Summary
Nós apresentamos uma nova técnica de fluorescência para seletiva marcação in situ de células fagocíticas ativos, o que claro off corpos celulares em acidente vascular cerebral. A abordagem é importante para a avaliação da reacção à isquemia cerebral uma vez que só uma pequena proporção de fagócitos presentes no cérebro isquémico participar na depuração de morte celular.
Abstract
Nós descrevemos uma nova abordagem histoquímica para visualização de folga fagocitária em isquemia cerebral focal. A abordagem permite o estudo da eliminação de células mortas no acidente vascular cerebral por fagócitos de qualquer linhagem celular de gestão de resíduos. Apesar de numerosas células de origens diferentes, que são capazes de fagocitose estão presentes no cérebro isquémico, apenas uma parte deles activamente engolir e digerir corpos celulares. A visualização seletiva, quantificação e análise de tais de gestão de resíduos fagocitária ativa são úteis na avaliação da resposta do cérebro à isquemia. Remoção eficiente morte celular é importante para a recuperação do cérebro de uma lesão isquêmica, uma vez que abre o caminho para os processos regenerativos subseqüentes. A falha para limpar os cadáveres que resultaria numa reacção tóxica causada por ADN não degradado e proteínas. O procedimento descrito utiliza sondas fluorescentes ligados seletivamente por uma topoisomerase viral para quebras de DNA característicos produzidos em todos os fagócitos durante imersãoe digestão das células irreversivelmente danificadas por isquemia. O método é uma nova ferramenta para a investigação da reação cerebral à isquemia.
Introduction
Acidente vascular cerebral isquêmico induz mudanças profundas no tecido cerebral afetada. Ela inicia a morte celular em massa, o que leva à rápida activação das células fagocíticas residentes de origem da microglia. É também desencadeia a infiltração de cérebro isquémico por vários tipos de fagócitos profissionais derivadas do sangue, incluindo neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e células mastro 1,2.
Ainda está em discussão se esta resposta à lesão isquêmica desempenha um papel positivo ou negativo. Embora a fagocitose após o AVC pode ser benéfico porque ele limpa as células mortas e suprime a inflamação, ele também gera espécies reativas de oxigênio tóxicos que afetam a sobrevivência neuronal e exacerbando o dano tecidual 1-5.
Embora vários tipos de células fagocíticas infiltrar cerebral isquêmico, nem todos eles participar na gestão de resíduos por engolindo corpos celulares e abrindo caminho para processos regenerativos 1-3. Esta creates um requisito para identificação seletiva de células de gestão de resíduos que realizam folga fagocitária de morte celular em acidente vascular cerebral. Quando imaginando essas células de gestão de resíduos em atividade, também é importante para responder à questão de como eficientemente eles degradam os corpos celulares engoliram. A degradação efetiva e completa do DNA da célula morrer na fagocitose é essencial, pois evita a auto-imunização e a liberação de material nuclear patológica 6.
Aqui apresentamos novas sondas que usam quebras específicas de DNA como marcadores de células fagocíticas ativas. Estas pausas assinatura são produzidos exclusivamente durante quebra de núcleos tragado dentro das células de gestão de resíduos funcionais. Por conseguinte, as sondas de etiquetar selectivamente apenas os fagócitos que engolir e digerir activamente corpos celulares. Eles também permitem observar a intensidade e a conclusão de repartição de ADN após a imersão. As sondas são úteis na avaliação de intensidade e efficirência de folga fagocitária.
As novas sondas de contar com um marcador não baseadas em proteína e, portanto, pode ser particularmente vantajoso em estudos de acidente vascular cerebral, em que grande dano isquémico pode perturbar a morfologia celular ou empobrecem marcadores à base de proteínas, especialmente no interior da zona do núcleo isquémico.
O princípio da técnica é apresentada na Figura 1. A figura mostra as sondas oligonucleotídicas em forma de grampo ligados pela topoisomerase vaccinia enzima (VACC TOPO) de ADN 5'OH termina gerado por lisossomal DNase II durante a digestão do ADN 7.
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Protocol
O método é adequado para, cortes de tecidos fixados em formol parafina. A técnica é demonstrada aqui na sua aplicação a acidente vascular cerebral experimental em ratos.
1. Componentes preparando para tiramida Signal Amplification (TSA) do Sistema
Embora o aperfeiçoamento baseia-TSA é usado na fase final da rotulagem, preparando-se para esta reacção pode ter mais do que 1 hora. Por isso, é conveniente para fazer os reagentes TSA antes de iniciar a marcação.
- Faça solução estoque fluorophore tiramida. Utilizar o reagente fluoróforo tiramida fornecido em frascos individuais com o kit de marcação de TSA. Adicionar 300 mL de DMSO para o frasco de reagente tiramida. Solução estoque tiramida fluoróforo é estável durante pelo menos 3 meses quando armazenadas a 4 ° C.
