Längsgående Mätning av extracellulär matrix Stelhet i 3D tumörmodeller Använda Partikel-tracking Microrheology

Summary

Partikel-tracking microrheology kan användas för icke-destruktivt kvantifiera och rumsligt kartlägga förändringar i extracellulära matrix mekaniska egenskaper i 3D tumörmodeller.

Abstract

Den mekaniska mikromiljö har visat sig fungera som en viktig regulator av tumörtillväxt beteende och signalering, som själv är ombyggda och ändras som en del av en uppsättning av komplexa, tvåvägs mechanosensitive interaktioner. Medan utvecklingen av biologiskt relevanta 3D tumörmodeller har underlättat mekanistiska studier om effekterna av matris reologi på tumörtillväxt, det omvända problemet med kartläggning förändringar i den mekaniska miljön induceras av tumörer är fortsatt utmanande. Här beskriver vi genomförandet av partikel-tracking microrheology (PTM) tillsammans med 3D-modeller av cancer i bukspottskörteln som en del av en robust och livskraftig strategi för längs övervakning av fysiska förändringar i tumörens mikromiljö, in situ. Den metod som beskrivs här integrerar ett system för beredning av in vitro-3D-modeller inbäddade i en modell extracellulär matrix (ECM) byggnadsställning av typ I-kollagen med fluorescerande prober jämnt fördelade för ponings-och tidsberoende microrheology mätningar i hela provet. In vitro-tumörer är pläterade och sonderas i parallella förhållanden med hjälp av multispot avbildningsplattor. Rita på etablerade metoder, är videor av spårsondrörelser omvandlas via det allmänna Stokes Einstein Relation (GSER) att rapportera den komplexa frekvensberoende viskoelastiska skjuvmodul, G * (ω). Eftersom detta tillvägagångssätt är imaging-baserade, är mekanisk karakterisering också avbildas på stora genomlysnings rumsliga områden att samtidigt rapportera kvalitativa förändringar i 3D tumörstorlek och fenotyp. Representativa resultat som visar kontrasterande mekanisk respons i delregioner i samband med lokal invasion-inducerad matrisnedbrytning samt systemkalibrering, är valideringsdata presenteras. Oönskade resultat från vanliga experimentella fel och felsökning av dessa frågor presenteras också. Den 96-väl 3D kultur plätering format förs i detta protokoll är conducive till korrelation av microrheology mätningar med terapeutiska screeninganalyser eller molekylär avbildning för att få nya insikter i effekten av behandlingar eller biokemiska stimuli på den mekaniska mikromiljö.

Introduction

Det framgår av en växande mängd bevis i litteraturen att cancerceller, som med icke-maligna däggdjurs epitelceller, är mycket känsliga för de mekaniska och biofysikaliska egenskaper hos den omgivande extracellulära matrix (ECM) och andra mikrokomponenter ^1-9. Elegant mekanistiska studier har gett insikter om betydelsen av extracellulärt styvhet som en komplex mechanosensitive partner signalsystem som reglerar malign tillväxt beteende och morfogenes ^2,3,10,11. Detta arbete har underlättats särskilt genom utvecklingen av 3D in vitro tumörmodeller som åter biologiskt relevant vävnadsarkitektur och kan odlas i ställningsmaterial med avstämbara mekanik och avbildas genom optisk mikroskopi ^12-19. Men den andra sidan av denna mechanoregulatory dialog mellan tumör och mikromiljö, varigenom cancerceller i sin tur modifiera reologin hos omgivningen, är fortfarande någotsvårare att studera. Till exempel, under invasionsprocesser får cellerna vid periferin av en tumör genomgå epitelial till mesenkymala övergång (EMT) och öka uttryck av matrix-metalloproteaser (MMP: er) som orsakar lokal nedbrytning av ECM ^{20 till 22,} vilket i sin tur påverkar mechanosensitive tillväxtbeteende andra proximala tumörceller. Genom olika biokemiska processer, cancerceller ringa kontinuerligt den lokala styvhet sin miljö upp och ner för att passa olika processer vid olika tidpunkter. Den metod som beskrivs här motiveras av behovet av analytiska verktyg som rapporterar lokala förändringar i styvhet och efterlevnad av ECM under tillväxt, som kan integreras med 3D-tumörmodeller och korrelerade längsled med biokemiska och fenotypiska förändringar utan att avsluta kulturen.

