Summary
Colture Streptomyces liquidi coltivati sono caratterizzati da pellet miceliali che sono eterogenei in termini di dimensioni. Siamo qui descrive un metodo per analizzare e ordinare tali pellets in maniera high-throughput. Questi pellet possono essere utilizzati per ulteriori analisi, che fornirà porta a comprendere e controllare la crescita eterogeneità.
Abstract
Streptomycetes sono batteri filamentosi suolo che vengono utilizzati nell'industria per la produzione di enzimi e antibiotici. Quando coltivate in bioreattori, questi organismi formano reti di ife interconnesso, noto come pellet, che sono varie per dimensione. Qui si descrive un metodo per analizzare e pellets ordinamento miceliali utilizzando un complesso di oggetti parametrici Analyzer e Sorter (COPAS). Istruzioni dettagliate sono presenti per l'uso dello strumento e l'analisi statistica dei dati di base. Abbiamo, inoltre, descrive come pellet possono essere ordinati in base alle impostazioni definite dall'utente, che permette l'elaborazione a valle, come l'analisi del RNA o contenuto proteico. Utilizzando questa metodologia il meccanismo di base la crescita eterogenea può essere affrontato. Ciò sarà determinante per migliorare streptomycetes come una fabbrica di cellule, considerando il fatto che la produttività correla con dimensioni pellet.
Introduction
Streptomycetes sono batteri filamentosi suolo che sono ben noti per la loro abilità a rendere antibiotici, nonché composti che possono essere usati come immunosoppressori o per combattere le infezioni fungine o 1,2 cancro. Inoltre, questi organismi producono enzimi che sono di interesse per una vasta gamma di applicazioni industriali 3. La maggior parte di questi composti commercialmente interessanti sono prodotte in bioreattori. Crescita di streptomycetes in bioreattori è caratterizzata dalla formazione di strutture complesse di ife interconnesso, noti come grumi o pellet. Queste strutture multicellulari sono molto eterogenei rispetto alle dimensioni 4 e possono raggiungere dimensioni che sono più di un milione di volte più grande di un batterio unicellulare come Escherichia coli o Bacillus subtilis. Sebbene eterogeneità è considerato come un tratto utile in sistemi biologici naturali 5, è considerato un trabocchetto produzione nel settore. Biocoltivazioni reattori devono essere riproducibile e controllabile per ottenere i massimi rendimenti possibili. Una comprensione dettagliata del ruolo di ciascuno dei tipi di pellet in un bioreattore è quindi fondamentale migliorare streptomycetes come fabbriche.
La citometria a flusso è comunemente usato per analizzare le singole celle di una popolazione 6. Citofluorimetri possono acquisire informazioni multiparametrica simultaneamente caratteristiche delle cellule (come le dimensioni, la densità e multicolore fluorescenza) di misura. In questo modo, le proprietà della cella possono essere correlati contribuendo in tal modo alla nostra comprensione di eterogeneità all'interno di una cultura e l'esistenza di distinte popolazioni di cellule 6. Strumenti più specializzati hanno reso possibile ordinare le celle in base a parametri definiti dall'utente. Per esempio, i mutanti possono essere sottoposti a screening. A seguito di ordinamento, tali cellule mutanti possono essere coltivati per un'ulteriore caratterizzazione. Questo ha già dimostrato di essere utile, tra l'altro,per migliorare la produttività dei ceppi 7,8. Gli ugelli di citofluorimetri tipicamente consentono il passaggio di cellule con un diametro massimo di circa 10 micron. Pertanto, pellets di streptomycetes non possono essere analizzati con citofluorimetri regolari. Essi, tuttavia, possono essere analizzati con l'oggetto complesso Parametric Analyzer e Sorter (COPAS). Come citofluorimetri regolari, COPAS può acquisire i dati multiparametrici di particelle in un alto modo di throughput. A seconda del tipo di COPAS 10-1,500 micron particelle di dimensioni possono essere analizzati. Inoltre, permette di classificare delle singole particelle che possono essere usati per la coltivazione o analisi a valle, come l'isolamento di DNA, RNA, o proteine. COPAS è stato inizialmente progettato per l'analisi e la cernita di piccoli organismi pluricellulari, come il nematode Caenorhabditis elegans 9, e degli embrioni di Drosophila e larve 10. Gli strumenti sono stati utilizzati anche per zebrafish 11 bisnd per funghi filamentosi 12,13. Questi ultimi organismi formano anche pellets miceliali che sono anche più grandi di quelle formate da batteri filamentosi. Abbiamo recentemente dimostrato che l'uso di COPAS è anche fattibile per streptomycetes 4. Siamo qui descriviamo la procedura sperimentale per l'utilizzo dei COPAS per valutare pellet eterogeneità Streptomyces coelicolor, compresi i dettagli sulla metodologia per ordinare pellet in base alle dimensioni. Si prega di notare, tuttavia, che questo metodo può essere utilizzato anche per l'analisi di altri streptomycetes-pellet formatura.