- Adicione o tampão de lavagem de TNT contendo: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 0,15 M; 0,05% de Tween-20. Se necessário 0,3% de Triton X-100 pode ser substituído por 0,05% de Tween-20. Alternattivamente PBS pode ser utilizado como tampão de lavagem.
- Adicione TNB tampão contendo bloqueio: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 0,15 M; 0,5% de reagente de bloqueio (fornecido com o kit). Para dissolver completamente o reagente bloqueador, lentamente adicionar em pequenos incrementos para o buffer enquanto se agitava. Aquecer esta solução gradualmente a 55 ° C com agitação contínua. Isso pode levar de 30-60 min. A solução vai aparecer leitoso. Traga à temperatura ambiente antes de usar. Alíquotas e armazenar a -20 ° C para uso a longo prazo.
2. Preparação de Seções
Use os slides com 5 seções montadas m de espessura de corte de tecidos fixados em formalina.
- Trate seções com xilol por 15 min.
- Rehidratar seções da seguinte forma: molho em 96% EtOH 2x por 5 minutos cada; molho em 80% EtOH por 5 min; lavar 2x com água durante 5 min cada.
- Adicione a solução de trabalho de proteinase K por diluição de solução stock de Proteinase K a 50 mg / ml em PBS.
- Adicionar ProteinaseK solução de trabalho para seções. Incubar 15 min a 23 ° C. O volume da solução e o tempo de digestão pode ter de ser ajustada dependendo do tamanho dos cortes e tipos de tecidos. Para uma secção pequena (inferior a 5 mm de diâmetro) de 50 ul de solução de proteinase seria suficiente. Secção de um tamanho médio (~ 10 mm de diâmetro), adicionar 100 ml de solução de Proteinase K. Para grandes seções do volume da solução podem ser ampliados. Em todos os casos ter o cuidado de evitar overdigestion de seções que leva à completa perda de sinal e destrói morfologia do tecido. Isso muitas vezes acontece se o tempo de incubação superior a 25 min.
- Lave os cortes em água destilada 2x água por 5 minutos cada. Preparar a mistura de rotulagem contendo sonda ativa enquanto seções estão na água.
3. De coloração à base de TOPO VACC
- Prepare a solução de sonda ativa, combinando o seguinte:
Água - 11,75 mL
1 M de Tris-HCl, pH 7,4-1,25 μl
100 pmol de 12-base de balanço suicídio oligonucleotídeo - 1 ml
100 pmoles do adaptador oligonucleótido - 1 ul
50 pmol VACC TOPO - 10 ul - Misture delicadamente por pipetagem. Incubar à temperatura ambiente (23 ° C) durante 15 min para permitir a activação da sonda.
- Tome seções do frasco de lavagem e aspirar a água restante. Em seguida, aplique a solução de sonda ativo preparada no passo 3.1 (25 ul por ~ seção 10 x 10 mm).
- Lamela as secções e incubar durante 15 min a 23 ° C. Dip desliza na água para remover suavemente lamelas. Lavar em água 3x por 5 min cada.
4. TSA Signal Enhancement
- Cobrir as secções de tecido com TNB tampão de bloqueio preparado anteriormente e incubar numa câmara húmida durante 30 minutos à temperatura ambiente (23 ° C).
- Prepara-se uma diluição de conjugados de estreptavidina-peroxidase de rábano (SA-HRP) em TNB tampão de bloqueio 1:100. Aspirar TNBTampão de bloqueio e aplicar a solução de SA-HRP. Incubar as lâminas com SA-HRP durante 30 minutos à temperatura ambiente. Use volume de reagente suficiente para cobrir a secção de tecido, geralmente de 100 mL por seção.
- Lave as lâminas 3x durante 5 minutos cada em tampão de lavagem de TNT (ou PBS), à temperatura ambiente.
- Prepara-se uma diluição de 1:50 de estoque tiramida fluoróforo em 1x Amplificação diluente do kit. Pipetar a solução de trabalho fluorophore tiramida em cada slide. Use solução de trabalho suficiente para cobrir totalmente a secção de tecido, geralmente de 100 mL por seção. Faça solução de trabalho fluorophore tiramida imediatamente antes de cada marcação. A solução não pode ser reutilizado, então descartar qualquer porção não utilizada do que após marcação.
- Incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 3 a 10 min. Monitorar aumento de fluorescência com um microscópio até os primeiros sinais de estruturas pode ser visto. Avançar rapidamente para lavar passo.
- Lave as lâminas 3x por 5 min cada em tampão de lavagem TNT (ou PBS) no quarto temperatura com agitação.
- Adicione a solução antifading com DAPI e lamela. Observar sob o microscópio de fluorescência. Para visualizar DAPI e FITC usar um conjunto de filtro passa-banda:
D490/40 FITC excitação, emissão 520/10; DAPI D360/40 excitação, emissão 460/20, ou semelhante.