På jakt efter en lämplig teknik för att genomföra i detta sammanhang, partikel-tracking microrheology (PTM) framstår som en stark kandidat.Denna metod, pionjärer ursprungligen av Mason och Weitz ^23,24, använder rörelse spår sonder inbäddade i en komplex vätska för att rapportera frekvensberoende komplex viskoelastiska skjuvmodul, G * (ω) i micron längdskalor. Denna allmänna strategi har utvecklats med flera varianter anpassade för olika tillämpningar i mjuk-kondenserad materia, kolloider, biofysik och polymerfysik ^25-31. PTM har vissa fördelar i förhållande till andra metoder, eftersom avläsning av lokal viskoelasticitet tillhandahålls av icke-förstörande video avbildning av biokemiskt inaktiva spår sonder som är införlivade i samband med kultur förberedelser och förblir på plats under längre perioder av tillväxt. Detta står i kontrast till guldstandardmått med en oscillerande skjuvning bulk rheometer, som med nödvändighet kräver uppsägning av kultur och redovisar den delen makroskopisk reologi av provet istället punktmätningar inom komplexet 3D tumören microenvirjön. I själva verket ett antal studier har visat på nyttan av att tolka mätningar av spårsondrörelser i eller kring cancer eller icke-cancerceller för att mäta deformationer i samband med cellmigration ^32, mekanisk stress som en expanderande spheroid ^33, intracellulär reologi ^34,35, och att kart mekaniska påfrestningar i iscensatte silkespapper ^36, och förhållandet mellan porstorlek och invasion hastighet ^37. Andra tekniker som är lämpliga för microrheology, såsom atomkraftsmikroskopi (AFM) kan genomföras, men främst för att sondera punkter på provytan och även kan innebära kultur sterilitet frågor som försvårar längsgående mått ^38.

Här beskriver vi ett omfattande protokoll omfattar metoder för tillväxt av 3D tumör spheroids lämpliga för överföring till ECM med inbäddade fluorescerande prober för video partikel-tracking-och analysmetoder för tillförlitligt kartlägga rumsligaförändringar i microrheology över tiden i kultur. I föreliggande implementering, är 3D-tumörmodeller vuxit i multispot-format med utsikt mot inkorporering av microrheology mätningar med andra traditionella analyser (t.ex. cytotoxicitet) som detta format bidrar till. I detta representativa exempel på denna metod vi kultur in vitro 3D spheroids använder PANC-1-celler, en etablerad pankreascancer cellinje kända för att bilda sfäroider ^39, men alla mätningar som beskrivs här är brett tillämpbar för att studera av solida tumörer med hjälp av olika cellinjer lämpliga för 3D-kultur. Eftersom denna metod är till sin natur imaging-baserade den är idealisk för samtidig registrering av högupplösta microrheology uppgifter med stora genomlysnings synfält som rapporterar förändringar i celltillväxt, migration och fenotyp. Genomförandet av PTM integrerat med genomlysning mikroskopi på detta sätt antar reproducerbar placering av mikroskop scenen which är vanligtvis tillgänglig på motordrivna kommersiell widefield epifluorescence biologiska mikroskop. Protokollet utvecklades nedan kan genomföras med någon rimligen utrustade automatiserad fluorescens biologiska mikroskop. Detta är en inneboende dataintensiv metod, som kräver förvärv av gigabyte digital video mikroskopi data för offline bearbetning.

I följande protokoll, protokoll 1 avser den inledande beredningen av tumör sfäroider som beskrivs här med hjälp av overlay på agaros men kan ersättas med en mängd andra metoder såsom hängande droppe ^40, eller roterande kultur ⁴¹ tekniker. Protokoll 2 beskriver processen att bädda spheroids i en kollagenbyggnadsställning men alternativt kan in vitro 3D tumörer odlas genom inkapsling eller inbäddning av suspenderade celler i ECM ^12,15, snarare än enstaka förformade icke-vidhäftande sfäroider. Efterföljande protokoll beskriver förfaranden för obtaining tidsupplösta microrheology mätningar genom att förvärva och behandla videomikroskopi data, respektive. Databehandling beskrivs med hjälp av MATLAB, att använda sig av öppen källkod rutiner för PTM bygger på algoritmer som ursprungligen beskrevs av Crocker och Grier ^42, som har också i stor utsträckning utvecklats för olika mjukvaruplattformar (se http://www.physics.emory.edu/ ~ veckor / IDL /).