Protocol
La procedura di analisi e liste Streptomyces pellets da una due giorni di età coltura liquida-grown è schematicamente rappresentato in figura 1. Dettagli per il metodo sono riportati di seguito.
1. Crescita (compresa la preparazione dei Media e buffer)
- Preparare 1 L di 10x tampone fosfato salino (PBS; 80 g di NaCl, KCl 2 g, 14,4 g di Na 2 HPO 4, 2,4 g di KH 2 PO 4 in 1 L di acqua distillata portata a pH 7,4). Al momento dell'uso aggiungere 100 ml di PBS 10x a 900 ml di acqua distillata per ottenere 1 L di PBS.
- Preparare 1 L di mezzo YEME (3 g di estratto di lievito Difco, 5 g Bacto peptone, 3 g di estratto di malto Oxoid, 10 g di glucosio, 340 g di saccarosio, acqua distillata fino a 1 L) e 100 ml di 2,5 M MgCl 2. Sterilizzare entrambe le soluzioni in autoclave. Si noti che anche altri mezzi di Streptomyces possono essere usate 4,14.
- Aggiungere 100 ml YEME medio e 0,2 ml di 2,5 M MgCl 2 a unsterile matraccio da 250 ml Erlenmeyer dotato di metallo avvolto molle. Preparare il maggior numero di palloni come campioni batterici per studiare.
- Inoculare ciascuna beuta con 10 8 spore di Streptomyces per ottenere una concentrazione di spore di 10 6 spore / ml. Crescere i batteri per 2 giorni a 30 ° C agitando a 180 rpm.
2. Campionamento
- Trasferire 5 ml di campione da ciascuna coltura in una provetta Falcon da 15 ml usando una pipetta sterile 5 ml. Agitare delicatamente la cultura, tenendo il campione per assicurare che il campione sia rappresentativo di tutta la cultura.
- Quando i campioni vengono analizzati immediatamente con COPAS senza passaggi di preparazione del campione sono necessari. Mantenere il campione su ghiaccio e procedere al passaggio 3.1 del presente protocollo. Quando i campioni sono analizzati in un punto secondo momento, fissare i pellets come descritto nei passaggi 2,3-2,5 di questo protocollo. Si noti che la fissazione impedisce anche la crescita dei batteri nel sistema tubo quando è ben pulito dopo Analyses. Assicurarsi che la fissazione con formaldeide non ostacola le analisi a valle. Per esempio, l'RNA non poteva essere isolato dal pellet fungine dopo fissazione con formaldeide. Al contrario, l'RNA è stato isolato con successo dopo fissazione con etanolo al 70% 12.
- Aggiungere 600 ml di formaldeide al 37% a 5 ml di campione e miscelare invertendo il 3x tubo. Fissare i campioni in ghiaccio per 30 min.
- Centrifugare i campioni a 2.500 xg in un rotore fissato a 4 ° C per 10 min. Rimuovere con attenzione il surnatante e lavare il pellet con 5 ml di PBS.
- Ripetere passo 2.4 in modo che i granuli vengono lavate con PBS 2x. I campioni possono essere conservati in PBS a 4 ° C per diverse settimane.
