Summary
Culturas Streptomyces líquidos cultivados se caracterizan por sedimentos miceliales que son heterogéneos en tamaño. Se describen un método para analizar y clasificar dichos gránulos en una forma de alto rendimiento. Estos pellets se pueden utilizar para otros análisis, que proporcionarán pistas para comprender y controlar la heterogeneidad del crecimiento.
Abstract
Estreptomicetos son bacterias del suelo filamentosos que se utilizan en la industria para la producción de enzimas y antibióticos. Cuando se cultiva en biorreactores, estos organismos forman redes de hifas interconectada, conocida como pellets, que son heterogéneos en tamaño. Aquí se describe un método para analizar y pellets de tipo de micelio usando un Objeto Complejo paramétrico Analyzer y Clasificador (COPAS). Las instrucciones detalladas se indican para el uso del instrumento y el análisis estadístico básico de los datos. Además, nos describimos como bolitas se pueden clasificar de acuerdo a los ajustes definidos por el usuario, lo que permite el procesamiento aguas abajo, tales como el análisis del ARN o de proteínas. Con esta metodología el mecanismo de crecimiento heterogéneo subyacente puede ser abordado. Esto será fundamental para mejorar estreptomicetos como una fábrica de células, teniendo en cuenta el hecho de que la productividad se correlaciona con el tamaño de pellets.
Introduction
Estreptomicetos son bacterias del suelo filamentosos que son bien conocidos por su habilidad para hacer antibióticos, así como compuestos que se pueden utilizar como inmunosupresores o para combatir las infecciones por hongos o 1,2 cáncer. Además, estos organismos producen enzimas que son de interés para una amplia gama de aplicaciones industriales 3. La mayoría de estos compuestos comercialmente interesante se producen en biorreactores. Crecimiento de estreptomicetos en biorreactores se caracteriza por la formación de estructuras complejas de hifas interconectado, conocidos como grumos o gránulos. Estas estructuras multicelulares son altamente heterogénea con respecto al tamaño 4 y pueden alcanzar tamaños que son más de un millón de veces más grande que una bacteria unicelular tal como Escherichia coli o Bacillus subtilis. Aunque la heterogeneidad es considerado como un rasgo beneficioso en sistemas biológicos naturales 5, se considera una trampa de producción en la industria. Biocultivos de reactores tienen que ser reproducible y controlable para obtener los mayores rendimientos posibles. Por tanto, una comprensión detallada de la función de cada uno de los tipos de pellets en un biorreactor es crucial para mejorar estreptomicetos como una fábrica de células.
La citometría de flujo se utiliza comúnmente para analizar células individuales en una población 6. Los citómetros de flujo pueden adquirir información de multiparamétrico midiendo simultáneamente características de las células (tales como el tamaño, la densidad, y la fluorescencia multicolor). De esta manera, las propiedades de celda se pueden correlacionar lo que contribuye a nuestra comprensión de la heterogeneidad dentro de una cultura y de la existencia de distintas poblaciones de células 6. Instrumentos más especializados han permitido clasificar las células de acuerdo con los parámetros definidos por el usuario. Por ejemplo, los mutantes pueden ser examinados. Después de la selección, estas células mutantes pueden ser cultivadas para una caracterización adicional. Esto ya ha demostrado ser útil, entre otros,para mejorar la productividad de las cepas de 7,8. Las boquillas de los citómetros de flujo permiten típicamente para el paso de las células con un diámetro máximo de aproximadamente 10 micras. Por lo tanto, los pellets de estreptomicetos no pueden ser analizados con los citómetros de flujo regulares. Ellos, sin embargo, pueden ser analizados con el objeto complejo paramétrico Analyzer y Clasificador (COPAS). Al igual que los citómetros de flujo regulares, COPAS puede adquirir datos multiparamétricos de partículas en un alto rendimiento. Dependiendo del tipo de COPAS 10-1,500 micras de tamaño de partículas pueden ser analizados. Además, permite la clasificación de las partículas individuales que se pueden utilizar para el cultivo o análisis aguas abajo, tales como el aislamiento de ADN, ARN, o proteínas. COPAS se diseñó inicialmente para el análisis y la clasificación de pequeños organismos multicelulares, tales como los nematodos Caenorhabditis elegans 9, y embriones de Drosophila y larvas 10. Los instrumentos también se han utilizado para el pez cebra 11 unnd 12,13 por hongos filamentosos. Los últimos organismos también forman sedimentos miceliales que son incluso más grandes que las formadas por bacterias filamentosas. Recientemente hemos demostrado que el uso de COPAS también es factible para estreptomicetos 4. Estamos aquí describir el procedimiento experimental para el uso de las COPAS para evaluar la heterogeneidad de pellets en Streptomyces coelicolor, incluyendo detalles sobre la metodología para clasificar pelets de acuerdo al tamaño. Tenga en cuenta, sin embargo, que este método también se puede utilizar para el análisis de otros estreptomicetos formadora de gránulos.