Protocol

1. Odling Tumör spheroids

1. Blanda 10 ml av cellodlingskvalitet vatten med 0,1 g agaros för att erhålla en 1% agaros-lösning.
2. Värme agaroslösningen till över 70 ° C (ungefär 14 sek i en vanlig mikrovågsugn eller genom användning av en värmeplatta) före alikvotering av 40 pl av agaroslösningen i en brunn på en 96-brunnars platta.
3. Inkubera plattan vid 37 ° C under minst en timme medan skörda cellerna med användning av standardtekniker.
4. Använd en hemacytometer för att bestämma koncentrationen av celler i suspension.
5. Späd cellsuspensionen till 1000 celler / ml och tillsätt 100 | il av denna spädning till brunnen innehållande den härdade agarosen sängen.
6. Placera provet på en skakanordning över natten i en inkubator inställd på 37 ° C och 5% _CO2.
7. Ta prov från shaker och tillsätt 100 l av cellodlingsmedia.
8. Inkubera spheroids tills önskad diameter har nåtts. Till exempel, efter 9 dagar, en spheroid kommer att vara ungefär 450 pm i diameter. Under denna tid kan färskt tillväxtmedium tillsättas till brunnarna utan aspiration bör undvikas, eftersom detta kommer att resultera i avlägsnande av den sfäroid.

2. Förbereda 3D Tumör sfäroider inbäddade i ECM

1. Förbered en arbetsstation med material som behövs inom ett laminärt flöde huva.
2. Förbered en utspädd blandning av karboxylat-modifierade 1 ìm diameter fluorescerande spår sonder genom att lägga till två delar lagersonder (2% fasta ämnen) till 25 delar sterilt vatten.
3. Ta en flaska med 3,1 mg / ml bovint kollagen från kylskåpet och placera den på is.
4. Alikvotera 125 pl av kollagen i en tom 2 ml injektionsflaska.
5. Lägg 50 pl utspädd spårsondlösning till injektionsflaskan som innehåller kollagen och skaka snabbt att distribuera sonder.
6. Lägg till 235 l av lämplig cellodlingsmedier innehållande fenolrött (som blir gul) för en total volym på 410 ml och skaka snabbt innan du tar bort 205 ml (hälften av den totala volymen) och placera den i ett nytt 2 ml injektionsflaska. Injektionsflaska 1 innehåller tumören sfäroiden och Vial 2 kommer att vara en kontrollblandning.
7. Lägg ~ 2 ^ il av 1 M NaOH med burk 1 för att ge lösningen tillbaka till neutralt pH (odlingsmedia innehållande fenolrött bör återgå till rött). Observera att detta kommer att leda till blandningen för att börja bota om den inte hålls på is. Vortex kort att blanda, sedan tillbaka till is rack omedelbart.
   OBS! Sfäroid är knappt synlig för blotta ögat efter 9 dagar av kultur och dess avlägsnande från agaros sängen är en grannlaga uppgift. Användning av en dissektion mikroskop kan vara till hjälp för vissa användare. Underhålla integritet sfäroiden under överföring är av största vikt.
8. Med hjälp av en bred mun pipettspetsen, försiktigt bort 40 l av media från brunnen innehåller tumören spheroid. Behåll detta 40 ^ under den tid som nästa steg.
9. Kontrollera också att se om sfäroidavlägsnades i föregående steg. Om det var, tillsätt 40 pl innehåller sfäroid med burk 1. Om inte, placera 40 pl tillbaka i brunnen och upprepa föregående steg.
10. Försiktigt rör Vial 1 (inte riskerar vortex, det kan skada sfäroid) innan du överför blandningen i 60 ul portioner i tre separata brunnar i en 96-brunnar. Inspektera varje brunn med ett mikroskop efter att ha lagt blandning för att avgöra vilka väl innehåller sfäroid.
11. Lägg ~ 2 ^ il 1 M NaOH och 40 | il av cellodlingsmedier till flaska 2 och virveln innan aliquotting 60 | il av denna blandning till en tom brunn i 96-brunnars platta och märkning som en kontroll.
12. Placera plattan i en 37 ° C inkubator för att härda i minst en timme.