3. Analisi COPAS
- Assicurarsi che il COPAS Inoltre, la pompa, il computer e il laser ad argon 488 nm siano accesi e avviare il software Biosort. Anche se acceso, il laser sarà ancora in modus standby.
- Controllare se la bottiglia del liquido guaina è pieno e ilbottiglia di scarto è vuoto.
- Fare clic su 'Start' e poi 'RUN' per cambiare il laser ad argon 488 nm dalla modalità standby a on. Dopo circa 60 secondi, quando il laser è acceso, fare clic su 'DONE'.
- Controllare i manometri. Le pressioni per 'guaina', 'campione', 'Sorter' e 'pulito' dovrebbe leggere intorno 4.0, 0.5, 2.7 e 10.9, rispettivamente.
- Fare clic sulla casella di controllo accanto a 'OK Pressure'. Il sistema, quindi, innesca la cella di flusso ed è pronto per l'uso.
- Le impostazioni standard sono assunti con 'Delay' alle 11 e 'larghezza' 7. Le soglie sono fissati a 50 per i 'segnali' e 40 per 'TOF minimo', con TOF rappresenta il tempo di volo. (Per completezza: tutti i 'guadagni' sono fissati a 1, il trigger è impostato su EXT (estinzione) e nella scheda 'Configuration' sotto 'Scegli velocità di scansione' 2.50 MHz viene scelto coincidenza è impostato su 'avanzata'.).
- Rimuovere l'acqua rimanente dal una coppa campionid aggiungere 0.1 ml di campione Streptomyces dal punto 2.2 o 2.5 in tazza insieme con PBS (circa 50 ml). Assicurarsi che la coppa del campione sia chiuso correttamente.
- Fare clic su 'Acquire' per avviare la raccolta dei dati. Gestire la velocità del flusso di ottenere tra i 30-50 eventi al secondo. Se la portata è troppo alta, aggiungere PBS alla coppa campione. Se la velocità di flusso è troppo bassa, aggiungere più campione.
- Quando almeno 2.500 eventi vengono raccolti click 'STOP'. Per salvare 'Store' tutti i dati di click e salvare il file per la successiva analisi statistica. Il software Biosort salva i dati in quattro file, di cui solo il file txt. Sarà utilizzata per la successiva analisi.
- Pulire la coppa campione rimuovendo il campione con una siringa da 50 ml e lavaggio con acqua 2x.
- Ripetere i passaggi 3,7-3,10 finché non vengono analizzati tutti i campioni.
4. Analisi dei dati
- Aprire il file txt. Ed eliminare dati con una EXT inferiore a 25 (utilizzando per esempio MS Excel). Questocorrisponde a detriti e frammenti di ife sciolti (per Aspergillus niger tutti i dati con un EXT inferiore a 150 vengono scartate) 4,12. Quindi, salvare tutti i Tof in una colonna in una pianura file (per molti file di dati può essere automatizzato in R linguaggio di programmazione, disponibile da: 'txt'. http://www.r-project.org ).
- Assicurarsi SciLab (versione 5.3.2 o più recente da http://www.scilab.org/) viene installato insieme con la libreria 'fittools ", che è disponibile, insieme al manuale, da:
http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip
http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf - Avviare SciLab ed eseguire le funzioni necessarie della biblioteca fittools per modellare i dati. In breve: Installare la libreria fittools come indicato nel manuale (necessaria solo una volta).
- Caricare la libreria fittools.
- Leggere i dati (file '. Txt') in SciLab.
- Log trasformare i dati (logaritmo naturale è la funzione log di default).
- Montare il modello di 2 popolazioni ai dati.
- Tracciare un grafico con l'istogramma e il modello (opzionale).
- Bootstrap i dati (1.000 repliche).
- Montare il modello per i dataset bootstrap.
