Summary
Nous présentons une nouvelle technique de fluorescence pour le marquage sélectif in situ des cellules phagocytaires actives dans, qui clairement de cadavres de cellules dans la course. L'approche est importante pour évaluer la réaction de l'ischémie cérébrale, car seule une faible proportion des phagocytes présents dans le cerveau ischémique participer à la clairance de la mort cellulaire.
Abstract
Nous décrivons une nouvelle approche histochimique pour la visualisation de la clairance phagocytaire dans l'ischémie cérébrale focale. L'approche permet l'étude de l'élimination des cellules mortes en course par les phagocytes de gestion des déchets de toute lignée cellulaire. Bien que de nombreuses cellules d'origines différentes qui sont capables de phagocytose sont présents dans le cerveau ischémique, une partie seulement d'entre eux engloutir activement et digérer corps cellulaires. La visualisation sélective, la quantification et l'analyse de cette gestion des déchets phagocytaire actif sont utiles pour évaluer la réponse du cerveau à l'ischémie. Clairance de la mort cellulaire efficace est important pour la guérison du cerveau de la lésion ischémique, car elle ouvre la voie à des processus de régénération ultérieures. L'échec de nettoyer les cadavres se traduirait par une réaction toxique causée par l'ADN et les protéines non dégradées. La procédure décrite utilise des sondes fluorescentes ligaturées sélectivement par une topoisomérase virale à des ruptures d'ADN caractéristiques produites dans tous les phagocytes pendant engloutissementet la digestion des cellules irrémédiablement endommagée par l'ischémie. La méthode est un nouvel outil pour l'étude de la réaction du cerveau à une lésion ischémique.
Introduction
L'AVC ischémique induit de profonds changements dans les tissus du cerveau touchée. Il initie une mort cellulaire massive, ce qui conduit à l'activation rapide des cellules phagocytaires d'origine résidentes microgliale. Elle définit également hors de l'infiltration cérébrale ischémique par divers types de phagocytes professionnels dérivés du sang, y compris les neutrophiles, les macrophages, dendritique, et les mastocytes 1,2.
Il est encore débattue de savoir si cette réponse à une lésion ischémique joue un un rôle positif ou négatif. Bien que la phagocytose après un AVC peut être bénéfique, car elle efface les cellules mortes et supprime l'inflammation, il génère également des espèces réactives de l'oxygène toxiques affectant la survie neuronale et aggravant des lésions tissulaires 1-5.
Bien que plusieurs types de cellules phagocytaires infiltrent cérébrale ischémique, participent pas tous à la gestion des déchets par engloutissant des cadavres cellulaires et ouvrant la voie à des processus de régénération 1-3. Cette creates une exigence pour l'identification sélective des cellules de gestion des déchets qui effectuent jeu phagocytaire de la mort cellulaire dans la course. Quand l'imagerie de telles cellules de gestion des déchets actifs, il est également important de répondre à la question de savoir comment ils se dégradent efficacement les cadavres de cellules englouti. La dégradation effective et complète de l'ADN de la cellule de mourir dans la phagocytose est essentielle car elle empêche l'auto-immunisation et la libération de matières nucléaires pathologique 6.
Ici, nous présentons de nouvelles sondes qui utilisent des cassures d'ADN spécifiques comme marqueurs de cellules phagocytaires actifs. Ces pauses de signature sont fabriquées exclusivement en cas de panne de noyaux englouti l'intérieur des cellules de gestion des déchets fonctionnels. Par conséquent, les sondes étiquette sélectivement que les phagocytes qui engloutissent et digèrent activement cadavres cellulaires. Ils permettent également observer l'intensité et l'achèvement de la rupture d'ADN après le engloutissement. Les sondes sont utiles dans l'évaluation de l'intensité et efficirence de jeu phagocytaire.
Les nouvelles sondes reposent sur un marqueur non-protéique base et peuvent donc être particulièrement avantageux dans les études de course, où des dommages ischémique peut perturber la morphologie cellulaire ou épuiser marqueurs à base de protéines, en particulier dans la zone ischémique noyau.