3. Konstruera Grid samplingspunkter och ta en video på varje punkt

1. Överför provplattan från inkubatorn till mikroskopställningen. Låt 10 minuter för provet att equilibrate med rumstemperaturen om en uppvärmd skede inte är tillgänglig.
2. Provet observeras med låg strömförsörjning objektiv att se till att den är hel och redo för avbildning. Bestäm tumörens position i brunnen.
3. Bestäm hur många provpunkter för att ta. Vanligtvis kommer 20 provpunkter i varje brunn, fördelade i koncentriska ringar runt sfäroid producera adekvat detaljerade resultat.
4. Flytta bordet till varje önskat läge och använda mikroskop gränssnitt programvara för att spela in x-och y-koordinater (eller spela in koordinater manuellt om gränssnitt programvara är tillgänglig).
5. Växla mikroskopet till en hög effekt objektiv (typiskt 100X) och välj lämpligt filterkuben för excitationsvåglängden av spår sonder. Använd listan över punkter som skapas i steg 3.4 för att flytta till den första punkten i rutnätet.
6. Justera fokus att hitta botten av brunnen, sedan gå upp för att hitta ett synfält (FOV) som innehåller flera i-fokus tracer sonder.
7. Observera intensiteten histogram och justera exponeringen intensitet och tid för att ge största dynamiska omfånget möjligt och se till att bilden inte blir mättad.
8. Skaffa en videosekvens med en bildhastighet på 20-30 msek per ram (ca 800 bilder eller 16-24 sek lång rekommenderas att ge tillräcklig statistik för robust MSD beräkning balanseras med behovet av att minimera förvärvs tid vid varje rumslig rutnätspunkt) och spara med en lämplig konvention. Under inspelningen, inte röra mikroskopet eller bord.
9. Upprepa steg från 3,6 till 3,9 för varje samplingspunkt i rutnätet.
10. Upprepa steg från 3,3 till 3,10 för varje brunn i experimentet.

4. Analysera Video Data för att beräkna reologiska egenskaperna hos varje provpunkt

1. Kopiera alla videodata till en mapp analys (eventuellt på en annan dator).
2. Importera bilddata till MATLAB eller annat analysprogram.
   NEJTE: Omfattande dokumentation avseende uppsättning MATLAB partikelspårningsrutiner som antagits här finns på http://people.umass.edu/kilfoil . Användningen av en anpassad anropsfunktionen för att automatisera hanteringen av flera filer vid olika positioner rekommenderas.
3. Kalibrera programvaran genom att analysera flera bildrutor i video till lämpligt fastställa urvals-och avstötnings parametrar (storlek, bandpass, etc) för att identifiera sondcentrumpositioner. Omfattande bakgrund för dessa avgörande steg beskrivs av Crocker och Grier.
4. Använda programvaran för att automatiskt avgöra varje sondläge för alla bildrutor och sedan länka dessa positioner i banor.
5. Använd bana data för att beräkna medelkvadrat deplacement (MSD) som en funktion av fördröjning, att se till att tillämpa lämpliga rumsliga kalibreringsfaktorn (mikrometer per pixel) för den specifika objektiv, varje pixel binning, etc (normalt utförsi meta-data).
6. Beräkna G * (med hjälp av generaliserade Stokes-Einstein relation beaktas gränserna för tillämpligheten av GSER för ett visst prov ^24,28,43. Alternativt kan användarna vill tolka ECM egenskaper direkt från MSD genom att helt enkelt jämföra makt lag skalning, platå värderingar, index för heterogenitet eller andra parametrar.
7. Upprepa steg 4.2 till 4.6 för varje FOV i försöket.
8. Samtidig registrera positionsdata från steg 3,4 med viskoelastiska modulii vid en särskild frekvens av intresse. Beroende på tillverkare av mikroskop som används, kan detta steg underlättas genom en anpassad rutin som läser mikroskop metadata eller positionsdata kan tabelleras manuellt.
9. Använd 3D-interpoleringsfunktioner för att skapa en rumslig reologi karta över ECM.

