Summary
Vi presentiamo una nuova tecnica di fluorescenza per l'etichettatura selettiva in situ di fagociti attivi, che chiaramente fuori cadaveri cellulari in corsa. L'approccio è importante per valutare la reazione di ischemia cerebrale perché solo una piccola parte dei fagociti presenti nel cervello ischemico partecipare nella clearance di cellule morte.
Abstract
Descriviamo un nuovo approccio istochimica per la visualizzazione della clearance fagocitica in ischemia cerebrale focale. L'approccio consente lo studio di eliminazione delle cellule morte in corsa dai fagociti di gestione dei rifiuti di qualsiasi lignaggio cellulare. Sebbene numerose cellule di origine diversa che sono capaci di fagocitosi sono presenti nel cervello ischemico, solo una parte di essi attivamente fagocitare e digerire corpi cellulari. La visualizzazione selettiva, quantificazione e analisi di tali attività di gestione dei rifiuti fagocitica sono utili nella valutazione della risposta del cervello ad ischemia. Efficiente liquidazione morte cellulare è importante per il recupero cervello dalla lesione ischemica, in quanto apre la strada per i successivi processi rigenerativi. La mancata pulizia cadaveri comporterebbe una reazione tossica causata da DNA non degradato e proteine. La procedura descritta utilizza sonde fluorescenti selettivamente legatura da un topoisomerasi virale di caratteristici rotture del DNA prodotte in tutti i fagociti durante la fagocitazionee la digestione delle cellule irreversibilmente danneggiato da ischemia. Il metodo è un nuovo strumento per lo studio della reazione del cervello al danno ischemico.
Introduction
Ictus ischemico induce profondi cambiamenti nel tessuto cerebrale colpito. Si avvia morte cellulare massiccia, che porta alla rapida attivazione delle cellule fagocitiche residenti di origine microglia. Essa stabilisce inoltre off infiltrazione di cervello ischemico da vari tipi di fagociti professionali emoderivati compresi neutrofili, macrofagi, dendritiche e mastociti 1,2.
E 'ancora in discussione se questa risposta al danno ischemico svolge un positivo o un ruolo negativo. Anche se la fagocitosi dopo l'ictus può essere utile perché elimina le cellule morte e sopprime l'infiammazione, ma genera anche tossici specie reattive dell'ossigeno che influenzano la sopravvivenza neuronale e aggravando il danno tissutale 1-5.
Mentre diversi tipi di fagociti infiltrano cerebrale ischemico, non tutti partecipano in-gestione dei rifiuti inglobando cadaveri delle cellule e aprendo la strada a processi rigenerativi 1-3. Questo creates un requisito per l'identificazione selettiva delle cellule di gestione dei rifiuti che effettuano la clearance fagocitica della morte cellulare in corsa. Quando l'imaging tali cellule di gestione dei rifiuti attivi, è importante anche per rispondere alla domanda di come efficacemente si degradano i cadaveri delle cellule inghiottito. Il degrado efficace e completa del DNA della cellula morente nella fagocitosi è essenziale perché evita l'auto-immunizzazione e il rilascio di materiale nucleare patologico 6.
Qui vi presentiamo nuove sonde che utilizzano specifici rotture del DNA come marcatori di fagociti attivi. Queste interruzioni di firma sono prodotti esclusivamente durante la composizione dei nuclei inghiottito dentro le celle di gestione dei rifiuti funzionale. Pertanto, le sonde selettivamente etichetta solo i fagociti che tracimano e digeriscono attivamente cadaveri cellulari. Essi permettono anche osservando l'intensità e completamento di ripartizione DNA dopo la engulfment. Le sonde sono utili nelle valutazioni di intensità e efficirenza della clearance fagocitica.
Le nuove sonde basano su un marcatore non proteico-based e quindi può essere particolarmente vantaggiosa in studi di ictus, quali un'intensa danno ischemico può interrompere morfologia cellulare o esaurire marcatori a base di proteine, in particolare all'interno della zona ischemica nucleo.
Il principio della tecnica è presentata nella Figura 1. La figura mostra sonde oligonucleotidiche a forma di forcina ligati per l'enzima topoisomerasi vaccinia (VACC TOPO) al DNA 5'OH finisce generato da lisosomiale DNasi II durante la digestione DNA 7.
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Protocol
Il metodo è adatto per paraffina, sezioni di tessuto formaldeide-fisso. La tecnica è illustrata qui nella sua applicazione alla corsa sperimentale nel ratto.
1. Componenti Preparazione per Tyramide Signal Amplification (TSA) Sistema
Sebbene il miglioramento basato TSA è utilizzato nella fase finale di etichettatura, preparazione per questa reazione può richiedere più di 1 ora. Pertanto è conveniente fare i reagenti TSA prima di iniziare l'etichettatura.
- Fai soluzione stock fluoroforo tiramide. Utilizzare il reagente fluoroforo tiramide forniti in fiale individuali con il kit di etichettatura TSA. Aggiungere 300 microlitri DMSO alla fiala reagente tiramide. Fluoroforo tiramide magazzino soluzione è stabile per almeno 3 mesi se conservato a 4 ° C.
- Fai tampone di lavaggio TNT contenente: 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5; 0,15 M NaCl; 0,05% Tween-20. Se necessario, 0,3% Triton X-100 può essere sostituito per il Tween-20 0,05%. Alternattivamente PBS può essere utilizzato come tampone di lavaggio.
- Fai TNB tampone bloccante contenente: 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5; 0,15 M NaCl; 0,5% reagente di blocco (fornito con il kit). Per dissolvere completamente il reagente bloccante, aggiungere lentamente in piccoli incrementi al buffer agitando. Scaldare questa soluzione gradualmente a 55 ° C con agitazione continua. Questo può richiedere 30-60 min. La soluzione appare lattiginosa. Portare a temperatura ambiente prima dell'uso. Aliquota e conservare a -20 ° C per l'uso a lungo termine.
2. Preparazione delle sezioni
Utilizzare le diapositive montate con 5 sezioni micron di spessore tagliate da tessuti fissati in formalina.
- Trattare le sezioni con xilene per 15 min.
- Reidratare le sezioni come segue: immergere nel 96% EtOH 2x per 5 minuti ciascuno; immergere nel 80% EtOH per 5 min; lavare con 2x acqua per 5 minuti ciascuno.
- Preparare la soluzione di lavoro proteinasi K diluendo soluzione madre proteinasi K a 50 mg / ml in PBS.
- Aggiungi proteinasiK soluzione di lavoro alle sezioni. Incubare 15 min a 23 ° C. Il volume della soluzione e il tempo di digestione può essere necessario regolare a seconda delle dimensioni delle sezioni e tipi di tessuto. Per una sezione piccola (inferiore a 5 mm di diametro) 50 ml di soluzione di proteinasi sarebbe sufficiente. Sezione per una dimensione media (circa 10 mm di diametro), aggiungere 100 ml di soluzione di proteinasi K. Per molto ampie sezioni il volume della soluzione può essere scalata. In ogni caso aver cura di evitare overdigestion di sezioni che porta alla completa perdita di segnale e distrugge morfologia tissutale. Questo accade spesso se il tempo di incubazione supera i 25 min.
- Lavare le sezioni in 2x acqua distillata per 5 minuti ciascuno. Preparare la miscela di etichettatura contenente sonda attiva mentre le sezioni sono in acqua.
3. Colorazione a base di TOPO VACC
- Preparare la soluzione della sonda attiva combinando il seguente:
Acqua - 11.75 microlitri
1 M Tris-HCl, pH 7,4-1,25 μl
100 pmol di 12-base oligonucleotide sbalzo suicidio - 1 ml
100 pmol dell'adattatore oligonucleotide - 1 ml
50 pmol VACC TOPO - 10 ml - Mescolare delicatamente pipettando. Incubare a temperatura ambiente (23 ° C) per 15 minuti per consentire l'attivazione della sonda.
- Prendere sezioni dal vaso di lavaggio e aspirare l'acqua residua. Quindi applicare la soluzione sonda attiva preparato al punto 3.1 (25 pl per ~ sezione 10 x 10 mm).
- Coprioggetti sezioni e incubare per 15 min a 23 ° C. Immergere i vetrini in acqua per rimuovere delicatamente lamelle. Lavare in 3x acqua per 5 minuti ciascuno.
4. TSA Valorizzazione di segnale
- Coprire sezioni di tessuto con TNB tampone bloccante preparato in precedenza e incubare i vetrini in una camera umidificata per 30 minuti a temperatura ambiente (23 ° C).
- Preparare una diluizione 1:100 di coniugati streptavidina-perossidasi di rafano (SA-HRP) in TNB tampone di bloccaggio. Aspirare TNBtampone di bloccaggio e applicare la soluzione SA-HRP. Incubare i vetrini con SA-HRP per 30 min a temperatura ambiente. Utilizzare un adeguato volume di reagente per coprire la sezione di tessuto, generalmente 100 pl per sezione.
- Lavare i vetrini 3x per 5 minuti ciascuno in tampone di lavaggio TNT (o PBS) a temperatura ambiente.
- Preparare una diluizione 1:50 di fluoroforo tiramide magazzino in 1x Amplification diluente dal kit. Pipettare la soluzione di lavoro fluoroforo tiramide su ogni diapositiva. Utilizzare soluzione di lavoro sufficiente a coprire completamente la sezione di tessuto, generalmente 100 microlitri per sezione. Preparare la soluzione di lavoro fluoroforo tiramide immediatamente prima di ogni etichettatura. La soluzione non può essere riutilizzato, in modo da scartare qualsiasi parte inutilizzata di esso dopo l'etichettatura.
- Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 3 a 10 min. Monitorare aumento della fluorescenza sotto il microscopio fino ai primi accenni di strutture può essere visto. Procedere rapidamente per lavare passo.
- Lavare i vetrini 3x per 5 minuti ciascuno in tampone di lavaggio TNT (o PBS) a Temperatura con agitazione.
- Aggiungere la soluzione antiscolorimento con DAPI e coprioggetto. Osservare al microscopio a fluorescenza. Per visualizzare DAPI e FITC fluorescenza utilizzano un set di filtri passa-banda:
FITC di eccitazione D490/40, emissione 520/10; DAPI eccitazione D360/40, emissione 460/20, o simile.
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Representative Results
Il principio della tecnica per l'etichettatura fagociti gestione dei rifiuti attivi è illustrata nella Figura 1. Lo schema dimostra che il ricavato di rilevazione in tre fasi. La prima fase comprende l'attivazione della sonda (Figura 1A); nella seconda fase la sonda attivato viene ligato a specifiche rotture del DNA in sezioni di tessuto (Figura 1C); la terza fase comprende fluorescente amplificazione del segnale (Figura 1D). In una spiegazione più dettagliata, la rilevazione è la seguente:
1. L'attivazione della sonda. Prima della reazione di ligazione VACC TOPO deve essere legato covalentemente all'estremità 3 'del oligoprobe. Durante l'attivazione della sonda VACC TOPO attribuisce al duplex tornante adattatore e si unirà il filo superiore. Il-12 di base a lungo parte poi si separa definitivamente, lasciando VACC TOPO collegato all'estremità 3 'del tornante. Questo oligonucleotide con l'enzima legato alla sua estremità 3 'può etichettare DNasi II Tipo di pause (Figura 1B). La sporgenza 12-base e un oligo adattatore sono necessari perché l'enzima non viene tagliata una ciocca più corta 8 e sarà quindi in grado di attaccare alla sonda e attivare il suo 'estremità 3.
2. Sonda legatura. Tornanti Biotinylated sono legatura da VACC TOPO a 5'OH contundenti rotture del DNA indeterminato generati dai fagociti digerire nuclei di cellule morte. Le sonde allegate sono visualizzate tramite fluorescenza utilizzando valorizzazione tiramide 9.
3. Segnalazione Florescent è ottenuto utilizzando sistema 9 (TSA) Tyramide amplificazione del segnale. Durante questo processo coniugati streptavidina-perossidasi di rafano attribuiscono al forcine biotinilati e attivare legame di tyramides fluorescenti nelle immediate vicinanze, la creazione di siti fortemente fluorescenti.
e_content "> Applicazione della tecnica di corsa sperimentale è mostrato in Figura 2. Figura 2 presenta immagini di fluorescenza di cellule fagocitiche attivi che eliminano la morte delle cellule cerebrali di ratto in 48 ore dopo l'inizio di ischemia cerebrale focale permanente. Le cellule sono etichettati dal TOPO VACC sonde come descritto. Le sonde visualizzare giganteschi phagolysosomes 10 con DNasi II pause (fluorescenza verde), segnando fagociti che fagocitano attivamente e digeriscono i cadaveri delle cellule 7. simultanea co-colorazione con DAPI etichette cromatina dei fagociti e delle cellule inghiottito all'interno fagociti. L' sovrapposizioni di segnali DAPI VACC TOPO e permettono una facile identificazione e l'analisi morfologica delle cellule fagocitarie attive. Per la presentazione più chiara, le immagini sono integrate da diagrammi degli eventi indicati."width =" 500 jpg "/>
Figura 1 Rilevazione della clearance fagocitica in sezioni di cervello da sonde ligatable:. Principio del metodo.
Figura 2 Sperimentale corsa 48 ore dopo ischemia esordio:. Liquidazione dei fagociti di morte cellulare Due esempi di liquidazione fagocitosi.. Ligatable sonda VACC TOPO - fluorescenza verde. Colorazione nucleare DAPI - fluorescenza blu. Diagrammi degli eventi presentati nelle immagini (colonna di destra) mostrano nuclei di fagociti e pycnotic inghiottito nuclei supplementari in varie fasi di digestione. Scale bar - 15 micron.
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Discussion
In questo video si dimostra, nel formato sezione di tessuto, come etichettare fagociti attivi che chiare morte delle cellule in ischemia cerebrale focale. La tecnica presentata è il primo approccio che le etichette specificamente solo le celle di gestione dei rifiuti che hanno inghiottito e digerire attivamente cadaveri cellulari. Questo rende più vantaggiosa rispetto ad altri metodi esistenti per l'etichettatura dei fagociti, che non hanno questa capacità.
Il metodo utilizza un indicatore basato sul DNA generale e selettiva di attività fagocitaria - a doppia elica, blunt cessati rotture del DNA 5'OH prodotte in phagolysosomes di cellule di gestione dei rifiuti durante la digestione dei nuclei inghiottito. Tale marcatura specifica di fagociti attivi solo consente una valutazione accurata della intensità e l'efficienza della reazione fagocitaria nel cervello ischemico.
La tecnica è robusto e funziona bene se tutti i passaggi sono seguiti come descritto. Il Digesti proteinasi Knel passaggio è particolarmente importante per la colorazione forte e riproducibile. Overdigestion in questa fase porta alla perdita di DNA dalla sezione e può diminuire o addirittura eliminare il segnale. L'altro punto critico è quello di utilizzare un preparato altamente attivo dell'enzima topoisomerasi vaccinia. Una limitazione della tecnica è che non è stato ottimizzato per l'uso con sezioni freschi congelati.
L'approccio ha vasta applicabilità agli studi di apoptosi ed è espandibile ad altri tessuti e condizioni al di fuori del cervello ischemico. È particolarmente utile quando utilizzato per la visualizzazione di reazioni fagocitiche in tessuti e organi composti da più tipi cellulari con diverse celle di gestione dei rifiuti partecipanti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni R01NS062842 dall'Istituto nazionale dei disordini neurologici e ictus, National Institutes of Health (VVD) e da sovvenzioni R21 NS064403 dall'Istituto nazionale dei disordini neurologici e ictus, National Institutes of Health, attraverso ARRA (VVD) e R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
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