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Representative Results
O princípio da técnica para rotulá fagócitos de gestão de resíduos ativos é apresentado na Figura 1. O esquema demonstra que a detecção do produto em três etapas. O primeiro passo envolve a activação da sonda (figura 1A); na segunda etapa, a sonda é activado ligado a quebras de ADN específicos em secções de tecido (Figura 1C); a terceira etapa inclui a amplificação do sinal de fluorescência (Figura 1D). Em uma explicação mais detalhada, a detecção é o seguinte:
Ativação 1. Sonda. Antes da reacção de ligação VACC TOPO precisa de ser ligado de forma covalente à extremidade 3 'do oligo. Durante a ativação sonda VACC TOPO atribui ao duplex adaptador hairpin e se unirá a vertente superior. A 12 base de longo-parte, em seguida, separa permanentemente, deixando VACC TOPO ligado à extremidade 3 'do grampo. Este oligonucleótido com a enzima ligada à sua extremidade 3 'pode rotular de tipo quebras DNase II (Figura 1B). O balanço de 12 de base e um oligo adaptador são necessários porque a enzima não vai cortar um fio mais curto 8 e, portanto, não será capaz de anexar à sonda e ativar sua extremidade 3 '.
2. Sonda ligadura. Grampos biotinilados foram ligados por VACC TOPO para 5'OH quebras de DNA de extremos cerses gerados pelos fagócitos para digerir os núcleos de células mortas. As sondas anexados são visualizados por fluorescência usando aprimoramento tiramida 9.
3. Sinalização fluorescente é conseguido através de amplificação de sinal de tiramida sistema 9 (TSA). Durante este processo, conjugados estreptavidina-peroxidase de raiz forte anexar grampos biotinilados e activar a ligação do tyramides fluorescentes nas imediações, a criação de sites fortemente fluorescentes.
e_content "> A aplicação da técnica de acidente vascular cerebral experimental é mostrado na Figura 2. Figura 2 apresenta imagens de fluorescência das células fagocíticas activas compensação morte celular no cérebro de rato 48 horas após o início da isquemia cerebral focal permanente. As células são marcadas com o TOPO VACC sondas como descrito. As sondas visualizar phagolysosomes gigantescas 10 com DNase II breaks (fluorescência verde), marcando fagócitos que engolir e digerir corpos celulares 7 ativamente. co-coloração simultânea com DAPI etiquetas cromatina dos fagócitos e das células engoliram dentro fagócitos. A sobreposições de VACC TOPO e sinais DAPI permitir a fácil identificação e análise morfológica de células fagocíticas ativas. Para apresentação mais clara, as imagens são complementadas por diagramas dos eventos mostrados."width =" jpg 500 "/>
Figura 1 Detecção de folga fagocitária em seções do cérebro por sondas ligatable:. Princípio do método.
Figura 2 Experimental curso de 48 horas após o início da isquemia:. Folga fagocitária de morte celular Dois exemplos de folga fagocitária.. Ligatable sonda VACC TOPO - fluorescência verde. DAPI mancha Nuclear - fluorescência azul. Os diagramas dos eventos apresentados nas imagens (coluna da direita) mostram núcleos de fagócitos e picnóticos engolida núcleos extras em várias fases de digestão. Barra de escala - 15 mm.
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Discussion
Neste vídeo podemos demonstrar, no formato de secção de tecido, como rotular fagócitos ativos que a morte de células claras em isquemia cerebral focal. A técnica apresentada é a primeira abordagem que rotula especificamente apenas as células de gestão de resíduos que engoliram e digerem ativamente corpos celulares. Isto faz com que seja vantajosa em relação a outros métodos existentes para a marcação das células fagocíticas, que não têm essa capacidade.
O método utiliza um marcador geral e seletiva baseada no DNA da atividade fagocitária - double-stranded, rombo quebras de DNA 5'OH produzidos em phagolysosomes de células de gestão de resíduos durante a digestão dos núcleos engoliram. Esta marcação específica de células fagocíticas apenas activas permite uma avaliação precisa da intensidade e da eficiência da reacção fagocíticas no cérebro isquémico.
A técnica é robusta e funciona bem se todos os passos são seguidos como descrito. A proteinase K digestino passo é particularmente importante para a coloração forte e reprodutível. Overdigestion neste passo provoca a perda de ADN a partir da secção e pode diminuir ou mesmo eliminar o sinal. O outro ponto crítico é a utilização de uma preparação altamente activo da enzima topoisomerase vaccinia. A limitação da técnica é que ela não foi otimizado para uso com cortes congelados frescos.
A abordagem tem ampla aplicabilidade ao estudo de apoptose e é expansível para outros tecidos e condições além do cérebro isquémico. É particularmente conveniente, quando utilizado para a visualização de reacções fagocíticas em tecidos e órgãos constituídos por vários tipos de células com diferentes células de gestão de resíduos que participam.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela concessão R01NS062842 do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame, Institutos Nacionais de Saúde (VVD) e por doações R21 NS064403 do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame, Institutos Nacionais de Saúde, através ARRA (VVD) e R21 EB006301 Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
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