Representative Results

För att kontrollera giltigheten av G * (ω) mätningar vid lokala positioner inom en komplex modell tumormicroenvironmenten ades två inledande validering experiment. Först sökte vi att validera våra mätningar mot den "gyllene standarden" för bulk oscillerande skjuvning reometri. Vi förberedde identiska prover av kollagenmatrisen (utan celler) i en koncentration av 1,0 mg / ml kollagen. Dessa prover undersöktes med en bulk reometer (TA Instruments AR-G2, med användning av 40 mm parallell plattgeometri) och av PTM (med användning av samma parametrar som i hela detta protokoll), och de resulterande mätningarna av G '(ω) och G "(ω ) jämfördes (figur 2A). Utmärkt överensstämmelse fanns mellan de två mätningarna. För det andra, för att fastställa möjligheten för detta protokoll för att mäta punkt förändringar i ECM reologi vi beredda en 1,0 mg / ml kollagen matrix och inbäddade spår pärlor. Provet behandlades sedan med encentraliserad injektion av 5 pl dispas (Figur 2B), som snabbt smälter kollagen. Efter inkubation i 3 timmar för att tillåta lokal kollagen nedbrytning inträffa, var videodata togs på olika avstånd från injektionsstället, och mätningar av G '(ω) och G "(ω) gjordes i varje enskilt fall. Storleken av G "(ω = 1 rad / sek) befanns vara större än den för G '(ω = 1 rad / sek) vid injektionsstället. Mätt vid ökande avstånd från injektionsstället visade sig ha en ökande magnituden på G *, såväl som ett ökande förhållande av G 'till G "(fig 2C). Storleken på den starkt nedbruten regionen ~ 2 mm är i överensstämmelse med ett beräknat avstånd av diffusion av ett protein med hydrodynamisk radie R _H = 1 nm (molekylvikten för dispas är 32,5 kDa) genom digerekollagen med viskositet η = 10 ^{- 3} Pa-s vid 37 ° C: . Därför resultaten överens med den förväntade uppmjukning av matrisen nära injektionsstället, och visar vår förmåga att göra korrekta, lokaliserade mätningar av matris reologi.

Representativa data från en 3D-tumörmodellen ställdes enligt detta protokoll visas i fig 3. Videodata samlades upp vid 19 fasta lokaliseringar inom kollagenbyggnadsställning, som bildar ett grovt galler kring tumören (figur 3A). Detta koordinatdata kombinerades med beräknade värden för G "(ω) för att skapa en rumslig karta över ECM styvhet (Figur 3B). Denna rumsliga karta visar tydligt en zon med ökad styvhet omedelbart proximalt om tumören sfäroiden på dag 2, som kan korreleras med avsättning av kollagen IV, laminin V end andra basalmembrankomponenter som deponerats av sfäroiddiametern själv ^17,18,44,45 eller lokal kompression av ECM genom den expanderande sfäroid.

Tumörtillväxt och matris invasion händelser övervakades under 4 dagar. Två regioner identifierades som att de antingen inga bevis av invasiva celler vid tumör periferi, eller uttalad bevis av invaderande celler (Figur 3C). PTM mätningar gjordes vid områdena 1 och 2 under 4 dagar. Vid dag 4, var det en signifikant skillnad i G '(rapporterade vid 1 rad / sek) mellan de båda regionerna (figur 3D). Frekvensberoende mätningar av G 'och G "för regionerna 1 och 2 på dag 4 visar betydande uppmjukning av ECM på region 2, den invasiva regionen (figur 3E). På dag 4 region två uppvisar en vätskeliknande viskoelastiska svar, uppenbart genom viskösa skalning av G "plot (figur 3E).

Representative suboptimalResultaten från vanliga experimentella och analys fel visas i Figur 4. Det kanske mest uppenbara felkälla ligger i att stabiliteten hos setup på vilken video mikroskopi utförs. Om labbänken förskjuts eller om det finns någon annan extern vibrationskälla, kan pärla banor vara artificiellt påverkas, vilket resulterar i en drift i data. Drift gör att MSD att öka dramatiskt vid hög fördröjningstider (figur 4A), som också gör att G '(ω) och G "(ω) beräknade värden att öka kraftigt vid låga frekvenser (Figur 4B). Drift kan reduceras med hjälp av en pneumatisk, luft vadde lab bänk, och genom att helt enkelt noga med att inte stöta installationen medan filmer spelas in. Dessutom kan drift tas bort under efterbearbetning med hjälp av mjukvarurutiner. Dessa rutiner är lämpliga för att ta bort avdrift, som är ungefär jämn över en känd tidsintervall. Oregelbunden drift (kanske orsakadgenom att stöta på scenen under datainsamling) är mer problematisk. Därför är det viktigt att se till att urvalet förblir mekaniskt isolerat från omgivningen under datainsamlingen.