- Ottenere la fiducia intervalli di stime dei 5 parametri. Questo fornirà informazioni sulla frazione partecipazione (p) delle popolazioni, i loro mezzi (2 μ 1 e μ 2) e le deviazioni standard allegate (α 1 e α 2). Inoltre, gli intervalli di confidenza al 95% sono determinate dal rimontaggio con il modello bootstrapping (1.000 repliche) 12,13,15. Quando gli intervalli di confidenza del mezzo non si sovrappongono e l'intervallo di confidenza del p è tra 0,025-0,975 il set di dati può essere spiegata come una combinazione di due popolazioni di distribuzioni normali. (Nota thalla frazione partecipazione di piccoli pellet è p, mentre la partecipazione di grandi pellets è 1 -. p) La relazione tra TOF e il diametro di un pellet Streptomyces uguale 0,57 × TOF + 159 micron 4.
- Nel caso in cui due popolazioni si trovano impiego i Tof medi ordinamento parametri nel COPAS come superiore e limite inferiore per ordinare ulteriormente le piccole e grandi pellet. Si noti che anche altri parametri di selezione possono essere scelti a seconda delle esigenze dell'utilizzatore.
5. Pellet ordinamento
- Caricare il campione Streptomyces che deve essere risolto come descritto al punto 3.7.
- Impostare 'Ordinamento Limits' e fornire dettagli sul minima (Lo) e massima (Hi) valori TOF. In alternativa, impostare una zona selezionando 'Regioni' e poi 'Definisci Porta Regione' per selezionare le palline con le dimensioni o le proprietà desiderate.
- Posizionare un tubo da 50 mlraccogliere più palline che soddisfano i parametri di ordinamento. In alternativa, una piastra di micro-titolazione può essere utilizzato per ordinare singoli pellet. Sono necessari pellets multiple (10 4 -10 5) per il DNA e l'estrazione delle proteine. Un singolo pellet è sufficiente per l'analisi qPCR dell'espressione genica, ma più pellets sono necessari per l'RNA sequenziamento.
- Decidere e impostare il numero di palline che devono essere ordinati e fare clic su 'Sort manuale' per ordinare per i parametri selezionati. Quando viene raggiunta la quantità impostata di pellet, l'ordinamento termina automaticamente.
- Rimuovere rimasto campione con una siringa da 50 ml dalla coppa campioni e lavare la tazza con 2x acqua. Ripetere i passaggi 5,1-5,5 se altri campioni devono essere ordinati.
- Prima di spegnere il COPAS sciacquare la tazza del campione con acqua per rimuovere i rimanenti pellet e pulire la coppa campioni con il 70% EtOH e / o 2% di ipoclorito in acqua. Eseguire un campione di acqua clorata per pulire l'intero sistema e ripetere questo con acqua. Empty tegli traboccare contenitore e pulire o sostituire il filtro che risiede in questo contenitore.
- Al termine, fare clic su 'STOP' per rilasciare la pressione dal sistema. Quando il motore si ferma chiudere il programma e fare clic su 'arresto senza rimuovere'. Quindi spegnere il computer, il COPAS, il laser, e la pompa.
Representative Results
Misure COPAS di pellet Streptomyces
Streptomycetes formano pellets miceliali in colture liquide che hanno una vasta gamma di formati. Per analizzare distribuzione dimensionale pellet, un liquido di 2 giorni di età coltivate cultura Streptomyces coelicolor è stato sottoposto a grande flusso di particelle citometria utilizzando un COPAS Plus. Profiler munita di un ugello ad 1 mm. Un tipico output COPAS è un grafico a dispersione, come visualizzato in figura 2A. L'asse x rappresenta il tempo di volo (TOF), che è correlato con la dimensione pellet (cioè ci vuole più tempo per pellet di grandi dimensioni per passare il raggio laser). L'asse y indica l'estinzione, che rappresenta la densità ottica dell'oggetto. Ogni punto nel diagramma di dispersione corrisponde ad un singolo evento, cioè un singolo pellet passare il raggio laser. È importante sottolineare che, quando il campione è troppo concentrato (cioè quando il laser rileva più di 100 eventi / sec), il COPAS spesso non riesce a rilevare singole pellets. Questo porta a valori TOF falsi troppo elevati. Diluizione del campione riduce i valori medi TOF, fino ad un punto in cui un'ulteriore diluizione fa alcun impatto più TOF. Questo punto è raggiunto quando circa 100 pellets / sec stati analizzati.