Protocol
El procedimiento para analizar y especie de Streptomyces gránulos a partir de un cultivo líquido-crecido de dos días de edad se representa esquemáticamente en la Figura 1. Detalles sobre el método se dan a continuación.
1. Crecimiento (incluyendo la preparación de los Medios y Buffers)
- Preparar 1 L de 10x tampón fosfato salino (PBS; 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 en 1 L de agua destilada ajustada a pH 7,4). En el momento de uso, añadir 100 ml de PBS 10X a 900 ml de agua destilada para obtener 1 l de PBS.
- Preparar 1 L de medio YEME (3 g extracto de levadura Difco, 5 g de Bacto peptona, 3 g de extracto de malta Oxoid, 10 g de glucosa, 340 g de sacarosa, agua destilada hasta 1 L) y 100 ml de 2,5 M de MgCl 2. Esterilizar en autoclave ambas soluciones. Tenga en cuenta que también otros medios de Streptomyces se pueden utilizar 4,14.
- Añadir 100 ml de medio YEME y 0,2 ml de 2,5 M de MgCl 2 a unmatraz Erlenmeyer de 250 ml estéril equipado con muelles de metal en espiral. Preparar tantos frascos como muestras bacterianas para estudiar.
- Inocular cada matraz con 10 8 esporas de Streptomyces para obtener una concentración de esporas de 10 6 esporas / ml. Haga crecer las bacterias durante 2 días a 30 ° C con agitación a 180 rpm.
2. Muestreo
- Transferir una muestra de 5 ml de cada cultivo a un tubo Falcon de 15 ml utilizando una pipeta estéril ml 5. Agite suavemente la cultura, mientras que la toma de muestras para asegurar que la muestra es representativa de toda la cultura.
- Cuando se analizan muestras de inmediato con COPAS no son necesarias medidas de preparación de muestras. Mantenga la muestra en hielo y vaya al paso 3.1 del presente protocolo. Cuando se analizan las muestras en un momento posterior, fije las pastillas, como se describe en los pasos 2.3 a 2.5 de este protocolo. Tenga en cuenta que la fijación también evita el crecimiento de las bacterias en el sistema de tubos cuando no se limpian adecuadamente después de Analyses. Asegúrese de que la fijación con formaldehído no obstaculiza los análisis. Por ejemplo, el ARN no podía aislarse a partir de pellets de hongos después de la fijación con formaldehído. En contraste, el ARN se aisló con éxito después de la fijación con etanol al 70% 12.
- Añadir 600 l de formaldehído al 37% a 5 ml de muestra y mezclar invirtiendo el tubo de 3x. Fijar las muestras en hielo durante 30 min.
- Centrifugar las muestras a 2500 xg en un rotor fijo a 4 ° C durante 10 min. Retire con cuidado el sobrenadante y lavar las pastillas con 5 ml de PBS.
- Repetir el paso 2.4 de manera que los gránulos se lavan con PBS 2x. Las muestras se pueden almacenar en PBS a 4 ° C durante varias semanas.
3. Análisis COPAS
- Asegúrese de que el COPAS Plus, la bomba, el ordenador y el láser de argón de 488 nm se enciende y se inicia el software Biosort. Aunque encendido, el láser todavía estará en el modus de espera.
