सेक विश्लेषण किया गया जब इस बिंदु पर पहुंच गया है.

एक हिस्टोग्राम में डेटा बिंदुओं की साजिश रचने आकार सामान्य रूप से (चित्रा 2B) वितरित नहीं कर रहे हैं कि इंगित करता है. वितरण अधिकार के लिए टेढ़ी हो गया लगता है. डेटा सेट बदलने से लॉग इन करें भी एक सामान्य वितरण (चित्रा -2) करने के लिए नेतृत्व नहीं किया था. आकार वितरण डेटा गणितीय 12,15 मॉडलिंग की थी दो सामान्य वितरण का एक मिश्रण संभालने के द्वारा समझाया जा सकता है कि आकलन है. मॉडलिंग वास्तव में आकार वितरण छर्रों की दो अलग आबादियों के अस्तित्व को संभालने के द्वारा समझाया जा सकता है कि संकेत दिया. छोटे छर्रों की जनसंख्या, 248 माइक्रोन के एक औसत आकार के साथ सभी छर्रों के 92% के शामिल है, जबकि बड़े PEL की आबादी(सभी छर्रों का 8%) 319 माइक्रोन के एक औसत आकार था (दो आबादी की भागीदारी अंश 2.5-97.5% के बीच है जब अस्तित्व में ग्रहण कर रहे हैं कि ध्यान दें) की सुविधा देता है.
आकार के अनुसार Streptomyces छर्रों की छंटनी

बड़े और छोटे छर्रों की आबादी से माइक्रो कालोनियों हल किया गया. यह अंत करने के लिए, दो आबादी की औसत गोली आकार छँटाई के लिए सीमाओं को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. 319 माइक्रोन से बड़ा छर्रों बड़ी गोली आबादी (चित्रा 3) से माना जाता था, जबकि दो आकार के अतिव्यापी भाग से छर्रों की छँटाई करने के लिए सीमा के रूप में तो 248 माइक्रोन से छोटे पिंड, छोटे गोली आबादी से माना जाता था वितरण. सॉर्ट किया गया छर्रों का सूक्ष्म विश्लेषण उनके अलग आकारों (चित्रा 3) से पता चला है. एकत्र छर्रों आगे डीएनए, आरएनए, या प्रोटीन isolations के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

<आइएमजी alt = "चित्रा 1" के लिए: src = "/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg" />: सामग्री चौड़ाई के लिए = "5in"
चित्रा 1. Copas का उपयोग Streptomyces छर्रों को मापने और विश्लेषण करने के लिए प्रयोगात्मक स्थापना के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. जानकारी के लिए, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को देखते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
तरल देसी Streptomyces संस्कृतियों में चित्रा 2. गोली आकार विविधता. एक 2 दिन की उम्र में एस के Copas विश्लेषण coelicolor Yeme संस्कृति (ए) (उड़ान मूल्यों के समय के रूप में संकेत दिया) गोली आकार सामान्य रूप से वितरित नहीं कर रहे हैं इंगित करता है किडी (बी), और न तो बन इसलिए जब प्रवेश तब्दील (सी). इसके बजाय, TOF में मतभेद (और इस प्रकार आकार) कि छर्रों के दो आबादी पाया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. (नीले रंग में संकेत दिया) 319 माइक्रोन से भी बड़ा एक आकार के साथ छर्रों बड़े छर्रों माना जाता था, जबकि आकार के अनुसार Streptomyces छर्रों की fractionation. पिंड एक आकार के साथ (गुलाबी में संकेत दिया) छोटे से 248 माइक्रोन, छोटे छर्रों माना जाता था. सूक्ष्म विश्लेषण आकार में अंतर की पुष्टि की. इन आकारों TOF और डी के बीच वर्णित संबंध का उपयोग लॉग तब्दील डेटा से गणना की गई है कि नोट0.57 × TOF + 159 माइक्रोन के बराबर होती है, जो एक Streptomyces गोली की iameter,. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