Rappresentare i punti di dati in un istogramma indica che le dimensioni non sono distribuiti normalmente (Figura 2B). La distribuzione sembra essere inclinato verso destra. Entra trasformando il set di dati, inoltre, non ha portato ad una distribuzione normale (Figura 2C). Per valutare se la distribuzione delle dimensioni può essere spiegato assumendo una miscela di due distribuzioni normali i dati sono stati matematicamente modellato 12,15. Modeling infatti indicato che la distribuzione delle dimensioni può essere spiegato assumendo l'esistenza di due distinte popolazioni di pellets. La frazione di piccole palline consisteva di 92% di tutti i pellet con una dimensione media di 248 micron, mentre la popolazione di grande pelconsente (8% di tutte le pellet) ha una dimensione media di 319 micron (notare che due popolazioni si presume sussistere quando la frazione di partecipazione è compresa tra 2,5-97,5%).
Ordinamento di pellet Streptomyces in base alle dimensioni
Micro-colonie delle popolazioni di grandi e piccoli pellet sono stati ordinati. A tal fine, le dimensioni medie pellet delle due popolazioni sono stati usati per definire i confini per l'ordinamento. Pellets di dimensioni inferiori a 248 micron sono stati considerati dalla piccola popolazione pellet, mentre pellets di dimensioni superiori a 319 micron sono stati considerati dal grande popolazione pellet (Figura 3), in modo da limitare l'ordinamento di pellets dalla sovrapposizione delle due dimensioni distribuzioni. Analisi microscopica di pellet ordinati mostrato le loro dimensioni distinte (Figura 3). I pellets raccolti possono essere ulteriormente utilizzati per DNA, RNA, proteine o isolamenti.
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Figura 1. Rappresentazione schematica del setup sperimentale per misurare e analizzare pellets Streptomyces utilizzando COPAS. Per dettagli, vedere le procedure sperimentali. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Dimensione Pellet eterogeneità di culture Streptomyces liquido cresciuto. Analisi COPAS di un 2-day-old S. cultura coelicolor YEME (A) indica che le dimensioni pellet (indicati come Time of Flight) sono valori normalmente non distribuired (B), e non diventi così quando log-trasformato (C). Invece, sono stati rilevati due popolazioni di pellet che si differenziano per TOF (e quindi di dimensioni). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Frazionamento di pellet Streptomyces a seconda delle dimensioni. Pellet con dimensioni inferiori a 248 micron (indicata in rosa) sono stati considerati piccoli pellet, che pellet con una dimensione maggiore di 319 micron (indicato in blu) sono stati considerati grandi pellet. Analisi microscopica confermato la differenza di dimensioni. Si noti che queste misure sono state calcolate a partire dai dati di log-trasformati utilizzando la relazione descritta tra TOF e il diameter di un pellet Streptomyces, che equivale a 0,57 × TOF + 159 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Discussion
Citometria a flusso ha permesso l'analisi ad alta velocità di un gran numero di singole cellule, che ha contribuito alla nostra comprensione di eterogeneità nelle popolazioni clonali 6. Citometria a flusso regolare non è fattibile per l'analisi del pellet miceliali pluricellulari di streptomycetes e funghi. Il nostro lavoro ha dimostrato che l'analisi high-throughput del pellet Streptomyces è fattibile utilizzando COPAS. La procedura descritta qui è semplice, veloce e altamente riproducibile. Il parametro fondamentale tenere a mente durante il funzionamento dello strumento è la velocità di flusso, che non deve superare i 100 eventi / sec (passo 3.8 del presente protocollo). Se la concentrazione pellet, e quindi anche la velocità del flusso, diventa troppo elevata, i valori TOF vengono calcolati correttamente, poiché lo strumento non rileva singoli pellet. Sufficientemente diluizione del campione con l'aggiunta di PBS supera questo problema.