- Compruebe si la botella de fluido de funda está lleno y labotella de residuos está vacía.
- Haga clic en "Inicio" y luego "RUN" para encender el láser de argón de 488 nm de espera para el. Después de aproximadamente 60 segundos, cuando el láser está activado, haga clic en "Hecho".
- Compruebe los indicadores de presión. Las presiones para 'vaina', 'Muestra', 'clasificador' y 'Clean' deben leer alrededor de 4,0, 0,5, 2,7 y 10,9 respectivamente.
- Haga clic en la casilla junto a "OK presión". Entonces, el sistema prepara la celda de flujo y está listo para su uso.
- Ajustes estándar son asumidos con 'Delay' a las 11 y 'Ancho' 7. Los umbrales se han fijado en 50 para la "señal" y 40 para "TOF mínimo ', con TOF que representa el tiempo de vuelo-. (Para completar: todos los "beneficios" se han fijado en 1, el disparo se fija en EXT (Extinción) y en la pestaña "Configuración" bajo "Seleccione velocidad de barrido 'se escoge 2,50 MHz coincidencia está en' mejorada '.).
- Eliminar el agua sobrante de la una taza de la muestrad añadir 0,1 ml de muestra Streptomyces desde el paso 2.2 o 2.5 en el vaso junto con PBS (alrededor de 50 ml). Asegúrese de que la cubeta de la muestra está bien cerrada.
- Haga clic en 'Acquire' para iniciar la recopilación de datos. Gestione la velocidad del flujo para obtener entre 30 a 50 eventos por segundo. Si el flujo es demasiado alta, añadir PBS a la copa de muestra. Si la velocidad de flujo es demasiado bajo, añada más muestra.
- Cuando por lo menos 2.500 eventos se recogen click 'STOP'. Para guardar todos los datos haga clic en 'Store' y guardar el archivo para su posterior análisis estadístico. El software Biosort guardará los datos en cuatro archivos, de los cuales sólo el archivo txt. Será utilizado para el análisis posterior.
- Limpiar el vaso de muestra mediante la eliminación de la muestra con una jeringa de 50 ml y lavar con 2x agua.
- Repita los pasos 3.7 a 3.10 hasta que se analizaron todas las muestras.
4. Análisis de Datos
- Abra el archivo txt. Y descartar los datos con un EXT inferior a 25 (utilizando, por ejemplo, MS Excel). Estecorresponde a los restos y fragmentos de hifas sueltos (por Aspergillus niger se descartan todos los datos con un EXT inferior a 150) 4,12. A continuación, guarde todos los TOF en una columna en una llanura de archivo (por muchos archivos de datos esto puede ser automatizado en el lenguaje de programación R, disponible en: 'txt'. http://www.r-project.org ).
- Asegúrese de que SciLab (versión 5.3.2 o posterior de http://www.scilab.org/) se instala junto con la biblioteca 'fittools', que está disponible, junto con el manual, a partir de:
http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip
http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf - Comience SciLab y ejecutar las funciones necesarias de la biblioteca fittools para modelar los datos. En resumen: Instale la biblioteca fittools como se muestra en el manual (sólo es necesario una vez).
- Cargar la librería fittools.
- Leer los datos ('. Txt' de archivos) en SciLab.
- Entrar transformar los datos (logaritmo natural es la función de registro por defecto).
- Ajuste el modelo de 2 poblaciones a los datos.
- Trazar una curva con el histograma y el modelo (opcional).
- Bootstrap los datos (1000 repeticiones).
- Ajuste del modelo a los datos programados previamente.
- Obtener el intervalos de confianza estimados de los 5 parámetros. Esto proporcionará información sobre la fracción de la participación (p) de las poblaciones, de sus medios (2 μ 1 y μ 2) y las desviaciones estándar se acompañan (α 1 y α 2). Por otra parte, los intervalos de confianza del 95% son determinados por la readaptación con el modelo tras bootstrapping (1000 repeticiones) 12,13,15. Cuando los intervalos de confianza de los medios no se superponen y el intervalo de confianza de p está comprendido entre 0,025 hasta 0,975 el conjunto de datos se puede explicar como una combinación de dos poblaciones de distribuciones normales. (Nota ªen la fracción de la participación de pequeñas bolitas es p, mientras que la participación de grandes gránulos es 1 -. p) La relación entre TOF y el diámetro de una pastilla de Streptomyces es igual a 0,57 × TOF + 159 m 4.