En annan potentiell källa till oklara resultat kommer från felaktig tolkning av prov heterogenitet. Även förmågan att observera och kvantifiera rumslig heterogenitet i ett prov är verkligen en av de noterade styrkor av PTM ²⁶ (och något som går förlorat i traditionella bulk reologi mätningar), kan felaktig gruppering av kluster av sond banor leda till felaktiga slutsatser. Med tanke på att förändringar i ECM styvhet som rapporteras av denna metod är i sig heterogena, som är själva materialet, i varje givet synfält, kan det finnas några spår sonder som inte är elastiskt begränsas av kollagenfibrer och därmed fria att stokastiskt utforska större vatten fyllda porer (fig. 4c). Dessa "lösa" sonder uppvisar mobility ungefär i linje med en rent viskös miljö. Eftersom data för alla sonder är i genomsnitt innan viskoelastiska moduler beräknas, med några lösa sonder i ett givet provtagningsområdet (synfält) kan producera frekvensberoende tomter på G * (ω) som varierar vilt (Figur 4D).

Felaktig kalibrering programvara kan leda till fel under videosamling och analys. Under insamlingen av videodata, är det viktigt att observera intensiteten histogram och justera exponeringstiden för att ge den största dynamiska intervallet möjligt och samtidigt säkerställa att bilden inte blir mättad. Analysen beräknar positionerna raffinerad center för varje spårämne sond genom integrering av intensitetsvärdet för varje pixel. Om bilden är mättad, kommer denna integration vara mindre exakt på grund av en "platt topp" delen av intensitetsprofilen. Dessutom är funktionen fynd kalibrering ett extremt kritiskt steg för att säkerställa korrekta resultat. Rätt val av urvalsparametrar är av största vikt. Denna process har beskrivits utförligt av Crocker och Grier ^42, Savin och Doyle ^43, och andra.