Limitazioni
L'uso COPAS più d qui ha un diametro dell'ugello di 1 mm, che è adatto per misurare particelle con una dimensione che vanno 30-700 micron. Questo ugello consente pertanto pellets formate da streptomycetes misurazione. Nel caso dei funghi filamentosi micro-colonie possono essere più grandi, che limita l'applicabilità generale del COPAS Plus.. Il COPAS XL può misurare particelle fino a 1.500 micron di dimensione ma la sua sensibilità nella gamma inferiore di diametro è inferiore rispetto a quella del COPAS Plus.. Sia il COPAS Plus e il COPAS XL non è in grado di analizzare le particelle di dimensioni inferiori a 30 micron. Ciò implica che le singole spore microbiche o cellule non possono essere analizzati. Inoltre, il COPAS non può analizzare con precisione piccoli aggregati di spore e cellule o le piccolissime micro-colonie. Per questo, devono essere utilizzati analizzatori di cellule normali. Questa limitazione viene superata dalla Biosorter di Union Biometrica capace di analizzare particelle nell'intervallo 1-1,500 micron. Il premio acquisto è comunque alto.
Il COPAS è uno strumento robusto che è facile da usare. Tuttavia, a volte pellet non vengono rilevate dopo il caricamento di un campione nella tazza campione e iniziare la misurazione. La causa è in genere un tubo di entrata intasato, che può essere facilmente risolto premendo il comando 'pulito'. Questo forzerà il pellet indietro dal sistema di tubi nella tazza campione. Un motivo in alternativa potrebbe essere che il coperchio non è posizionato correttamente sulla tazza del campione. Questo porta alla perdita di pressione e la mancata concomitante per rilevare pellets.
Significato e direzioni future
Abbiamo qui concentrati sull'analisi della dimensione pellet ma l'installazione COPAS è anche in grado di analizzare e liste basato su fluorescenza e densità. Rivelazione della fluorescenza consente di analizzare l'espressione genica basato su reporter come GFP. Inoltre, la composizione di cellule può essere valutata. Ancora più potente è la possibilità di separare pellets in base a questi parametriTERS. Pellets ordine possono essere utilizzati per le analisi a valle, compresi tutti-omiche studi. Infatti, abbiamo già risolto 60.000 grandi e 200.000 piccole palline, e dimostrato che il proteoma era significativamente differente tra grandi e piccole palline 4. Questa tecnologia fornisce dunque nuovi contatti per migliorare streptomycetes come fabbriche di cellule.
Il vantaggio principale della tecnologia COPAS è il tempo. Precedenti studi sulla pellet cellulari sono stati eseguiti utilizzando la microscopia, e questo limita il numero di pellet che possono essere analizzati fino a diverse centinaia 16. Studi di microscopia già suggerito l'esistenza di due popolazioni di pellets in Streptomyces colture liquide cresciuto 16. Infatti, due popolazioni di pellet sono stati rilevati, indipendentemente dalle condizioni di coltura in un gran numero di differenti streptomycetes 4. Questa eterogeneità dimensione non è limitata a streptomycetes filamentosi, ma è stata osservata anche in funghi filamentosi 12 </ Sup>. In tutti i casi, i meccanismi alla base della eterogeneità non sono ancora noti. La possibilità di ordinare pellet in base alle dimensioni e fluorescenza ci permette di svelare tali meccanismi.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COPAS Plus | Union Biometrica | PLUS | Large particle flow cytometer including lasers and software |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | PBS component |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | PBS component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | PBS component |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P9791 | PBS component |
| Difco Yeast Extract | BD Biosciences | 210933 | Media component |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | Media component |
| Oxoid Malt Extract | Fisher Scientific | OXLP0039B | Media component |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | Media component |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Media component |
| MgCl2•6H2O | Sigma Aldrich | M2670 | Media components. Add after autoclaving. |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | F8775 | Fixation of pellets |
| Sodium Hypochlorite Solution | Sigma Aldrich | 71696 | For cleaning of the instrument |
| EtOH | VWR | 20816.367 | For cleaning of the instrument |
| Erlenmeyer Flask (250 ml) | Fisher Scientific | 214-1132 | Culture flask for growing Streptomyces |
| Springs | Verenfabriek De Spiraal | Custom-Made | Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm |
| Sterile Centrifuge Tube (15 ml) | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Syringes (50 ml) | Sigma | Z683698 |
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