- En el caso de que dos poblaciones se encuentran el uso de los medios TOF como ordenar los parámetros en el COPAS como el límite superior e inferior para ordenar los pequeños y grandes gránulos posteriormente. Tenga en cuenta que también otros parámetros de clasificación se pueden seleccionar dependiendo de las exigencias del usuario.
5. Pellet clasificación
- Cargar la muestra de Streptomyces que tiene que ser resuelto como se describe en el paso 3.7.
- Set 'Clasificación Límites' y proporcionar detalles sobre el mínimo (Lo) y máximo (Hi) los valores TOF. Por otra parte, establecer un área seleccionando "Regiones" y luego "Definir Puerta Región 'para seleccionar los pellets con las dimensiones o propiedades deseadas.
- Coloque un tubo de 50 ml arecoger múltiples pastillas que cumplan con los parámetros de clasificación. Alternativamente, una placa de microtitulación se puede utilizar para ordenar gránulos individuales. Se necesitan gránulos múltiples (10 4 -10 5) para el ADN y la extracción de proteínas. Una sola pastilla es suficiente para el análisis de qPCR de la expresión génica, pero se necesitan múltiples pastillas para la secuenciación de ARN.
- Decidir y establecer el número de pastillas que deben ser ordenados y haga clic en 'Ordenar manual' para clasificar para los parámetros seleccionados. Cuando se alcanza la cantidad fijada de pastillas, la clasificación finaliza automáticamente.
- Retire la izquierda sobre la muestra con una jeringa de 50 ml de la taza de la muestra y lavar la taza con 2x agua. Repita los pasos 5.1 a 5.5 si otras muestras que habrá que resolver.
- Antes de apagar las COPAS enjuagar la taza de la muestra con agua para eliminar los gránulos restantes y limpie el recipiente para muestras con EtOH al 70% y / o 2% de hipoclorito en el agua. Ejecutar una muestra de agua tratada con cloro para limpiar todo el sistema y repita esto con agua. Empty tse desborde recipiente y limpie o reemplace el filtro que se encuentra en este contenedor.
- Cuando haya terminado, haga clic en "STOP" para liberar la presión del sistema. Cuando el motor se detiene cerrar el programa y haga clic en "apagado sin tener que eliminar '. Luego apague el ordenador, el COPAS, el láser, y la bomba.
Representative Results
Mediciones COPAS de pellets de Streptomyces
Estreptomicetos forman sedimentos miceliales en cultivos líquidos que tienen una amplia gama de tamaños. Para analizar la distribución de tamaño de los gránulos, un líquido 2-días de edad crecido Streptomyces coelicolor cultura fue sometido a flujo de partícula grande citometría usando un COPAS Plus de perfiles equipada con una boquilla de 1 mm. Una salida COPAS típico es un gráfico de dispersión tal como se visualiza en la Figura 2A. El eje x representa el (TOF) de tiempo-de-vuelo, que se correlaciona con el tamaño de precipitado (es decir, se tarda más tiempo para gránulos más grandes para pasar el haz de láser). El eje y muestra la extinción, que representa la densidad óptica del objeto. Cada punto en el gráfico de dispersión corresponde a un evento individual, es decir, una única pastilla de pasar el haz de láser. Es importante destacar que cuando la muestra está demasiado concentrada (es decir, cuando el láser detecta más de 100 eventos / seg), el COPAS con frecuencia no detecta p individuoellets. Esto conduce a valores de TOF falsas que son demasiado altos. La dilución de la muestra reduce los valores medios TOF, hasta un punto en el que más de dilución ya no hace impacto TOF. Este punto se alcanza cuando se analizaron aproximadamente 100 bolitas / seg.
