Summary
אנו מציגים טכניקה חדשה לקרינה סלקטיבית בתיוג באתרו של תאי phagocytic פעילים, אשר ברור מעל גופות תא בשבץ מוחי. הגישה היא חשובה להערכת תגובת המוח לאיסכמיה כי רק חלק קטן מphagocytes נוכח במוח איסכמי להשתתף בפינוי של מוות של תאים.
Abstract
אנו מתארים גישת histochemical חדשה להדמיה של פינוי phagocytic באיסכמיה המוחית המוקדים. הגישה מאפשרת הלימוד של חיסול של תאים מתים בשבץ מוחי על ידי phagocytes פסולת הניהול של כל שושלת סלולרית. למרות מספר רב של תאים ממקורות שונים כי הם מסוגלים phagocytosis נמצאים במוח איסכמי, רק חלק מהם באופן פעיל לבלוע ולעכל את גופות תא. ההדמיה סלקטיבית, כימות והניתוח של פסולת ניהול phagocytic פעיל אלה מסייעים בהערכת תגובת המוח לאיסכמיה. ניקוי יעיל מוות של תאים חשוב להתאוששות מפציעה המוח איסכמי, כפי שהוא פותח את הדרך לתהליכי התחדשות שלאחר מכן. אי לנקות את הגופות יביאו לתגובה רעילה הנגרמת על ידי דנ"א וחלבונים שאינם מושפלים. ההליך המתואר משתמש בבדיקות ניאון ligated אופן סלקטיבי על ידי topoisomerase נגיפי להפסקות DNA אופייניות המיוצרים בכל phagocytes במהלך היבלעותועיכול של תאים שניזוקו באופן בלתי הפיך על ידי איסכמיה. השיטה היא כלי חדש לחקירה של תגובת המוח לפגיעה איסכמית.
Introduction
שבץ איסכמי גורם לשינויים עמוקים ברקמת המוח שנפגעה. הוא יוזם מוות של תאים מסיבי, מה שמוביל להפעלה המהירה של תאי phagocytic תושב ממוצא microglial. הוא גם מגדיר את חדירה של מוח איסכמי על ידי סוגים שונים של phagocytes המקצועי דם נגזרות כוללים נויטרופילים, מקרופאגים, הדנדריטים, ותאי פיטום 1,2.
הוא עדיין התלבט אם את התגובה הזאת לפגיעה איסכמית משחקת תפקיד חיובי או שלילי. למרות phagocytosis לאחר שבץ יכול להיות מועיל, כי זה מנקה את תאים מתים ומדכא דלקת, היא גם מייצרת מיני חמצן תגובתי רעילים המשפיעה על הישרדות עצבית ומחריפה את נזק לרקמות 1-5.
בעוד מספר סוגים של תאי phagocytic לחדור מוח איסכמי, לא כולם להשתתף בפסולת ניהול על ידי האופפת גופות תא ופינית את הדרך לתהליכי התחדשות 1-3. CR זהeates דרישה לזיהוי סלקטיבי של תאי פסולת ניהול המבצעות סליקת phagocytic של מוות של תאים בשבץ מוחי. כאשר תאי הדמיה פסולת ניהול פעילים כזה, זה גם חשוב כדי לענות על השאלה של מידת יעילותם לבזות את גופות תא אפופות. השפלה היעילה ומלאה של ה-DNA של התא למות בphagocytosis היא חיונית משום שהוא מונע חיסון עצמי ושחרורו של חומר גרעיני פתולוגי 6.
כאן אנו מציגים בדיקות חדשות העושות שימוש בהפסקות DNA ספציפיות כסמנים של תאי phagocytic פעילים. הפסקות חתימה אלה מיוצרות באופן בלעדי במהלך הפירוק של גרעינים נבלעו בתוך תאים פונקציונליים פסולת ניהול. לכן הבדיקות באופן סלקטיבי רק את תווית phagocytes כי לבלוע ולעכל באופן פעיל גופות סלולריות. הם גם מאפשרים התבוננות בעוצמה והשלמת פירוק ה-DNA לאחר הבליעה. הבדיקות מועילות בהערכות של אינטנסיביות וefficiency של פינוי phagocytic.
הבדיקות חדשות מסתמכות על סמן שאינו מבוסס על חלבון ולכן יכולות להיות יתרון במיוחד במחקרים של שבץ, שבו נזק איסכמי נרחב יכול לשבש את המורפולוגיה תאית או לרוקן סמנים המבוססים על חלבונים, בעיקר בתוך אזור איסכמי הליבה.
העיקרון של הטכניקה מוצג באיור 1. איור מציג בדיקות oligonucleotide בצורת סיכת ראש ligated ידי topoisomerase vaccinia האנזים (VACC TOPO) ל5'OH DNA מסתיים נוצר על ידי lysosomal DNase השני במהלך עיכול ה-DNA 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השיטה מתאימה ל, סעיפי רקמות פרפין מוטבעים קבוע פורמלדהיד. הטכניקה מודגמת כאן ביישום שלה ללטף ניסיוני בחולדה.
1. רכיבי כנות לקראת מערכת tyramide איתותים ההגברה (TSA)
למרות השיפור המבוסס על ה-TSA משמש בשלב הסופי של תיוג, נערך לתגובה זו יכולה לקחת שעות יותר מ 1. לכן זה נוח לעשות את ריאגנטים TSA לפני שמתחיל את התיוג.
- הפוך פתרון מניות tyramide fluorophore. השתמש במגיב tyramide fluorophore מסופק בבקבוקונים בודדים עם ערכת תיוג ה-TSA. הוסף 300 DMSO μl לבקבוקון מגיב tyramide. פתרון מניות tyramide Fluorophore הוא יציב במשך לפחות 3 חודשים, כאשר הם מאוחסנים ב 4 ° C.
- הפוך לשטוף חיץ TNT המכיל: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.5; 0.15 M NaCl; -20 Tween 0.05%. אם 0.3% נזקקו טריטון X-100 ניתן להחליף לTween-20 0.05%. Alternatively PBS עשוי לשמש כחיץ לשטוף.
- הפוך TNB חסימת מאגר המכיל: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.5; 0.15 M NaCl; 0.5% מגיב חסימה (מסופק בערכה). כדי לפזר את החסימה מגיב לחלוטין, להוסיף באיטיות אותו במרווחים קטנים למאגר תוך ערבוב. מחממים את הפתרון הזה בהדרגה ל-C ° 55 עם ערבוב מתמיד. זה יכול לקחת דקות 30-60. הפתרון יופיע חלבי. מביא לטמפרטורת חדר לפני השימוש. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C לשימוש לטווח ארוך.
2. הכנת סעיפים
השתמש בשקופיות עם 5 סעיפים מיקרומטר בעובי רכובים לחתוך מרקמות קבועות פורמלין.
- פנק את החלקים עם קסילן במשך 15 דקות.
- רעננותם סעיפים כדלקמן: לטבול ב96% 2x EtOH במשך 5 דקות כל אחד; להשרות בEtOH 80% למשך 5 דקות; לשטוף עם 2x מים במשך 5 דקות כל אחד.
- הפוך פתרון עובד proteinase K על ידי דילול מניות פתרון proteinase K 50 מיקרוגרם / מיליליטר PBS.
- הוספת proteinaseK עובד פתרון לחלקים. דגירה 15 דקות ב 23 ° C. היקף הפתרון והזמן של עיכול ייתכן שיצטרכו להיות מותאם בהתאם לגודל של חלקים וסוגי רקמות. לסעיף קטן (מתחת ל -5 מ"מ קוטר) 50 μl של פתרון proteinase יהיה מספיק. סעיף לגודל ממוצע (~ 10 מ"מ קוטר), להוסיף לפתרון proteinase K 100 μl. עבור חלקים גדולים מאוד בנפח של הפתרון וניתן לשנותם. בכל המקרים לטפל כדי למנוע overdigestion סעיפים שמוביל לאובדן מוחלט של אות והורסת את רקמת מורפולוגיה. זה קורה לעתים קרובות, אם זמן דגירה עולה 25 דקות.
- לשטוף חלקים ב2x מים מזוקקים במשך 5 דקות כל אחד. מכין את תערובת התיוג המכילה בדיקה פעילה בזמן שחלקים נמצאים במים.
3. מכתים מבוסס TOPO VACC
- הכן את פתרון הבדיקה הפעיל על ידי שילוב של הפעולות הבאות:
מים - 11.75 μl
1 M טריס-HCl, pH 7.4-1.25 μl
של oligonucleotide התאבדות הסככה 12 בסיס 100 pmol - 1 μl
של oligonucleotide מתאם 100 pmol - 1 μl
TOPO VACC 50 pmol - 10 μl - מערבבים בעדינות על ידי pipetting. דגירה בטמפרטורת חדר (23 מעלות צלזיוס) במשך 15 דקות, כדי לאפשר הפעלת חללית.
- קח חלקים מצנצנת לשטוף ולשאוב את המים הנותרים. לאחר מכן להחיל את פתרון הבדיקה הפעיל מוכן בשלב 3.1 (25 μl ל~ סעיף מ"מ 10 x 10).
- Coverslip סעיפי דגירה במשך 15 דקות ב23 ° C. טובלים שקופיות במים כדי להסיר בעדינות coverslips. לשטוף במי 3x במשך 5 דקות כל אחד.
4. TSA איתותים שיפור
- כסה סעיפי רקמות עם TNB חסימת חיץ שהוכן קודם לכן ודגירת שקופיות בחדר humidified ל30 דקות בטמפרטורת חדר (23 מעלות צלזיוס).
- הכן דילול 1:100 של conjugates peroxidase streptavidin-החזרת (SA-HRP) בTNB חסימת מאגר. לשאוב TNBחסימת החיץ וליישם פתרון SA-HRP. דגירה שקופיות עם SA-HRP ל30 דקות בטמפרטורת חדר. השתמש נאות מגיב נפח כדי לכסות את קטע הרקמה, לכל סעיף בדרך 100 μl.
- לשטוף שקופיות 3x עבור 5 דקות כל אחד במאגר TNT לשטוף (או PBS) בטמפרטורת חדר.
- הכן דילול 1:50 של מניית tyramide fluorophore ב1x הגברה ממסה מהערכה. פיפטה הפתרון עובד tyramide fluorophore על כל שקופית. השתמש פתרון עובד מספיק כדי לכסות את קטע הרקמה, לכל סעיף בדרך 100 μl לחלוטין. הפוך פתרון עובד tyramide fluorophore מייד לפני כל תיוג. הפתרון לא ניתן לעשות שימוש חוזר, כך לבטל את כל חלק בשימוש שלו לאחר תיוג.
- דגירה השקופיות בטמפרטורת חדר במשך 3 עד 10 דקות. לפקח על עליית הקרינה תחת מיקרוסקופ עד הרמזים הראשונים של מבנים שניתן לראות. מהר להמשיך לשטוף את הצעד.
- לשטוף שקופיות 3x עבור 5 דקות כל אחד במאגר TNT לשטוף (או PBS) בזמן t החדרemperature עם תסיסה.
- להוסיף את פתרון antifading עם DAPI וcoverslip. שים לב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי להמחיש DAPI וקרינת FITC להשתמש בערכת מסנן להקה עוברת:
D490/40 עירור FITC, פליטת 520/10; D360/40 DAPI עירור, פליטת 460/20, או דומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
העיקרון של השיטה לתיוג phagocytes הפעיל פסולת ניהול מוצג באיור 1. סכמטי מוכיח כי תמורת זיהוי בשלושה שלבים. הצעד הראשון כולל הפעלת בדיקה (איור 1 א); בשלב השני הבדיקה הופעלה גבעול להפסקות DNA ספציפיות בסעיפי רקמות (איור 1 ג); השלב השלישי כולל הגברה אות ניאון (1D איור). בהסבר מפורט יותר, זיהוי הולך כדלקמן:
1. הפעלת בדיקה. לפני תגובת קשירת VACC TOPO צריך להיות קשור קוולנטית לסוף '3 של oligoprobe. במהלך הפעלת חללית VACC TOPO מתחבר לדופלקס סיכת ראש המתאם ודבק הגדיל העליון. 12 ארוך בסיס החלק לאחר מכן באופן קבוע שמפריד, והשאיר VACC TOPO מחובר בקצה '3 של סיכת הראש. oligonucleotide זה עם האנזים קשור לסוף שלה 3 'יכול לתייג הפסקות סוג DNase השנייה (איור 1). הסככה 12 הבסיס ואוליגו מתאם נדרשים משום שהאנזים לא לחתוך את גדיל קצר 8 ועל כן לא תוכל לצרף את הבדיקה ולהפעיל את סופו 3 '.
2. קשירת Probe. סיכות ראש Biotinylated הם ligated ידי VACC TOPO ל5'OH הפסקות DNA הסתיימו בוטות שנוצרו על ידי phagocytes לעכל גרעינים של תאים מתים. הבדיקות המצורפות הם דמיינו ידי הקרינה באמצעות tyramide שיפור 9.
3. איתות פלורסנט מושגת באמצעות tyramide איתותים ההגברה (TSA) במערכת 9. במהלך תהליך זה conjugates peroxidase streptavidin-החזרת לצרף לסיכות ראש biotinylated ולהפעיל מחייב של tyramides ניאון בסביבה הקרובה, יצירת אתרים חזק ניאון.
e_content "> יישום של הטכניקה ללטף ניסיוני מוצג באיור 2. איור תמונות הקרינה 2 מתנות של תאי phagocytic פעילים ניקוי מוות של תאים במוח חולדה 48 שעות לאחר תחילת איסכמיה מוח מוקד הקבועה. התאים מסומנים על ידי TOPO VACC בדיקות כמתואר. הבדיקות לדמיין phagolysosomes הענקי 10 עם DNase השני הפסקות (הקרינה ירוקה), סימון phagocytes אשר פעיל לבלוע ולעכל את גופות תא 7. שיתוף מכתים סימולטני עם DAPI תוויות הכרומטין של phagocytes ושל התאים נבלעו בתוך phagocytes. שכבות של VACC טופוגרפי ואותות DAPI לאפשר זיהוי קל וניתוח מורפולוגי של תאי phagocytic פעילים. להצגה ברורה יותר, התמונות משלימים תרשימים של האירועים מוצגים."Width =" jpg 500 "/>
איור 1 איתור של סיקול phagocytic בחלקים במוח על ידי בדיקות ligatable:. עיקרון של השיטה.
איור 2 שבץ 48 שעות ניסויית לאחר הופעת איסכמיה:. אישור phagocytic של מוות של תאי שתי דוגמאות של סילוק phagocytic.. הבדיקה Ligatable VACC TOPO - הקרינה ירוקה. DAPI כתם גרעיני - הקרינה כחולה. תרשימים של האירועים שהוצגו בתמונות (עמודה ימנית) מראים גרעינים של phagocytes וpycnotic נבלעו גרעינים נוספים בשלבים שונים של מערכת העיכול. סרגל קנה מידה - 15 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בסרטון הזה אנחנו מדגימים, בפורמט קטע רקמה, איך לתייג phagocytes הפעיל שמוות של תאים ברורים באיסכמיה המוחית המוקדים. הטכניקה המוצגת הינה הגישה הראשונה בי במיוחד תוויות רק אלה תאי פסולת הניהול שפקד את ופעיל לעכל גופות סלולריות. זה עושה את זה יתרון ביחס לשיטות קיימות אחרות לתיוג של תאי phagocytic, אשר אין להם יכולת זו.
השיטה משתמשת בסמן כללי וסלקטיבית המבוססת על ה-DNA של פעילות phagocytic - גדילים כפולים, להקהות הפסקות 5'OH DNA הסתיימו מיוצרות בphagolysosomes של תאי ניהול פסולת במהלך העיכול של גרעינים נבלעו. תיוג ספציפי זה של תאי phagocytic פעילים רק מאפשר הערכה מדויקת של העצמה והיעילות של תגובת phagocytic במוח איסכמי.
הטכניקה היא חזקה ועובדת היטב, אם הם אחריו את כל הצעדים כפי שתוארו. Digesti K proteinaseבצעד חשוב במיוחד עבור מכתים חזק ושחזור. Overdigestion בשלב זה מוביל לאובדן של ה-DNA מהמדור ועשוי להקטין או אפילו לחסל את האות. הנקודה הקריטית השנייה היא להשתמש בתכשיר מאוד פעיל של אנזים topoisomerase vaccinia. מגבלה של השיטה היא שהיא אינה מותאמת לשימוש עם חלקים קפואים טריים.
יש גישת תחולה רחבה למחקרים של אפופטוזיס וניתן להרחבה לרקמות אחרות ותנאים מעבר למוח איסכמי. זה נוח במיוחד כאשר משמש להדמיה של תגובות phagocytic ברקמות ואיברים מורכבים מסוגי תאים מרובים עם תאי פסולת ניהול משתתפים מגוונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק R01NS062842 מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים לאומיים לבריאות (VVD) ועל ידי מענקי R21 NS064403 מהמכון הלאומיים להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים לאומיים לבריאות באמצעות ערה (VVD) וR21 מכון EB006301 הלאומי ביו הדמיה וההנדסה ביוטכנולוגיה, מכון הלאומי לבריאות (VVD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- TSA Fluorescence Systems. , Available from: http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf Forthcoming.
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