Le principe de la technique est présenté dans la figure 1. La figure montre des sondes oligonucléotidiques en forme d'épingle à cheveux ligaturées par l'enzyme topoisomérase de la vaccine (VACC TOPO) OH en 5 'de l'ADN à extrémités générées par lysosomale DNase II pendant la digestion de l'ADN 7.
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Protocol
Le procédé est approprié pour des coupes de tissus, de paraffine fixés au formaldehyde. La technique est illustrée ici dans son application à la course expérimentale chez le rat.
1. Préparation des composants système tyramide amplification du signal (TSA)
Bien que l'amélioration de la base-TSA est utilisé dans l'étape finale de l'étiquetage, la préparation de cette réaction peut prendre plus d'une heure. Par conséquent, il est commode d'effectuer les réactifs TSA avant de commencer l'étiquetage.
- Faire fluorophore tyramide solution stock. Utilisez le réactif fluorophore tyramide fourni dans des flacons individuels avec le kit de marquage TSA. Ajouter 300 ul de DMSO dans le flacon de réactif de tyramide. Solution fluorophore tyramide du stock est stable pendant au moins 3 mois lorsqu'il est conservé à 4 ° C.
- Faire un tampon de lavage contenant du TNT: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,05% de Tween-20. Si besoin est de 0,3% de Triton X-100 peut être remplacée par la 0,05% de Tween-20. Alternatvement PBS peut être utilisé comme tampon de lavage.
- Faire un tampon de blocage TNB contenant: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; Réactif de blocage de 0,5% (fourni avec le kit). Pour dissoudre complètement le réactif de blocage, ajouter lentement par petites portions à la mémoire tampon tout en agitant. Chauffer cette solution progressivement à 55 ° C sous agitation continue. Cela peut prendre 30-60 minutes. La solution laiteuse. Porter à la température ambiante avant de l'utiliser. Aliquote et conserver à -20 ° C pour une utilisation à long terme.
2. Préparation des sections
Utilisez diapositives montées avec 5 sections um d'épaisseur découpées dans des tissus fixés au formol.
- Traiter sections avec du xylène pendant 15 min.
- Réhydrater sections, comme suit: tremper dans EtOH à 96% 2x 5 min chacune; tremper dans 80% EtOH pendant 5 min; laver avec de l'eau pour 2x 5 min chacun.
- Préparer une solution de travail en diluant la protéinase K protéinase K solution stock à 50 pg / ml dans du PBS.
- Ajouter à la protéinaseSolution K de travail pour les sections. Incuber 15 min à 23 ° C. Le volume de la solution et le temps de digestion peuvent devoir être ajustés en fonction de la taille des sections et des types de tissus. Pour une section de petite taille (inférieure à 5 mm de diamètre) 50 pi de solution à la protéinase seraient suffisantes. Pour une taille moyenne (~ 10 mm de diamètre) de l'article, ajouter 100 ul d'une solution à la protéinase K. Pour les très grandes sections du volume de la solution peut être mise à l'échelle vers le haut. Dans tous les cas veiller à éviter une digestion excessive de sections qui conduit à une perte totale de signal et détruit la morphologie des tissus. Cela se produit souvent si le temps d'incubation est supérieur à 25 min.
- Laver les coupes dans 2x eau distillée pendant 5 minutes chacun. Préparer le mélange de l'étiquetage contenant sonde active tandis que les sections sont dans l'eau.
3. Coloration à base de TOPO VACC
- Préparer la solution de sonde active en combinant ce qui suit:
Eau - 11.75 pi
1 M de Tris-HCl, pH 7.4 à 1.25 μl
100 pmol de 12 bases oligonucléotide surplomb de suicide - 1 pl
100 pmol de l'oligonucléotide adaptateur - 1 pl
50 pmol VACC TOPO - 10 pi - Mélanger doucement par pipetage. Incuber à température ambiante (23 ° C) pendant 15 min pour permettre l'activation de la sonde.
