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Biology

Sortierung der Published: February 13, 2014 doi: 10.3791/51178
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Microbial Biotechnology, Institute Biology Leiden, Leiden University, 2Microbiology, Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation, Utrecht University

Summary

Flüssig-grown Streptomyces-Kulturen werden durch Myzelpellets, die in der Größe heterogen sind gekennzeichnet. Wir beschreiben hier eine Methode, um zu analysieren und zu sortieren, wie Pellets in einem Hochdurchsatz-Weise. Diese Pellets können für weitere Analysen, die Leitungen zur Verfügung stellt, zu verstehen und zu steuern Wachstum Heterogenität verwendet werden.

Abstract

Streptomyceten sind filamentöse Bodenbakterien, die in der Industrie zur Herstellung von Enzymen und Antibiotika verwendet werden. Wenn in Bioreaktoren gezüchtet, diese Organismen bilden Netzwerke von miteinander verbundenen Hyphen, als Pellets, die in der Größe heterogen sind bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode, um zu analysieren und sortieren Myzelpellets mit einem komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter (COPAS). Ausführliche Anweisungen für die Verwendung des Instruments und der Grund statistische Analyse der Daten. Wir beschreiben außerdem, wie Pellets können sortiert werden nach benutzerdefinierten Einstellungen, die Weiterverarbeitung ermöglicht, wie die Analyse der RNA-oder Proteingehalt. Mit dieser Methode kann der Mechanismus zugrunde liegende heterogene Wachstum angegangen werden. Dies wird entscheidend für die Verbesserung der Streptomyceten als Zellfabrik, in Anbetracht der Tatsache, dass die Produktivität korreliert mit Pelletgröße sein.

Introduction

Streptomyceten sind filamentöse Bodenbakterien, die für ihre Kenntnisse bekannten Antibiotika bilden, wie auch Verbindungen, die als Immunsuppressiva oder zur Bekämpfung von Pilzinfektionen oder Krebs 1,2 verwendet werden können. Darüber hinaus sind diese Organismen produzieren Enzyme, die für eine Vielzahl von industriellen Anwendungen 3 von Interesse sind. Die meisten kommerziell interessante Verbindungen sind in Bioreaktoren hergestellt. Wachstum von Streptomyceten in Bioreaktoren ist durch die Bildung von komplexen Strukturen von miteinander verbundenen Hyphen, wie Klumpen oder Pellets bekannt ist. Diese multizellulären Strukturen sind sehr heterogen in Bezug auf Größe 4 und Größen, die mehr als eine Million Mal größer als ein einzellige Bakterium wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis sind zu erreichen. Obwohl Heterogenität wird als vorteilhaft Merkmal in natürlichen biologischen Systemen 5 betrachtet, wird es als ein Fallstrick Produktion in der Industrie. BioReaktor Kulturen haben reproduzierbar und kontrollierbar, die eine möglichst hohe Rendite zu erzielen sein. Ein detailliertes Verständnis der Rolle von jedem der Pellet-Typen in einem Bioreaktor ist daher von entscheidender Bedeutung für Streptomyceten als Zellfabrik zu verbessern.