Figur 1. Schematisk av Experimentet. (A) Tumör sfäroider bildas på agaros sängar, och sedan överföras till en 3D-matris som innehåller inbäddade spår sonder. (B) Video uppgifterna tas på flera ställen inom provbrunnen, både intill och långt bort från tumören spheroid. (C) Den stokastiska rörelse av sonderna i varje video analyseras för att bestämma de lokala reologiska egenskaperna hos matrisen vid varje provpunkt. Dessa data sammanställs i en rumslig kartläggning av ECM styvhet i hela väl.ad/51302/51302fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Kontroll av Measurements. (A) Komponenterna i G * (ω) är visade här. De beräknade värdena för G '(ω) och G "(ω) med användning PTM är mycket lika de som erhölls via en bulk reometer. (B) 5 pl av dispas sattes till centrum av en brunn med radie r = 8,5 mm, innehållande 1,0 mg / ml kollagen för att mäta rumsliga förändringar i G * (ω). (C) Beräknade värden på G "(ω) och G" (ω) vid platsen för dispas injektion, 1,5 mm från platsen, och 3 mm från platsen. Dessutom var en kontrollmätning gjorts i en brunn som innehåller samma kollagengelen but med ingen dispas behandling. Nära behandlingsstället G '(ω) är mindre än G "(ω). Eftersom gelén samplas längre från behandlingsstället värdena för G '(ω) blir större än G "(ω), och storleken på G * (ω) ökar. Mätningar gjordes 2,5 tim efter dispas injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Kvantifiera förändringar i ECM reologi samtidigt med uppkomsten av lokala matrisinvasion. (A) Brunnen innehöll en PANC-1 3D sfäroid är sonderas på flera platser i hela kollagen ECM omger tumören. (B) Koordinat data kombineras med calculated G '(ω) för varje läge för att producera en rumslig ECM styvhet kartan. (C) tumörtillväxt och invasion beteende övervakades under 4 dagar. Två områden identifierades som att de antingen ingen interaktion med invaderande celler (region 1, blå asterisk) eller tung interaktion med invaderande celler som spontant grenade ut från den stora primära flercelliga spheroid massa (region 2, röd asterisk). (D) Reologiska mätningar gjordes vid regionerna 1 och 2 under 4 dagar. Genom den fjärde dagen, fanns det en signifikant skillnad i G "(redovisas till 1 rad / s) mellan de två regionerna. (E) frekvensberoende mätningar av G '(ω) och G "(ω) för regionerna 1 och 2 på dag 4 visar signifikant mjukning av ECM vid region 2, exakt korrelerade med närvaron av invasiva populationer. G "(ω) och G" (ω) värden som beräknats med hjälp av en ström lag passar att MSD data visas som fyllda och ofyllda punkt respectively. På dag 4, regionens två uppvisar en vätskeliknande viskoelastiska respons vilket framgår av trögflytande skalning av G "(ω) tomt och frånvaron av den anpassade linjen för G '(ω). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4. Uppgifter från suboptimala värden på grund av avdrift och felaktig tolkning av ECM heterogenitet. (A) MSD i en spår sond instängd i ett komplext material följer makt lag skalning <Ar ² (τ)> ~ ^τ α (0 ≤ α ≤ 1). Därför bör MSD värden vända sig till en platå på långa fördröjningstider. Drift i provet kan artificiellt eliminera detta beteende, leading att eskalera MSD värden vid långa fördröjningstider. (B) Den långa fördröjning avdrift i MSD förorsakar värdena för G '(ω) och G "(ω) för att bli väsentligt felaktig vid korta frekvenser. Drift kan elimineras eller reduceras antingen genom att säkerställa att provet är mekaniskt isolerade under datainsamling eller genom att använda mjukvarurutiner för att ta bort drift under analysen. (C) och med i ett litet synfält, kan två olika varianter av sond banor vara närvarande. I detta exempel, de flesta av sonderna är begränsade i matrisen, men några är "lös" - deras banor är mycket mindre begränsad. (D) Att försöka tolka MSD data från både begränsade och obegränsade sonder samtidigt utan korrekt tolkning av prov heterogenitet kommer att förväxla mätningar av viskoelastiska moduler. Please click här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

I detta protokoll introducerar vi en robust och brett tillämpbar strategi för längs spåra lokala förändringar i ECM styvhet i 3D tumörmodeller. Vi ser framför oss att denna metod skulle kunna antas av cancerbiologer och biophysicists intresserade mechanosensitive uppträdande blandas in i matrix remodellering vid tumörtillväxt och invasion processer. Exakt kvantifiering av matrisnedbrytnings kinetiken kan vara särskilt värdefull för de som studerar aktiviteten av matrismetallproteaser, lysyloxidas eller andra relevanta biokemiska arter i 3D tumörmodeller som är direkt kopplade till matris ombyggnad. Bortom ansökan till 3D-tumörmodeller som beskrivs här, kan man vidare tänka sig att genomföra denna strategi tillsammans med andra sjukdomar modellsystem där modifiering av matris reologi tiden spelar viktiga roller ^46,47. Nyttan av denna metod fortsätter att stärkas genom förbättringar av programvara som ytterligare automate processen och möjliggör ökad genomströmning studier. Detta kommer att leda till allt mer detaljerade ögonblicksbilder av det fysiska landskapet i många prover samtidigt, för användning i flerbrunnsformat.

Här specifikt beskriver vi genomförandet av passiv partikelspårnings microrheology i 3D-tumörmodeller, som är väl lämpad för mätning av linjära viskoelastiska respons inom intervallet ~ tiotal Pascal typiska kommersiellt tillgängliga extracellulära matrisprodukter (bovint kollagen, extrakt EHS-tumör eller kommersiella nanofiber byggnadsställningar). Observationen av stokastiska, termiskt driven rörelse, även med hög numerisk apertur optik att kvantifiera små sond förskjutningar, är i sig begränsad till den linjära regimen i dessa relativt mjuka ECM-miljöer, men utredarna önskar att sondera mer styva material kan ha möjlighet att anpassa detta protokoll för användning med aktiva manipulationer via optisk ⁴⁸ eller magnetisk infångning ⁴⁹ av prober. Since de optiska eller magnetiska pincett sond ett ställe inom ett prov och inte påverkar integriteten av provet, kan dessa tekniker eventuellt införlivas i ovannämnda protokoll för att få longitudinella mätningar av styvare prover.