क्लोनल आबादी 6 में विविधता के बारे में हमारी समझ के लिए योगदान दिया है जो एकल कक्षों की बड़ी संख्या के लिए उच्च गति विश्लेषण, सक्षम है प्रवाह cytometry. नियमित फ्लो streptomycetes और कवक के बहुकोशिकीय mycelial छर्रों के विश्लेषण के लिए संभव नहीं है. हमारा काम Streptomyces छर्रों की उच्च throughput विश्लेषण Copas का उपयोग संभव है कि प्रदर्शन किया है. यहां उल्लिखित प्रक्रिया सरल, तेज, और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. साधन की कार्रवाई के दौरान मन में रखने के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर (कदम इस प्रोटोकॉल का 3.8) 100 घटनाओं / सेकंड से अधिक नहीं होना चाहिए जो प्रवाह की गति है. गोली एकाग्रता, और इसलिए भी प्रवाह की गति बहुत अधिक हो जाता है तो साधन व्यक्ति छर्रों का पता लगाने में विफल रहता है, क्योंकि TOF मूल्यों का आकलन गलत किया जाएगा. पर्याप्त पीबीएस के अलावा द्वारा नमूना गिराए इस समस्या पर काबू पा.

सीमाएं
Copas प्लस का उपयोग डी यहाँ 30-700 माइक्रोन से लेकर आकार के साथ कणों को मापने के लिए उपयुक्त है जो 1 मिमी, के एक नोजल व्यास है. इस नोक इसलिए streptomycetes द्वारा गठित छर्रों को मापने के लिए सक्षम बनाता है. Filamentous कवक के मामले में सूक्ष्म कालोनियों Copas प्लस के सामान्य प्रयोज्यता की सीमा है, जो बड़ा हो सकता है. Copas एक्स्ट्रा लार्ज आकार में 1,500 मीटर तक ऊपर कणों उपाय कर सकते हैं लेकिन व्यास के निचले श्रृंखला में अपनी संवेदनशीलता Copas प्लस की तुलना में कम है. Copas प्लस और Copas एक्स्ट्रा लार्ज दोनों 30 माइक्रोन से छोटे कणों का विश्लेषण नहीं कर सकते हैं. इस व्यक्ति माइक्रोबियल बीजाणुओं या कोशिकाओं का विश्लेषण नहीं किया जा सकता कि निकलता है. इसके अलावा, Copas सही बीजाणुओं और कोशिकाओं या बहुत छोटे सूक्ष्म कालोनियों के छोटे समुच्चय का विश्लेषण नहीं कर सकते हैं. इसके लिए नियमित रूप से सेल analyzers इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इस सीमा 1-1,500 माइक्रोन की रेंज में कणों का विश्लेषण कर सकते हैं, जो संघ Biometrica की Biosorter, से दूर है. खरीद पुरस्कार हालांकि अधिक है.

टी "> समस्या निवारण
Copas आसान काम है कि एक मजबूत साधन है. लेकिन, कभी कभी छर्रों नमूना कप में एक नमूना लोड हो रहा है और माप शुरू करने के बाद पता नहीं कर रहे. कारण आमतौर पर आसानी से 'साफ' आदेश दबाकर हल किया जा सकता है, जो एक भरा प्रविष्टि ट्यूब, है. यह नमूना कप में वापस ट्यूबिंग प्रणाली से छर्रों के लिए मजबूर करेंगे. एक वैकल्पिक कारण ढक्कन ठीक से नमूना कप पर नहीं रखा गया है कि हो सकता है. इस दबाव घटाने और छर्रों का पता लगाने के लिए सहवर्ती विफलता की ओर जाता है.

महत्व और भविष्य दिशाओं
हम यहाँ गोली आकार के विश्लेषण पर केंद्रित है, लेकिन Copas सेटअप भी विश्लेषण करने में सक्षम और तरह प्रतिदीप्ति और घनत्व पर आधारित है. प्रतिदीप्ति पहचान ऐसी GFP के रूप में पत्रकारों पर आधारित जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए सक्षम बनाता है. इसके अलावा, कोशिकाओं की संरचना का मूल्यांकन किया जा सकता है. इससे भी अधिक शक्तिशाली इन पैरामो के अनुसार छर्रों अलग करने के लिए विकल्प हैमंत्रियों. क्रमबद्ध किया गया छर्रों सभी omics पढ़ाई सहित बहाव के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दरअसल, हम पहले से 60,000 बड़े और 200,000 छोटे छर्रों हल है, और proteome बड़े और छोटे छर्रों 4 के बीच काफी अलग था कि प्रदर्शन किया. यह तकनीक इसलिए सेल कारखानों के रूप में streptomycetes में सुधार के लिए नए सुराग प्रदान करता है.