Trazado de los puntos de datos en un histograma indica que los tamaños no se distribuyen normalmente (Figura 2B). La distribución parece estar sesgado hacia la derecha. Iniciar la transformación del conjunto de datos también no dio lugar a una distribución normal (Figura 2 C). Para evaluar si la distribución de tamaño puede explicarse por el supuesto de una mezcla de dos distribuciones normales de los datos se modela matemáticamente 12,15. Modelado de hecho indicó que la distribución del tamaño se puede explicar suponiendo la existencia de dos poblaciones distintas de gránulos. La población de pequeños gránulos consistió en 92% de todos los gránulos con un tamaño medio de 248 micras, mientras que la población de gran PELpermite (8% de todos los gránulos) tenía un tamaño medio de 319 micras (tenga en cuenta que se supone que dos poblaciones de existir cuando la fracción de la participación es entre 2,5 a 97,5%).
Clasificación de pellets de Streptomyces de acuerdo al tamaño
Fueron ordenados micro-colonias de las poblaciones de gránulos grandes y pequeños. Para este fin, se utilizaron los tamaños medios de pellets de las dos poblaciones para definir los límites para la clasificación. Pellets más pequeñas que 248 micras se considera que a partir de la población de pellets pequeña, mientras que gránulos más grandes que 319 micras se considera que a partir de la gran población de pellets (Figura 3), a fin de limitar la clasificación de gránulos a partir de la parte de superposición de los dos tamaño distribuciones. El análisis microscópico de los pellets ordenados mostró sus tamaños distintos (Figura 3). Los gránulos recogidos se pueden utilizar adicionalmente para el ADN, ARN, o aislamientos de proteína.
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Figura 1. Representación esquemática del montaje experimental para medir y analizar el uso de pellets de Streptomyces COPAS. Para obtener más detalles, consulte los procedimientos experimentales. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Heterogeneidad tamaño Pellet en cultivos de Streptomyces líquidos de cosecha propia. Análisis COPAS de un 2 días de edad S. cultura YEME coelicolor (A) indica que los tamaños de pellets (indicado como tiempo de los valores de vuelos) Normalmente no distribuyed (B), y tampoco convertirse así que cuando log-transformado (C). En cambio, se detectaron dos poblaciones de gránulos que difieren en TOF (y por tanto el tamaño). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. El fraccionamiento de pastillas Streptomyces según el tamaño. Pellets con un tamaño menor que 248 micras (indicado en rosa) fueron considerados como pequeñas bolitas, mientras que se consideraron gránulos con un tamaño superior a 319 micras (indicado en azul) para ser grandes gránulos. El análisis microscópico confirmó la diferencia de tamaño. Tenga en cuenta que estos tamaños se calcularon a partir de los datos de transformación logarítmica utilizando la relación descrita entre TOF y la diameter de una pastilla Streptomyces, lo que equivale a 0,57 × TOF + 159 m. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Discussion
La citometría de flujo ha permitido el análisis de alta velocidad de grandes números de células individuales, lo que contribuyó a nuestra comprensión de la heterogeneidad en las poblaciones clonales 6. Citometría de flujo regular no es factible para el análisis de los sedimentos miceliales multicelulares de estreptomicetos y hongos. Nuestro trabajo ha demostrado que el análisis de alto rendimiento de los pellets de Streptomyces es factible utilizando COPAS. El procedimiento que se describe aquí es simple, rápido y altamente reproducible. El parámetro fundamental a tener en cuenta durante el funcionamiento del instrumento es la velocidad de flujo, que no debe superar los 100 eventos / seg (paso 3.8 de este protocolo). Si la concentración de sedimento, y por lo tanto también la velocidad de flujo, se hace demasiado alta, los valores TOF se calcularon mal porque el instrumento no detecta gránulos individuales. Suficientemente dilución de la muestra por la adición de PBS que supera este problema.