Det är viktigt att konstatera att andra cell genererade krafter också kan bidra till spårsondrörelser vid olika tidsskalor. Till exempel, under cell migrering inträffar under loppet av timmar och dagar i kultur, kluster av sonder kommer att pressas och dras på grund av cellförändringar och det är verkligen denna motion som utnyttjas i dragkraft mikroskopi ^50,51. De termiskt drivna sondrörelser som analyseras för att erhålla microrheology uppgifter ske i storleksordningen sekunder, en klart avgränsad tidsperiod. Även om det är också sant att de långsammare dynamik påfrestningar i samband med dragkrafter kan bidra till lokala förändringar i reologi ^36, en styrka av denna imaging-btatet synsätt ligger i förmågan att korrelera visuella och reologiska förändringar i provet. Till exempel i de representativa resultat i figur 3, en uppenbar matrix invasion och cellmigration händelse är korrelerad med en förändring i G "i nästan fyra storleksordningar under den tid denna migration äger rum.

Protokollet som beskrivs här förutsätter att användarna har tillgång till ett mikroskop med en motoriserad scen som ger reproducerbar positionering av provet. Labs som inte har detta instrument kan fortfarande göra punktmätningar med hjälp av märken eller andra visuella ledtrådar i provet eller provbärare för att möjliggöra upprepade mätningar på samma punkt, även om det troligen skulle vara svårt att uppnå samma reproducerbarhet i positionering som bilden representativa longitudinella mätningar här. Vid tillämpningen av dessa representativa resultat ovan, positionering på z-axeln hölls ungefär konstant. Men protokollet could också ändras för att inkludera ytterligare mätningar längs z-axeln för att skapa en 3D-reologiska karta över provet. Metoden kan även modifieras för att använda en sveplaser konfokala eller en multi tekniker för 3D sektione om skanningshastigheter skulle införa en begränsning på de övre frekvensgränser tillgängliga som kan eller inte kan vara problematiskt för en given tillämpning.

I denna metod används en betydande tid restriktionen av nödvändigheten av att återvända levande celler till inkubatorn. Utan en time-lapse väderstation kapsling att kontrollera för temperatur, luftfuktighet och CO ₂ nivåer, måste bildförvärvstiden minimeras. Även med rätt utrustning, tar datainsamling upp stora mängder tid och digitalt minne, som båda är föremål för praktiska begränsningar. Till exempel med mikroskop och kamera som används i denna studie, skulle det ta ungefär 35 timmar att ta de cirka 4.000 filmer behövs för att kartlägga ett enda bra på en 96-Brunnar med hjälp av en 100X objektiv utan mellanrum synfält. Dessa faktorer införa begränsningar på antalet datapunkter som realistiskt kan samlas in. Detaljnivån är därför föremål för de praktiska begränsningar som tid för datainsamling, datalagringsutrymme och tillgång till en miljö bostäder.

Möjligheten att kvantifiera förändringar i ECM reologi kan ytterligare integreras tillsammans avbildningsbaserade metoder för kvantifiering av terapeutiskt svar i 3D tumörmodeller ^17,18,52,53. Den fler väl 3D-modell kultur system som antagits i båda metoderna tyder på en parallell tillämpning som ger sambandet mellan cytotoxiska respons och modifiering av den mekaniska miljön. Detta kan underlätta utvecklingen av nya strategier som uttryckligen riktar sig mot mekaniska fenotyp eller belyser effekterna av befintliga terapi i denna kapacitet. En sådan insikt kan vara av direkt betydelse för enpproaches att förbättra läkemedelstillförsel genom tät kollagenrika tumor stroma. Till exempel i samband med den representativa illustrationen av detta protokoll presenteras här med in vitro pankreastumörmodeller, utvärdering av matrisnedbrytning följande insatser skulle kunna användas vid screening av stromal utarmning regimer, en allt viktigare terapeutisk paradigm för pankreascancer ^54.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine type 1 collagen	BD Biosciences, San Jose, CA	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres	Life Technologies, Carlsbad, CA	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford, MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	or appropriate cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software	The Mathworks, Natick, MA