Durchflusszytometrie wird üblicherweise verwendet, um einzelne Zellen untersucht in einer Population 6. Durchflusszytometer kann multiInformationen durch gleichzeitiges Messen von Eigenschaften der Zellen (z. B. Größe, Dichte und multicolor Fluoreszenz) zu erwerben. Auf diese Weise können Zelleigenschaften korreliert werden, um dadurch das Verständnis der Heterogenität in einer Kultur und das Vorhandensein von verschiedenen Populationen von Zellen 6 beiträgt. Spezialisiertere Instrumente entsprechend benutzerdefinierten Parametern machte es möglich, Zellen zu sortieren. Zum Beispiel können Mutanten gescreent werden. Nach der Sortierung können solche mutierten Zellen für die weitere Charakterisierung kultiviert werden. Dies wurde bereits als nützlich erwiesen, unter anderem,zur Verbesserung der Produktivität der Stämme 7,8. Die Düsen Durchflusszytometer typischerweise ermöglichen die Passage von Zellen mit einem maximalen Durchmesser von etwa 10 &mgr; m. Daher können Pellets von Streptomyceten nicht mit regelmäßigen Durchflusszytometer analysiert werden. Sie können jedoch mit der komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter (COPAS) analysiert werden. Wie regelmäßige Durchflusszytometer kann COPAS multi Daten von Teilchen in einem Hochdurchsatz-Art und Weise zu erwerben. Abhängig von der Art der COPAS 10-1,500 &mgr; m große Partikel analysiert werden. Darüber hinaus ermöglicht es für das Sortieren der einzelnen Partikel, die für den Anbau oder Downstream-Analysen verwendet werden können, wie die Isolierung von DNA, RNA oder Proteinen. COPAS wurde zunächst für die Analyse und Sortierung von kleinen mehrzelligen Organismen wie Nematoden Caenorhabditis elegans 9 und Drosophila-Embryonen und Larven 10 ausgebildet. Die Geräte sind auch für Zebrafisch 11 a eingesetztnd für Fadenpilze 12,13. Letztere Organismen bilden auch Myzelpellets, die sogar größer als diejenigen von Fadenbakterien gebildet sind. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Verwendung von COPAS ist auch denkbar Streptomyceten 4. Wir beschreiben hier die experimentelle Verfahren für die Verwendung der COPAS zu Pellet Heterogenität in Streptomyces coelicolor beurteilen, einschließlich Einzelheiten über die Methodik, um Pellets nach Größe zu sortieren. Beachten Sie jedoch, daß dieses Verfahren auch für die Analyse anderer Pellet bildenden Streptomyceten verwendet werden.

Protocol

Das Verfahren aus einem Zwei-Tage-alten Flüssigkultur gezüchtet analysieren und sortieren Streptomyces Pellets ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Details für das Verfahren sind nachstehend angegeben.

1. Growth (einschließlich der Erstellung von Medien und Puffer)

  1. Herstellung von 1 l 10x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4 in 1 l destilliertem Wasser auf pH 7,4 eingestellt). Zum Zeitpunkt der Verwendung werden 100 ml 10-fach PBS und 900 ml destilliertem Wasser auf 1 Liter PBS erhalten.
  2. Herstellung von 1 l YEME-Medium (3 g Difco-Hefeextrakt, 5 g Bacto-Pepton, Oxoid 3 g Malzextrakt, 10 g Glucose, 340 g Saccharose destilliertes Wasser bis zu 1 l) und 100 ml 2,5 M MgCl 2. Sterilisieren beide Lösungen durch Autoklavieren. Beachten Sie, dass auch andere Medien verwendet Streptomyces 4,14 werden.
  3. 100 ml YEME Medium und 0,2 ml 2,5 M MgCl 2 einsterile 250 ml Erlenmeyerkolben mit Metallspiralfedern ausgestattet. Bereiten Sie so viele Flaschen wie Bakterienproben zu studieren.
  4. Der Kolben Impfen mit 10 8 Sporen von Streptomyces, um eine Sporenkonzentration von 10 6 Sporen / ml zu erhalten. Wachsen die Bakterien, die für 2 Tage bei 30 ° C unter Schütteln bei 180 UpM.

2. Sampling

  1. Übertragen einer 5 ml-Probe von jeder Kultur in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen unter Verwendung einer sterilen 5 ml Pipette. Schütteln Sie die Kultur, während die Probe, um sicherzustellen, dass die Stichprobe repräsentativ für die ganze Kultur.
  2. Wenn Proben werden sofort mit COPAS analysiert keine Probenvorbereitung notwendig. Halten Sie die Probe auf Eis und gehen Sie zu Schritt 3.1 dieses Protokolls. Wenn Proben werden zu einem späteren Zeitpunkt analysiert, fixieren die Pellets in Schritten von 2,3 bis 2,5 des Protokolls beschrieben. Beachten Sie, dass Fixierung verhindert auch das Wachstum der Bakterien im Leitungssystem, wenn nicht richtig gereinigt nach analysEs. Stellen Sie sicher, dass die Fixierung mit Formaldehyd Downstream-Analysen nicht behindern. Zum Beispiel RNA nicht von Pilzpellets nach Fixierung mit Formaldehyd, isoliert werden. Im Gegensatz dazu wurde RNA erfolgreich nach der Fixierung mit 70% Ethanol 12 isoliert.
  3. Add 600 ul 37% Formaldehyd zu 5 ml Probe zugeben und durch Invertieren 3x. Befestigen Sie die Proben auf Eis für 30 min.
  4. Zentrifuge werden die Proben bei 2500 · g in einem Fest Rotor bei 4 ° C für 10 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie die Pellets mit 5 ml PBS.
  5. Wiederholen Sie Schritt 2,4, so dass die Pellets mit PBS 2x gewaschen. Die Proben in PBS bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.