Copas प्रौद्योगिकी के प्रमुख लाभ का समय है. सेल छर्रों पर पिछले अध्ययनों माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है, और यह कई सैकड़ों 16 तक विश्लेषण किया जा सकता है कि छर्रों की संख्या को सीमित कर रहे थे. माइक्रोस्कोपी अध्ययन पहले से ही तरल देसी Streptomyces संस्कृतियों 16 में छर्रों की दो आबादी के अस्तित्व का सुझाव दिया. दरअसल, छर्रों की दो आबादी अलग streptomycetes 4 की एक बड़ी संख्या में परवाह किए बिना संस्कृति की स्थिति का पता लगाया गया. इस आकार विविधता filamentous streptomycetes तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी filamentous कवक 12 में मनाया गया </ Sup>. सभी मामलों में, विविधता की अंतर्निहित तंत्र अभी तक ज्ञात नहीं कर रहे हैं. छर्रों सॉर्ट करने के लिए संभावना आकार और प्रतिदीप्ति के अनुसार इस तरह के तंत्र को खंडित करने के लिए सक्षम बनाता है.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS Plus Union Biometrica PLUS Large particle flow cytometer including lasers and software
NaCl Sigma Aldrich S3014 PBS component
KCl Sigma Aldrich P9541 PBS component
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 PBS component
KH2PO4 Sigma Aldrich P9791 PBS component
Difco Yeast Extract BD Biosciences 210933 Media component
Bacto Peptone BD Biosciences 211677 Media component
Oxoid Malt Extract Fisher Scientific OXLP0039B Media component
Glucose Sigma Aldrich G8270 Media component
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Media component
MgCl2•6H2O Sigma Aldrich M2670 Media components. Add after autoclaving.
Formaldehyde Solution Sigma Aldrich F8775 Fixation of pellets
Sodium Hypochlorite Solution  Sigma Aldrich 71696 For cleaning of the instrument
EtOH VWR 20816.367 For cleaning of the instrument
Erlenmeyer Flask (250 ml) Fisher Scientific 214-1132 Culture flask for growing Streptomyces
Springs Verenfabriek De Spiraal Custom-Made Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm
Sterile Centrifuge Tube (15 ml) Sarstedt 62.554.002
Syringes (50 ml) Sigma Z683698

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hopwood, D. A. Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , University Press. New York, Oxford. (2007).
  2. van Wezel, G. P., McDowall, K. J. The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances. Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).
  3. Anné, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. Recombinant protein production and streptomycetes. J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).
  4. van Veluw, G. J., et al. Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).
  5. Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
  6. Davey, H. M., Winson, M. K. Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).
  7. Betz, J. W., Aretz, W., Härtel, W. Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs. Cytometry. 5, 145-150 (1984).
  8. Bell, P. J., et al. A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).
  9. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. C. elegans: methods and applications. Strange, K. , Springer. 275-286 (2006).
  10. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
  11. Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  12. de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., Wösten, H. A. B. Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).
  13. van Veluw, G. J., et al. Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants. Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).
  14. Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. Norwich. (2000).
  15. Vinck, A., et al. Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger. Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).
  16. Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis. Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).

Tags

सूक्ष्म जीव विज्ञान अंक 84, हिमपात आकृति विज्ञान प्रतिदीप्ति Copas जैव प्रौद्योगिकी उच्च throughput विश्लेषण छँटाई विविधता प्रवाह cytometry
की छंटनी<em&gt; Streptomyces</emएक जटिल वस्तु पैरामीट्रिक विश्लेषक और सॉर्टर का प्रयोग&gt; सेल छर्रों
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petrus, M. L. C., van Veluw, G. J.,… More

Petrus, M. L. C., van Veluw, G. J., Wösten, H. A. B., Claessen, D. Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter. J. Vis. Exp. (84), e51178, doi:10.3791/51178 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter