Summary
우리는 활성화 된 대 식세포의 현장 라벨의 선택을위한 새로운 형광 기술을 제시하는 명확한 행정의 세포 시체 끕니다. 허혈성 뇌에 존재하는 식세포의 단지 작은 비율이 세포 죽음의 정리에 참여하기 때문에 방법은 국소 빈혈에 대한 뇌의 반응을 평가하는 것이 중요합니다.
Abstract
우리는 초점 뇌 허혈에 식세포 정리의 시각화를위한 새로운 조직 화학적 방법을 설명합니다. 접근 방식은 모든 세포 계보의 폐기물 관리 식세포에 의한 뇌졸중의 죽은 세포의 제거에 대한 연구를 허용합니다. 식균 작용의 능력이 서로 다른 기원의 수많은 세포가 허혈성 뇌에 존재하지만, 그 중 일부는 적극적으로 침몰 세포 시체를 소화. 선택적 시각화, 정량화 및 능동 식세포 폐기물 관리의 분석은 허혈 뇌의 반응을 평가하는데 도움이됩니다. 그것은 이후의 재생 공정을위한 길을 열어 효율적인 세포 죽음의 간극은, 허혈성 뇌 손상에서 복구를 위해 중요합니다. 시체를 청소하는 고장이 아닌 성능이 저하 된 DNA와 단백질에 의한 유해 반응이 발생할 것입니다. 설명 된 절차는 선택적으로 말림 동안 모든 식세포에서 생산 특성 DNA 나누기에 바이러스 토포 이소 머라 제에 의해 결찰 형광 프로브를 사용세포의 소화 비가 역적 허혈 손상. 이 방법은 허혈 손상에 대한 뇌 반응의 조사를위한 새로운 도구입니다.
Introduction
허혈성 뇌졸중은 영향을받는 뇌 조직에 큰 변화를 유도한다. 그것은 미세 아교 기원 주민 식세포의 급속한 활성화로 연결하는 대규모 세포 죽음을 시작합니다. 또한 호중구, 대 식세포, 수지상 및 비만 세포 1,2 등의 혈액에서 파생 된 전문 식세포의 여러 유형에 의해 허혈성 뇌의 침투를 설정합니다.
그것은 여전히 허혈 손상이 반응이 긍정적 또는 부정적인 역할을할지 여부를 논의한다. 그것은 죽은 세포를 지우고 염증을 억제하기 때문에 뇌졸중 다음 식균 작용이 도움이 될 수 있지만, 그것은 또한 신경 세포의 생존에 영향을 미치는 조직의 손상 1-5 악화 유해 활성 산소 종을 생성합니다.
식세포의 여러 종류가 허혈성 뇌에 침투하는 동안, 그들 모두는 세포 시체를 덮어 회생 과정 1 ~ 3을위한 방법을 취소하여 폐기물 관리에 참여한다. 이 CR뇌졸중 세포 죽음의 식세포를 실행할 것을 폐기물 관리 세포의 선택적 식별을위한 요구 사항을 eates. 능동 폐기물 관리 셀을 묘화 할 때, 그들은 잠겼 셀 시체 저하 얼마나 효율적의 질문에 응답하는 것도 중요하다. 그것은 자기 면역 병리학 핵 물질 (6)의 방출을 방지하기 때문에 식균 작용에 죽어가는 세포의 DNA의 유효하고 완전 분해가 필수적이다.
여기에서 우리는 활성 식세포의 마커로 특정 DNA 나누기를 사용하여 새로운 프로브를 제시한다. 이 서명 나누기 독점적 기능 폐기물 관리 세포 내부에 가득 채우고 핵의 분해시 생성된다. 따라서 프로브는 선택적으로 침몰 만 식세포 레이블을 적극적으로 세포의 시체를 소화. 그들은 또한 말림 후 강도와 DNA 파괴의 완료를 관찰 허용합니다. 프로브는 강도와 effici의 평가에 도움이됩니다식세포 정리의 ency.
새로운 프로브는 비 단백질 기반의 마커에 의존하기 때문에 광범위한 허혈성 손상은 세포의 형태를 중단 시키거나, 특히 핵심 허혈성 영역 안에, 단백질 기반의 마커를 고갈시킬 뇌졸중의 연구에 특히 유용 할 수 있습니다.
기술의 원리는 그림 1에 제시되어있다. 그림은 효소 우두 토포 이소 머라 제 (VACC TOPO)로 결찰 머리핀 모양의 올리고 뉴클레오티드 프로브를 보여줍니다 5'OH DNA에 DNA 소화 7시 리소좀 DNA 분해 효소 II에 의해 생성 끝납니다.
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Protocol
방법은 포름 알데히드 고정 된 파라핀 조직 절편에 적합하다. 이 기술은 쥐 실험 스트로크 여기의 응용 프로그램에서 보여줍니다.
Tyramide 신호 증폭 (TSA) 시스템 1. 준비 구성 요소
TSA 기반 향상이 반응을 준비하고, 라벨의 마지막 단계에 사용되지만 이상의 시간이 걸릴 수 있습니다. 그 때문에, 표시를 시작하기 전에 TSA 시약을 만드는 것이 편리하다.
- 형광의 tyramide 원액을 확인합니다. TSA 라벨 키트 개별 튜브에 공급되는 형광의 tyramide 시약을 사용합니다. tyramide 시약 유리 병에 300 μL의 DMSO를 추가합니다. 4 ℃에서 저장 될 때 형광의 tyramide 원액은 3 개월 이상 안정
- 포함 된 TNT의 세척 버퍼 확인 : 0.1 M 트리스 - 염산, pH를 7.5; 0.15 M 염화나트륨; 0.05 % 트윈 -20. 필요한 0.3 % 트리톤 X-100 0.05 % 트윈 -20을 대체 할 수있는 경우. alternat의ively PBS는 세척 완충액으로 사용할 수있다.
- 확인 TNB 포함하는 버퍼 차단 : 0.1 M 트리스 - 염산, pH를 7.5; 0.15 M 염화나트륨; 0.5 % 차단 시약 (키트와 함께 제공). 교반하면서 완전히 차단 시약을 용해, 천천히 버퍼에 조금씩 추가합니다. 점차적으로 연속 교반하면서 55 °의 C에이 솔루션을 가열한다. 이는 30 ~ 60 분 걸릴 수 있습니다. 이 솔루션은 우유를 나타납니다. 사용하기 전에 실온으로 오십시오. 장기 사용을 위해 -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
섹션 2. 준비
포르말린 고정 조직을 잘라 장착 5 μm의 두께 섹션으로 슬라이드를 사용합니다.
- 15 분 자일 렌 섹션을 처리합니다.
- 다음 섹션을 재수 : 5 분마다 96 % EtOH로 2 배에 담가; 5 분 동안 80 %의 EtOH에 담가; 5 분마다 물을 2 배로 씻어.
- PBS에서 50 ㎍ / ㎖의에 테 K 원액을 희석하여 테 K 작업 솔루션을합니다.
- 테 추가K는 섹션에 솔루션을 작업. 23 ℃에서 15 분 알을 품다 용액의 부피 및 소화의 시간은 섹션 및 조직 유형의 크기에 따라 조정할 필요가있다. 작은 (직경 5 ㎜ 이하) 섹션 테 솔루션의 50 μL은 충분하다. 평균 크기 (~ 직경 10 ㎜) 섹션, 테 K 용액 100 μl를 추가합니다. 매우 큰 부분에 대한 솔루션의 볼륨을 확장 할 수 있습니다. 모든 경우에 신호의 손실을 완료로 연결 조직의 형태를 파괴 섹션 overdigestion을 방지하기 위해주의를 기울입니다. 배양 시간이 25 분을 초과하는 경우에 이러한 상황이 자주 발생합니다.
- 5 분마다 증류수의 2 배에 섹션을 씻으십시오. 섹션은 물에있는 동안 액티브 프로브를 포함하는 라벨 믹스를 준비합니다.
3. VACC TOPO 기반 염색
- 다음을 조합하여 액티브 프로브 용액을 준비한다 :
물 - 11.75 μL
1 M 트리스 - 염산, pH를 7.4-1.25 μ엘
12베이스 오버행 자살 올리고 뉴클레오티드의 100 pmol의 - 1 μL
어댑터 올리고 뉴클레오티드의 100 pmol의 - 1 μL
50 pmol의의 VACC의 TOPO - 10 μL - 피펫으로 가볍게 섞는다. 프로브 활성화 할 수 있도록 15 분 동안 실온 (23 ℃)에서 배양한다.
- 세척 항아리에서 절을하고 남은 물을 대기음. 그런 다음 3.1 단계 (~ 10 × 10 밀리 섹션 당 25 μL)에서 제조 된 액티브 프로브 솔루션을 적용 할 수 있습니다.
- 섹션을 커버 슬립, 23 ℃에서 15 분 동안 품어 딥 부드럽게 커버 슬립을 제거하기 위해 물에 슬라이드. 5 분마다 물을 배에 씻으십시오.
4. TSA 신호 향상
- TNB 이전에 준비하고 실온 (23 ℃)에서 30 분 동안 가습 실에서 슬라이드를 품어 차단 버퍼와 조직 섹션을 포함한다.
- TNB 버퍼를 차단하는 스트렙 타비 딘 - 고추 냉이 과산화 효소 복합체 (SA-HRP)의 1:100 희석을 준비합니다. 기음 TNBSA-HRP 용액을 버퍼링하고 적용 블로킹. 실온에서 30 분 동안 SA-HRP와 슬라이드를 품어. 조직 섹션, 섹션 당, 100 μl를 충당하기 위해 적절한 시약의 볼륨을 사용합니다.
- 세척은 실온에서 TNT의 세척 버퍼 (또는 PBS)에 5 분마다 배를 슬라이드.
- 키트에서 1X 증폭 희석제에 형광의 tyramide 주식의 1:50 희석을 준비합니다. 각각의 슬라이드에 형광의 tyramide 작업 솔루션을 피펫. 완전히 조직 섹션, 섹션 당 일반적으로 100 μL를 커버하기에 충분한 작업 솔루션을 사용합니다. 바로 각 라벨 전에 형광의 tyramide 작업 솔루션을합니다. 용액을 재사용하므로 라벨링 나서의 미사용 부분을 무시 할 수 없다.
- 3 내지 10 분 동안 실온에서 슬라이드를 배양한다. 구조의 제 힌트를 볼 수있을 때까지 현미경 형광 증가를 모니터링한다. 신속하게 단계를 씻어로 진행합니다.
- 워시 룸 t에서 TNT의 세척 버퍼 (또는 PBS)에 5 분마다 배를 슬라이드교반 온도계 수.
- DAPI와 coverslip에있는 antifading 솔루션을 추가합니다. 형광 현미경 하에서 관찰한다. DAPI 및 FITC 형광이 대역 통과 필터 세트를 사용하여 시각화 :
FITC 여기 D490/40 발광 10분의 520; DAPI 여기 D360/40, 배출 20분의 460, 또는 유사한.
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Representative Results
활성 폐기물 관리 식세포 레이블을 지정하는 기술의 원리는 그림 1에 제시되어있다. 회로도 보여줍니다 세 단계에서 검출 진행하는. 첫 번째 단계는 프로브 활성화 (도 1a)를 포함한다; 두 번째 단계에서 활성화 된 프로브는 조직 절편 (도 1C)에있는 특정한 DNA 나누기로 결찰된다; 세 번째 단계는 형광 신호 증폭 (도 1D)을 포함한다. 다음 상세한 설명에서, 검출 간다 :
1. 프로브 활성화. 이전 연결 반응에 VACC TOPO는 oligoprobe의 3 '말단에 공유 결합을 링크 할 필요가있다. 프로브 활성화 중에 VACC TOPO는 머리핀 어댑터 양면 인쇄를 절단 상부 가닥에 연결됩니다. 12베이스 길이의 일부는 영구적으로 머리 핀의 자형의 3 '말단에 부착 VACC TOPO를 떠나, 분리한다. 의 3 '말단에 연결 효소로이 올리고 뉴클레오티드는 DNA 분해 효소 II 타입 나누기 (그림 1B)를 레이블을 지정할 수 있습니다. 효소가 짧은 가닥 8 잘라하지 않습니다 따라서 프로브에 부착의 3 '말단을 활성화 할 수 없습니다 때문에 12 기본 오버행 및 어댑터 올리고이 필요합니다.
2. 프로브 결찰. 바이오틴 머리핀이 죽은 세포의 핵을 소화 식세포에 의해 생성 된 무딘 엔드 DNA 나누기를 5'OH하는 VACC TOPO에 의해 결찰된다. 연결된 프로브는 tyramide 개선 9를 사용하여 형광에 의해 시각입니다.
3. 형광 신호는 신호 증폭 Tyramide (TSA) 시스템 (9)을 사용함으로써 달성된다. 이 과정에서 스트렙 타비 딘 - 고추 냉이 과산화 효소 복합체는 바이오틴 머리핀에 부착 강하게 형광 사이트를 만드는, 가까운 주변에 형광 tyramides의 결합을 활성화합니다.
실험 스트로크 기술의 e_content "> 응용 프로그램은 그림 2와 같다. 영구 초점 뇌 허혈 시작 후 쥐의 뇌 48 시간에 세포 죽음을 삭제 활성 식세포의 2 선물 형광 이미지를 그림. 세포 VACC의 TOPO에 의해 표시된다 설명 프로브로. 프로브는 적극적으로 침몰 세포 시체 7 다이제스트 식세포를 표시, DNA 분해 효소 II 나누기 (녹색 형광)과 거대한 phagolysosomes 10을 시각화. DAPI 동시 공동 염색은 식세포와 식세포 내부에 가득 채우고 세포의 크로 마틴 레이블. VACC TOPO 및 DAPI 신호의 오버레이 쉽게 식별 및 활성 식세포 세포의 형태 학적 분석을 허용합니다. 명확하게 발표를 들어, 이미지가 표시되는 이벤트의 다이어그램에 의해 보완된다.JPG "폭 ="500 "/>
이 방법의 원리 :. ligatable 프로브에 의해 뇌 섹션에서 식세포 정리의 1 감지 그림.
그림 2 허혈 발병 후 실험 뇌졸중 48 시간 :. 세포 죽음의 식세포 정리 식세포 정리의 두 가지 예.. Ligatable VACC TOPO 프로브 - 녹색 형광. 핵 얼룩 DAPI - 파란색 형광. 이미지에 표시되는 이벤트 (오른쪽 열)의 다이어그램 식세포와 pycnotic의 핵이 소화의 다양한 단계에서 추가 핵을 가득 채우고 보여줍니다. 스케일 바 - 15 μm의.
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Discussion
이 비디오에서 우리는 초점 뇌 허혈에있는 투명 세포 죽음을 활성화 식세포 레이블을하는 방법, 조직 섹션 형식으로 보여줍니다. 제시된 기술은 구체적으로 침몰하고 적극적으로 세포 시체를 소화들만 폐기물 관리 셀 라벨 첫 번째 방법입니다. 이것은이 기능이 없습니다 식세포의 라벨에 대한 기존의 방법에 대한 유익합니다.
두 번 좌초 침몰 핵 소화하는 동안 폐기물 관리 세포의 phagolysosomes에서 생산 종료 5'OH DNA 나누기를 둔 -이 방법은 식세포 활동의 일반 및 선택적 DNA 기반의 마커를 사용합니다. 활성 식세포이 특정 라벨은 강도와 허혈성 뇌의 식세포 반응 효율의 정확한 평가를 허용한다.
이 기술은 강력 설명대로 모든 단계를 준수하는 경우 잘 작동합니다. 단백질 분해 K의 digesti단계에 강하고 재현 염색에 특히 중요합니다. 이 단계에서 Overdigestion이 섹션에서 DNA의 손실로 연결하고 감소 또는 신호를 제거 할 수 있습니다. 다른 중요한 점은 백시 토포 이소 머라 제 효소의 활성이 높은 제제를 사용하는 것이다. 기술의 한계가 냉동 부에 사용하기 위해 최적화되지 않았다는 것이다.
방법은 세포 사멸 연구와 폭 넓은 적용 성을 가지고 있으며, 허혈성 뇌 이상 다른 조직 및 조건까지 확장 가능하다. 다양한 참여 폐기물 관리 세포와 여러 종류의 세포로 구성된 조직과 장기에있는 식세포 반응의 시각화에 사용 할 때 특히 편리합니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 신경 장애의 국립 연구소에서 부여 R01NS062842과 건강 (VVD)의 스트로크, 국립 연구소에 의해 및 신경성 질환의 국립 연구소와 ARRA를 통해 건강의 치기, 국립 연구소 (VVD)과 R21에서 보조금 R21 NS064403에 의해 지원되었다 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 EB006301 국립 연구소, 건강의 국립 연구소 (VVD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
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