3. COPAS Analyse

  1. Stellen Sie sicher, dass der COPAS Plus, der Pumpe, der Computer und die 488-nm-Argon-Laser eingeschaltet und starten Sie die Biosort Software. Obwohl eingeschaltet, wird der Laser im Bereitschaftsmodus ist.
  2. Prüfen Sie, ob die Hülle Flüssigkeitsflasche ist voll und derAbfallflasche ist leer.
  3. Klicken Sie auf "START" und dann "RUN", um die 488-nm-Argon-Laser aus dem Standby, um einzuschalten. Nach ca. 60 Sekunden, wenn der Laser eingeschaltet ist, klicken Sie auf 'Fertig'.
  4. Überprüfen Sie die Druckmessgeräte. Der Druck für 'Mantel', 'Sample "," Sorter "und" Clean' rund 4,0, 0,5, 2,7 und 10,9 bzw. lesen sollte.
  5. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen neben "Druck OK '. Das System Primzahlen dann die Durchflusszelle und ist einsatzbereit.
  6. Standardeinstellungen sind mit "Verzögerung" bei 11 und 'Breite' 7 angenommen. Schwellenwerte werden bei 50 für 'Signal' und 40 für 'TOF Mindest' setzen, mit TOF, die die Time-of-flight. (Zur Vollständigkeit: Alle 'Gewinne' auf 1 gesetzt, der Trigger auf EXT (Extinction) und in der Registerkarte "Konfiguration" unter Set 'Wählen Sie Scan-Rate "2,50 MHz gewählt Zufall zu" Verbesserte "gesetzt ist.).
  7. Entfernen übrig gebliebenen Wasser aus der Probe eine Tassed 0,1 ml von Streptomyces Probe aus Schritt 2.2 oder 2.5 in der Tasse zusammen mit PBS (ca. 50 ml). Stellen Sie sicher, dass die Probenschale richtig geschlossen ist.
  8. Klicken Sie auf "Acquire" Datenerfassung zu starten. Verwalten die Strömungsgeschwindigkeit zwischen 30-50 Ereignissen pro Sekunde erhalten. Wenn die Strömung zu hoch ist, fügen PBS auf der Probenschale. Wenn die Strömungsgeschwindigkeit zu niedrig ist, fügen Sie weitere Probe.
  9. Wenn mindestens 2.500 Veranstaltungen werden gesammelt klicken Sie auf 'STOP'. Um alle Daten klicken Sie auf 'Store' speichern und speichern Sie Ihre Datei für die anschließende statistische Analyse. Die Biosort Software die Daten in vier Dateien zu speichern, von denen nur die. Txt-Datei wird für die nachfolgende Analyse verwendet werden.
  10. Reinigen Sie die Probenschale, indem die Probe mit einer 50-ml-Spritze und Waschen mit Wasser 2x.
  11. Wiederholen Sie die Schritte von 3,7 bis 3,10, bis alle Proben analysiert.

4. Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die. Txt-Datei und entsorgen Sie Daten mit einem EXT unter 25 (unter Verwendung von zum Beispiel MS Excel). Diesentspricht Schmutz und lose Hyphenfragmente (für Aspergillus niger alle Daten mit einem EXT weniger als 150 werden verworfen) 4,12. Dann speichern Sie alle TOFs in einer Spalte in einer einfachen Datei (für viele Datendateien kann dies in der Programmiersprache R, erhältlich von automatisiert werden: "txt". http://www.r-project.org ).
  2. Stellen Sie sicher, SciLab (Version 5.3.2 oder neuer von http://www.scilab.org/) wird zusammen mit dem "fittools 'Bibliothek, die verfügbar ist, zusammen mit der Anleitung aus installiert:
    http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip
    http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf
  3. Starten SciLab und führen die notwendigen Funktionen des fittools Bibliothek, um die Daten zu modellieren. Kurz: Installieren Sie die fittools Bibliothek, wie im Handbuch (nur einmal erforderlich) gezeigt.
    1. Laden Sie die fittools Bibliothek.
    2. Lesen Sie die Daten (Datei '. Txt') in SciLab.
    3. Melden Sie transformieren die Daten (natürliche Logarithmus ist die Standardprotokollfunktion).
    4. Setzen Sie das Modell der zwei Populationen zu den Daten.
    5. Eine Grafik mit dem Histogramm und Modell (optional).
    6. Bootstrap die Daten (1000 Wiederholungen).
    7. Setzen Sie das Modell auf die Bootstrap-Datensätze.
    8. Holen Sie sich das Konfidenzintervall Schätzungen der 5-Parameter. Damit werden die Informationen über die Beteiligung Fraktion (p) der Bevölkerung, ihre zwei Mittel (μ 1 und μ 2) und die zugehörigen Standardabweichungen (α 1 und α 2) zu liefern. Darüber hinaus sind die 95%-Konfidenzintervalle durch die Umrüstung mit dem Modell nach Bootstrapping (1000 Wiederholungen) 12,13,15 bestimmt. Wenn die Vertrauensintervalle der Einrichtung nicht überlappen und das Vertrauensintervall von p zwischen 0,025-0,975 die Datenmenge als eine Kombination von zwei Populationen von Normalverteilungen erklärt. (Beachten Sie, thbei der Teilnahme Fraktion von kleinen Pellets p, während der Beteiligung großer Pellets 1 -. p) Die Beziehung zwischen TOF und der Durchmesser eines Streptomyces Pellet gleich 0,57 × TOF + 159 &mgr; m 4.
  4. Bei beiden Populationen sind die durchschnittlichen Nutzung TOFs als Sortierparameter in der COPAS als obere und untere gefunden verpflichtet, die kleinen und großen Pellets anschließend sortieren. Man beachte, dass auch andere Sortierparameter in Abhängigkeit von den Anforderungen des Anwenders ausgewählt werden.

5. Pellet Sortierung

  1. Laden Sie die Streptomyces Probe, die wie in Schritt 3.7 beschrieben sortiert werden muss.
  2. Set 'Sortierung Limits' und Angaben über die minimal (Lo) und maximal (Hallo) TOF-Werte. Alternativ können Sie einen Bereich, indem Sie "Regionen" und dann "Definieren Tor Region ', um die Pellets mit den gewünschten Abmessungen oder Eigenschaften auswählen.
  3. Legen Sie eine 50-ml-Tube zusammeln mehrere Pellets, die die Sortierparameter erfüllen. Alternativ kann eine Mikrotiterplatte verwendet werden, um einzelne Pellets zu sortieren. Mehrere Pellets (10 4 -10 5) für die DNA-und Proteinextraktion benötigt wird. Eine einzelne Tablette ist ausreichend für qPCR-Analyse von Genexpression, sondern mehrere Pellets für RNA-Sequenzierung erforderlich.
  4. Entscheiden Sie und stellen Sie die Anzahl der Pellets, die sortiert werden müssen, und klicken Sie auf "Manuelle Sortierung", um für die ausgewählten Parameter zu sortieren. Wenn die festgelegten Betrag von Pellets erreicht ist, endet die Sortierung automatisch.
  5. Entfernen übrig Probe mit einer 50 ml Spritze aus dem Probenbecher und waschen Sie die Tasse mit Wasser 2x. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.5, wenn andere Proben müssen sortiert werden.
  6. Vor dem Herunterfahren des COPAS spülen Sie den Probenbecher mit Wasser, um die restlichen Pellets zu entfernen und reinigen Sie den Probenbecher mit 70% EtOH und / oder 2% Hypochlorit in Wasser. Führen Sie eine Probe von Chlorwasser, das gesamte System zu reinigen, und wiederholen Sie diese mit Wasser. Leere ter Behälter und sauber überlaufen oder den Filter, der in diesem Container befindet, zu ersetzen.
  7. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf "STOP", um den Druck aus dem System zu lösen. Wenn der Motor stoppt schließen Sie das Programm und klicken Sie auf "Herunterfahren ohne Spülung. Dann schalten Sie den Computer aus, die COPAS, die Laser und die Pumpe.

Representative Results

COPAS Messungen von Streptomyces Pellets
Streptomyceten bilden Myzelpellets in Flüssigkulturen, die eine breite Palette von Größen haben. Um zu analysieren, Pelletgrößenverteilung, eine 2-Tage alten Flüssigkeit gewachsen Streptomyces coelicolor Kultur wurde in großen Partikel Durchflusszytometrie unter Verwendung eines COPAS Plus-Profiler mit einem 1-mm-Düse ausgerüstet unterzogen. Eine typische COPAS Ausgang ist ein Streudiagramm, wie in Abbildung 2A visualisiert. Die x-Achse stellt die Time-of-flight (TOF), die mit Pelletgröße (dh es länger dauert größeren Pellets, um den Laserstrahl passieren) korreliert. Die y-Achse zeigt die Extinktion, die die optische Dichte des Objekts darstellt. Jeder Punkt im Streudiagramm entspricht einem einzelnen Ereignis, dh einem einzigen Pellet Passieren des Laserstrahls. Wichtig ist, dass, wenn die Probe zu konzentriert ist (dh, wenn der Laser detektiert, mehr als 100 Ereignisse / sec), die COPAS häufig nicht zu erkennen einzelnen pellets. Dies führt zu falschen TOF-Werte, die zu hoch sind. Verdünnen der Probe reduziert die durchschnittliche TOF-Werte, bis zu einem Punkt, wo weitere Verdünnungs tut keinen Einfluss mehr TOF. Dieser Punkt ist erreicht, wenn etwa 100 Pellets / sec wurden analysiert.

Die graphische Darstellung der Datenpunkte in ein Histogramm zeigt an, dass die Größen nicht normalverteilt sind (Abbildung 2B). Die Verteilung wird nach rechts verschoben sein. Melden Sie sich die Umwandlung der Datenmenge auch nicht zu einer Normalverteilung (Abbildung 2C) führen. Zu beurteilen, ob die Größenverteilung kann durch die Annahme einer Mischung von zwei Normalverteilungen die Daten mathematisch modelliert 12,15 erläutert. Modellierung der Tat gezeigt, dass die Größenverteilung kann durch die Annahme der Existenz von zwei verschiedenen Populationen von Pellets beschrieben. Die Bevölkerung von kleinen Pellets bestand aus 92% aller Pellets mit einer durchschnittlichen Größe von 248 um, während die Bevölkerung der großen pelkönnen (8% aller Pellets) hatte eine durchschnittliche Größe von 319 um (beachten Sie, dass zwei Populationen auszugehen, wenn der Teilnahmeanteil zwischen 2,5 bis 97,5%).
Sortieren von Streptomyces Pellets nach Größe

Mikrokolonien aus den Populationen von großen und kleinen Pellets wurden sortiert. Zu diesem Zweck wurden die durchschnittliche Pelletgrößen der zwei Populationen verwendet werden, um die Grenzen für die Sortierung definieren. Pellets kleiner als 248 &mgr; m wurden als von dem kleinen Pellet Bevölkerung, während Pellets größer als 319 &mgr; m, wurden als von der großen Pellet Population (Abbildung 3), um so zu begrenzen Sortieren von Pellets aus dem überlappenden Abschnitt der zwei Größen Distributionen. Die mikroskopische Analyse von sortierten Pellets zeigten ihre unterschiedlichen Größen (Abbildung 3). Die gesammelten Pellets können weitere DNA-, RNA-oder Protein-Trennungen verwendet werden.

<img alt = "Abbildung 1" fo: content-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg" />
Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus zur Messung und Analyse Streptomyces Pellets mit COPAS. Einzelheiten siehe experimentellen Verfahren. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
Abbildung 2. Pelletgröße Heterogenität in flüssiger wachsenen Streptomyces Kulturen. COPAS Analyse einer 2 Tage alten S. coelicolor YEME-Kultur (A) zeigt an, dass Pelletgrößen (als Flugzeit-Werte angegeben) sind in der Regel nicht zu verteilend (B), und auch wenn sich so log-transformiert (C). Stattdessen wurden zwei Populationen von Pellets, die in TOF unterscheiden (und damit Größe) nachgewiesen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 3
3. Fraktionierung von Streptomyces Pellets je nach Größe. Pellets mit einer Größe kleiner als 248 um (in rosa gekennzeichnet) wurden als kleine Pellets sein, während Pellets mit einer Größe von mehr als 319 um (in blau dargestellt) wurden als große Pellets. Mikroskopische Analyse bestätigt den Unterschied in der Größe. Beachten Sie, dass bei diesen Größen wurden aus den log-transformierten Daten unter Verwendung der beschriebenen Beziehung zwischen TOF und d berechnetiameter eines Streptomyces-Pellet, die 0,57 × TOF + 159 um beträgt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Discussion

Durchflusszytometrie hat den Hochgeschwindigkeits-Analyse einer großen Anzahl von Einzelzellen, die zum Verständnis der Heterogenität in klonalen Populationen 6 beigetragen aktiviert. Regelmäßige Durchflusszytometrie nicht möglich ist für die Analyse der vielzelligen Myzelpellets von Streptomyceten und Pilze. Unsere Arbeit hat gezeigt, dass die Hochdurchsatzanalyse von Streptomyces Pellets ist machbar mit COPAS. Das hier beschriebene Verfahren ist einfach, schnell und sehr gut reproduzierbar. Der kritische Parameter zu beachten, während des Betriebs des Gerätes, ist die Strömungsgeschwindigkeit, die 100 Veranstaltungen / sec (Schritt 3.8 dieses Protokolls) nicht überschreiten sollte. Wenn der Pellet-Konzentration und damit auch die Strömungsgeschwindigkeit zu hoch wird, werden die TOF-Werte falsch berechnet werden, da das Gerät nicht zu einzelnen Pellets zu erkennen. Ausreichend Verdünnen der Probe durch Zugabe von PBS überwindet dieses Problem.

Begrenztheit
Die COPAS Plus-Einsatz d hat hier einen Düsendurchmesser von 1 mm, das zum Messen Teilchen mit einer Größe im Bereich von 30 bis 700 &mgr; m ist. Diese Düse ermöglicht daher die Messung Pellets durch Streptomyceten gebildet. Im Fall von filamentösen Pilzen können die Mikrokolonien größer sein, welche die allgemeine Anwendbarkeit des COPAS plus begrenzt. Die COPAS XL können Partikel bis zu 1.500 um Größe zu messen, sondern die Empfindlichkeit im unteren Bereich mit einem Durchmesser von weniger im Vergleich zu dem des Plus-COPAS. Sowohl die Plus-und die COPAS COPAS XL nicht analysieren Teilchen kleiner als 30 um. Dies bedeutet, dass die einzelnen mikrobiellen Sporen oder Zellen können nicht analysiert werden. Darüber hinaus kann die COPAS nicht genau analysieren kleine Aggregate von Zellen oder Sporen und den sehr kleinen Mikrokolonien. Dazu sollten regelmäßige Zellanalysatoren verwendet werden. Diese Einschränkung wird durch die Biosorter der Union Biometrica, die Partikel im Bereich von 1-1,500 um analysieren zu überwinden. Der Kaufpreis ist aber höher.

t "> Fehlerbehebung
Die COPAS ist ein robustes Gerät, das einfach zu bedienen ist. Aber manchmal Pellets nicht nach dem Laden einer Probe in die Probenschale und Starten der Messung erfasst. Die Ursache ist in der Regel ein Rohr verstopft Eintrag, die leicht durch Drücken der "sauberen" Befehl gelöst werden können. Dadurch werden die Pellets von dem Rohrsystem zurück in den Probenbecher zu zwingen. Ein alternativer Grund könnte sein, dass der Deckel nicht richtig auf dem Probenbecher gelegt. Dies führt zu Druckverlust und die damit einhergehende fehlende Pellets zu erkennen.