- Prenez sections de pot de lavage et aspirer l'eau restante. Ensuite, appliquer la solution de sonde active préparé à l'étape 3.1 (25 pi par ~ section 10 x 10 mm).
- Lamelle les sections et incuber pendant 15 min à 23 ° C. Tremper les lames dans de l'eau pour enlever délicatement les lamelles. Laver à l'eau de 3x pendant 5 minutes chacun.
4. TSA Signal Enhancement
- Couvrir les coupes de tissu avec tampon de blocage TNB préparé précédemment et incuber les lames dans une chambre humide pendant 30 min à température ambiante (23 ° C).
- Préparer une dilution 1:100 de conjugués streptavidine-peroxydase de raifort (HRP) SA-TNB en tampon de blocage. Aspirer TNBtampon de blocage et appliquer la solution SA-HRP. Incuber les lames avec SA-HRP pendant 30 min à température ambiante. Utiliser un volume de réactif suffisante pour couvrir la section de tissu, généralement de 100 pi par section.
- Laver les lames de 3x 5 min chacun dans du tampon de lavage TNT (ou PBS) à température ambiante.
- Préparer une dilution 1:50 de fluorophore tyramide stock en 1x Amplification diluant du kit. Introduire à la pipette la solution de travail fluorophore tyramide sur chaque diapositive. Utiliser une solution de travail suffisamment pour couvrir complètement la section de tissu, généralement de 100 pi par section. Préparer une solution de travail fluorophore tyramide immédiatement avant chaque étiquetage. La solution ne peut pas être réutilisé, donc jeter toute portion inutilisée de celui-ci après le marquage.
- Incuber les lames à la température ambiante pendant 3 à 10 min. Surveillance augmentation de fluorescence au microscope jusqu'à ce que les premiers signes de structures peuvent être vus. Procéder rapidement à laver étape.
- Laver les lames pendant 5 min 3x chacun dans un tampon de lavage TNT (ou PBS) à la chambre temperature avec agitation.
- Ajouter la solution de antidécoloration avec DAPI et lamelle. Observer sous microscope à fluorescence. Pour visualiser DAPI et fluorescence FITC utilisent un jeu de filtres passe-bande:
FITC excitation D490/40, émission 520/10; DAPI excitation D360/40, émission 460/20, ou similaire.
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Representative Results
Le principe de la technique pour l'étiquetage des phagocytes de gestion des déchets actifs est présentée dans la figure 1. Le schéma montre que le produit de détection en trois étapes. La première étape comprend l'activation de la sonde (figure 1A); dans la seconde étape de la sonde activée est ligaturé à des cassures d'ADN spécifiques dans des coupes de tissus (figure 1c); la troisième étape comprend l'amplification du signal fluorescent (figure 1D). Dans une explication plus détaillée, la détection est la suivante:
Activation de la sonde 1.. Préalablement à la réaction de ligature VACC TOPO doit être lié de manière covalente à l'extrémité 3 'de la oligoprobe. Lors de l'activation de la sonde VACC TOPO attache au duplex épingle adaptateur et clive le brin supérieur. Le 12-base-partie longue sépare alors en permanence, laissant VACC TOPO attaché à l'extrémité 3 'de l'épingle. Cet oligonucléotide avec l'enzyme liée à son extrémité 3 'peut étiqueter DNase II pauses de type (figure 1B). L'excédent de 12 bases et un oligo adaptateur sont nécessaires parce que l'enzyme ne sera pas coupé une mèche plus courte 8 et sera donc incapable de joindre à la sonde et activer son extrémité 3 '.
2. Ligature de la sonde. Épingles biotinylés sont ligaturées par VACC TOPO à 5'OH cassures de l'ADN à extrémités franches générés par les phagocytes digérer noyaux de cellules mortes. Les sondes fixées sont visualisés par fluorescence à l'aide tyramide amélioration 9.