Limitaciones
El uso COPAS Plus d aquí tiene un diámetro de boquilla de 1 mm, que es adecuado para la medición de partículas con un tamaño que varía desde 30 hasta 700 micras. Por tanto, esta boquilla permite la medición de gránulos formados por estreptomicetos. En el caso de los hongos filamentosos los micro-colonias pueden ser más grandes, lo que limita la aplicabilidad general de la COPAS Plus. El COPAS XL puede medir partículas de hasta 1500 m de tamaño, pero su sensibilidad en el rango inferior de diámetro es menor en comparación con la de la COPAS Plus. Tanto el COPAS Plus y el COPAS XL no pueden analizar las partículas menores de 30 micras. Esto implica que las esporas o células microbianas individuales no pueden ser analizados. Además, la COPAS no puede analizar con precisión pequeños agregados de células o esporas y las muy pequeñas micro-colonias. Para esto, se deben utilizar analizadores celulares regulares. Esta limitación se supera por la Biosorter de Unión Biometrica, que puede analizar partículas en el rango de 1-1,500 m. El premio compra sin embargo es mayor.
El COPAS es un instrumento robusto que es fácil de operar. Sin embargo, a veces granulado no se detectan después de cargar una muestra en la copa de muestra y de iniciar la medición. La causa suele ser un tubo de entrada obstruido, que puede ser resuelto fácilmente pulsando el comando "limpia". Esto obligará a los pellets de vuelta desde el sistema de tubería en la copa de muestra. Una razón alternativa podría ser que la tapa no está correctamente colocado en la copa de muestra. Esto conduce a la pérdida de presión y el fracaso concomitante para detectar gránulos.
Importancia y direcciones futuras
Nos centramos aquí en el análisis del tamaño del gránulo pero la configuración COPAS también es capaz de analizar y clasificar basado en la fluorescencia y la densidad. Detección de fluorescencia permite analizar la expresión de genes en base a los periodistas, como las buenas prácticas agrarias. Además, la composición de las células se puede evaluar. Aún más poderosa es la opción para separar pelets de acuerdo con estos parámetrostros. Gránulos Ordenado se pueden utilizar para los análisis posteriores, incluyendo estudios de todos-ómicas. De hecho, hemos ordenado previamente 60.000 gránulos grandes y 200.000 pequeñas, y demostramos que el proteoma fue significativamente diferente entre las grandes y pequeñas bolitas 4. Por tanto, esta tecnología proporciona nuevas pistas para mejorar streptomycetes como fábricas celulares.
La principal ventaja de la tecnología COPAS es el tiempo. Estudios anteriores sobre sedimentos celulares se realizaron utilizando microscopía, y esto limita el número de gránulos que se pueden analizar hasta varios cientos 16. Los estudios microscópicos ya se ha sugerido la existencia de dos poblaciones de gránulos en las culturas 16 Streptomyces líquidos de cosecha propia. De hecho, dos poblaciones de gránulos se detectaron independientemente de las condiciones de cultivo en un gran número de diferentes estreptomicetos 4. Esta heterogeneidad de tamaño no se limita a estreptomicetos filamentosos, pero también se observó en hongos filamentosos 12 </ Sup>. En todos los casos, aún no se conocen los mecanismos subyacentes de la heterogeneidad. La posibilidad de ordenar los pellets de acuerdo con el tamaño y la fluorescencia nos permite desentrañar esos mecanismos.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COPAS Plus | Union Biometrica | PLUS | Large particle flow cytometer including lasers and software |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | PBS component |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | PBS component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | PBS component |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P9791 | PBS component |
| Difco Yeast Extract | BD Biosciences | 210933 | Media component |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | Media component |
| Oxoid Malt Extract | Fisher Scientific | OXLP0039B | Media component |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | Media component |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Media component |
| MgCl2•6H2O | Sigma Aldrich | M2670 | Media components. Add after autoclaving. |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | F8775 | Fixation of pellets |
| Sodium Hypochlorite Solution | Sigma Aldrich | 71696 | For cleaning of the instrument |
| EtOH | VWR | 20816.367 | For cleaning of the instrument |
| Erlenmeyer Flask (250 ml) | Fisher Scientific | 214-1132 | Culture flask for growing Streptomyces |
| Springs | Verenfabriek De Spiraal | Custom-Made | Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm |
| Sterile Centrifuge Tube (15 ml) | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Syringes (50 ml) | Sigma | Z683698 |
References
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