Bedeutung und zukünftige Richtungen
Wir hier konzentrierte sich auf die Analyse der Pellet-Größe, aber die COPAS Setup ist auch in der Lage zu analysieren und auf Fluoreszenz Art und Dichte berechnet. Fluoreszenzdetektion ermöglicht es uns, die Genexpression basierend auf Reporter wie GFP analysieren. Weiterhin kann die Zusammensetzung der Zellen evaluiert werden. Noch leistungsfähiger ist die Möglichkeit, Pellets nach diesen Parameter zu trennenter. Sortiert Pellets können für Downstream-Analysen, einschließlich alle omics-Studien verwendet werden. In der Tat, wir vorher sortiert 60.000 große und 200.000 kleine Pellets, und gezeigt, dass das Proteom war signifikant unterschiedlich zwischen großen und kleinen Pellets 4. Diese Technologie bietet daher neue Leads zu Streptomyceten als Zellfabriken zu verbessern.

Der entscheidende Vorteil des COPAS Technologie ist die Zeit. Frühere Studien an Zellpellets wurden unter Verwendung von Mikroskopie und dadurch die Anzahl von Pellets, die bis zu mehreren hundert 16 analysiert werden können, begrenzt. Mikroskopie Studien, die bereits die Existenz von zwei Populationen von Pellets in flüssigem Streptomyces-Kulturen angebaut 16 vorgeschlagen. In der Tat wurden zwei Populationen von Pellets unabhängig von den Kulturbedingungen in einer großen Anzahl von verschiedenen Streptomyceten 4 erfasst. Diese Größe ist nicht auf Heterogenität Faden Streptomyceten beschränkt, sondern wurde auch in Fadenpilze 12 beobachtet </ Sup>. In allen Fällen werden die zugrunde liegenden Mechanismen der Heterogenität noch nicht bekannt. Die Möglichkeit, Pellets sortieren nach Größe und Fluoreszenz ermöglicht es uns, solche Mechanismen zu entschlüsseln.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS Plus Union Biometrica PLUS Large particle flow cytometer including lasers and software
NaCl Sigma Aldrich S3014 PBS component
KCl Sigma Aldrich P9541 PBS component
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 PBS component
KH2PO4 Sigma Aldrich P9791 PBS component
Difco Yeast Extract BD Biosciences 210933 Media component
Bacto Peptone BD Biosciences 211677 Media component
Oxoid Malt Extract Fisher Scientific OXLP0039B Media component
Glucose Sigma Aldrich G8270 Media component
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Media component
MgCl2•6H2O Sigma Aldrich M2670 Media components. Add after autoclaving.
Formaldehyde Solution Sigma Aldrich F8775 Fixation of pellets
Sodium Hypochlorite Solution  Sigma Aldrich 71696 For cleaning of the instrument
EtOH VWR 20816.367 For cleaning of the instrument
Erlenmeyer Flask (250 ml) Fisher Scientific 214-1132 Culture flask for growing Streptomyces
Springs Verenfabriek De Spiraal Custom-Made Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm
Sterile Centrifuge Tube (15 ml) Sarstedt 62.554.002
Syringes (50 ml) Sigma Z683698

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References

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Tags

Mikrobiologie , Durchflusszytometrie Pellets Morphologie Fluoreszenz COPAS Biotechnologie Hochdurchsatz-Analyse Sortierung Heterogenität
Sortierung der<em&gt; Streptomyces</em&gt; Zell Pellets mit einem komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter
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Petrus, M. L. C., van Veluw, G. J.,… More

Petrus, M. L. C., van Veluw, G. J., Wösten, H. A. B., Claessen, D. Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter. J. Vis. Exp. (84), e51178, doi:10.3791/51178 (2014).

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