3. Signalisation fluorescent est obtenue en utilisant amplification du signal tyramide système (TSA) 9. Au cours de ce processus conjugués streptavidine-peroxydase de raifort attachent à épingles biotinylés et activer la liaison de tyramides fluorescents dans le proche voisinage, la création de sites fortement fluorescentes.
e_content "> Application de la technique de course expérimental est représenté sur la figure 2. Figure images 2 présente de fluorescence des cellules phagocytaires actifs de compensation mort cellulaire dans le cerveau de rat 48 heures après le début de focale ischémie cérébrale permanente. Les cellules sont marquées par le TOPO VACC sondes comme décrit. Les sondes visualiser phagolysosomes gigantesques 10 avec DNase II pauses (fluorescence verte), les phagocytes qui engloutissent activement et digèrent les cadavres de cellules 7 marquage. co-coloration simultanée avec DAPI étiquettes chromatine des phagocytes et des cellules englouti à l'intérieur des phagocytes. L' superpositions de VACC TOPO et signaux DAPI permettre l'identification facile et l'analyse morphologique des cellules phagocytaires actifs. Pour la présentation plus claire, les images sont complétées par des schémas d'événements présentés.jpg "width =" 500 "/>
Figure 1: Détection de jeu phagocytaire dans des coupes de cerveau par des sondes ligaturables:. Principe de la méthode.
Figure 2 expérimentale course de 48 heures après l'ischémie apparition:. Phagocytaire jeu de la mort cellulaire Deux exemples de jeu phagocytaire.. Ligaturables sonde VACC TOPO - fluorescence verte. Colorant nucléaire DAPI - fluorescence bleue. Schémas des événements présentés dans les images (colonne de droite) montrent noyaux des phagocytes et pycnotique engloutis noyaux supplémentaires à divers stades de la digestion. Barre d'échelle - 15 um.
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Discussion
Dans cette vidéo, nous démontrons, dans le format de coupe de tissu, la façon d'étiqueter les phagocytes actifs dont la mort cellulaire claire dans l'ischémie cérébrale focale. La technique présentée est la première approche qui marque spécifiquement que les cellules de gestion des déchets qui ont englouti et digérer activement cadavres cellulaires. Il est donc avantageux par rapport à d'autres méthodes existantes pour le marquage de cellules phagocytaires, qui ne possèdent pas cette capacité.
La méthode utilise un marqueur à base d'ADN générale et sélective de l'activité phagocytaire - double brin, émousser terminés pauses 5'OH ADN produites dans phagolysosomes des cellules de gestion des déchets lors de la digestion des noyaux englouti. Ce marquage spécifique des cellules phagocytaires seulement actifs permet une évaluation précise de l'intensité et l'efficacité de la réaction phagocytaire dans le cerveau ischémique.
La technique est robuste et fonctionne bien si toutes les étapes sont suivies comme décrit. La protéinase K digestibilitéà l'étape est particulièrement importante pour la coloration forte et reproductible. Digestion excessive à cette étape conduit à la perte de l'ADN à partir de la section et peut réduire ou même d'éliminer le signal. L'autre point critique est d'utiliser une préparation très actif de l'enzyme topoisomérase de la vaccine. Une limitation de la technique est qu'elle n'a pas été optimisée pour l'utilisation avec des coupes congelées fraîches.
L'approche a une large applicabilité à l'étude de l'apoptose et est extensible à d'autres tissus et les conditions au-delà cérébrale ischémique. Il est particulièrement commode lorsqu'il est utilisé pour la visualisation des réactions phagocytaires dans les tissus et organes composés de plusieurs types de cellules avec des cellules de gestion des déchets divers participants.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par la subvention R01NS062842 de l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies, National Institutes of Health (VVD) et par des subventions R21 NS064403 de l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies, les Instituts nationaux de la santé à travers l'ARRA (VVD) et R21 EB006301 Institut national d'imagerie biomédicale et bio-ingénierie, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
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