Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

Published: June 10, 2014 doi: 10.3791/51302
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Physics, University of Massachusetts Boston
* These authors contributed equally

Summary

Parçacık izleme microrheology olmayan yıkıcı ölçmek ve 3 boyutlu uzamsal tümör modellerinde hücre dışı matris mekanik özelliklerinde değişiklikler eşlemek için kullanılabilir.

Abstract

Mekanik mikro çevre kendisi yenilenmiş ve karmaşık, iki yönlü mechanosensitive etkileşimlerinin bir kümesinin bir parçası olarak modifiye edilir tümör büyümesi davranış ve sinyallemenin önemli bir düzenleyicisi olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Biyolojik ilgili 3D tümör modellerinin geliştirilmesi, tümör büyümesi üzerindeki matris reolojinin etkisi üzerinde mekanik çalışmalar kolaylaştırmış olsa da, tümörlerin yol açtığı mekanik çevre haritalama değişikliklerin ters problem zorlu kalır. Burada, uzunlamasına yerinde, tümör mikro-fiziksel değişiklikleri izlemek için, sağlam ve uygun bir yaklaşım bir parçası olarak pankreas kanseri 3D modelleri ile bağlantılı olarak parçacık izleme microrheology (PTM) 'nin uygulanmasını tarif etmektedir. Burada tarif edilen metodoloji ile, floresanla işaretlenmiş problar muntazam po için dağıtılmış bir model hücre dışı matrisin tip I kollajenin (ECM) iskele gömülü in vitro 3D modeller hazırlamak için bir sistem entegrenoktası pozisyonu ve numune boyunca zamana bağlı microrheology ölçümleri. In vitro tümörler kaplama ve çok-yuvalı plakalar kullanılarak görüntüleme paralel koşullarda sondalandı. Kurulan yöntemleri Çizim, izleyici sonda hareketlerin videoları karmaşık frekans-bağımlı viskoelastik kesme modülü, G * (ω) rapor Genelleştirilmiş Stokes Einstein İlişkisi (GSER) üzerinden dönüşür. Bu yaklaşım, görüntüleme-tabanlı olduğundan, mekanik karakterizasyonu aynı anda 3D tümör boyutu ve fenotip niteliksel değişiklikleri bildirmek için büyük iletilen ışık mekansal alanlar üzerine eşleştirilir. Lokalize işgali kaynaklı matriks bozulması yanı sıra sistem kalibrasyon ile ilişkili alt bölgelerde mekanik tepki zıt gösteren Temsilcisi sonuçları doğrulama verileri sunulmaktadır. Yaygın deneysel hatalar ve bu konularda sorun giderme istenmeyen sonuçları da sunulmuştur. Bu protokol uygulanan 96-kuyu 3D kültür kaplama biçimidir cterapötik tarama deneyleri veya mekanik mikro üzerinde tedaviler veya biyokimyasal uyaranlara etkisini içine yeni anlayışlar kazanmak için moleküler görüntüleme ile microrheology ölçümlerin korelasyon onducive.

Introduction

Bu, kanser hücreleri, habis olmayan memeli epitel hücreleri ile olduğu gibi, çevreleyen hücre dışı matrisin (ECM) ve diğer mikro-ortam bileşenleri 1-9 mekanik ve biyofiziksel özelliklerini son derece duyarlı olduğu literatürde kanıtlar giderek artan bir gövdeden açıktır. Zarif mekanik çalışmalar malign büyüme davranışı ve morfogenetiğine 2,3,10,11 düzenleyen karmaşık bir mechanosensitive sinyal ortağı olarak hücre dışı sertlik rolüne anlayışlar sağladı. Bu çalışma, biyolojik olarak ilgili doku mimarisinin yeniden ayarlanabilir ve mekaniği ile iskele malzeme yetiştirilen ve optik mikroskopi ile görüntülenmiştir 12-19 edilebilir vitro tümör modellerinde 3D ​​geliştirilmesi ile, özellikle kolaylaştırılmıştır. Bununla birlikte, tümör ve sırayla kanser hücrelerinin çevrelerini reolojisini değiştirmek, üzerinden mikro arasında, bu mechanoregulatory iletişim diğer tarafında, bir miktar kalırçalışmak daha zor. Örneğin istilası işlemler sırasında, bir tümörün çevresinde hücreler sırayla arasında mechanosensitive büyüme davranışını etkiler ECM 20-22, yerel olarak bozulmasına neden olduğu mezenkimal geçiş (EMT) epitel geçmesi ve matris metaloproteazların (MMPler) ekspresyonunu artırabilir Diğer yakın tümör hücreleri. Biyokimyasal süreçlerin çeşitli aracılığıyla, kanser hücreleri sürekli olarak farklı zamanlarda farklı süreçleri uygun yukarı ve aşağı çevrelerinin yerel sertliğini çevirin. Burada açıklanan metodoloji 3D tümör modelleri ile entegre ve kültürünü sonlandırma olmadan biyokimyasal ve fenotipik değişiklikler ile uzunlamasına deneþtirilebilir büyümesi sırasında sertlik ve ECM uygun olarak yerel değişiklikleri, rapor analitik araçlar için ihtiyaç tarafından motive edilir.

Bu bağlamda uygulamak için uygun bir teknik arayışı içinde, partikül izleme microrheology (PTM) güçlü bir aday olarak ortaya çıkmaktadır.Bu yöntem, Mason ve Weitz 23,24 ile başlangıçta öncülüğünü, mikron uzunluk ölçeklerinde frekans-bağımlı karmaşık viskoelastik kesme modülü, G * (ω) bildirmek için karmaşık bir sıvı içinde gömülü izleyici sondaları hareketini kullanır. Bu genel yaklaşım, yumuşak yoğunlaştırılmış madde, kolloidler, biyofizik ve polimer fizik 25-31 farklı uygulamalar için uygun çok sayıda varyasyonları ile geliştirilmiştir. Yerel viskoelastisite okumalar kültür hazırlama sırasında dahil büyüme ve uzun süreler boyunca yerinde kalması olan biyokimyasal olarak aktif olmayan tracer sondaların tahribatsız bir video görüntüleme ile sağlanan bu yana PTM, diğer yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Bu, zorunlu olarak kültür sonlandırma gerektirir ve kompleks 3 boyutlu tümör microenvir içinde noktası ölçümleri yerine, numunenin kütle makroskopik reolojiye bildiren bir osilatör kesme yığın reometre, altın standart ölçümlere aksine bironment. Gerçekten de bir takım çalışmalar hücre göçü 32, genişleyen bir sferoit 33, hücre içi Reolojinin 34,35 tarafından oluşturulan mekanik stres ile ilişkili deformasyonlar ölçmek için veya kanser ya da kanser olmayan hücrelerin etrafında izleyici sonda hareketlerinin ölçümleri yorumlama programı resimli, ve var mekanik gerilmeler ve suşları mühendislik dokularının 36, ve gözenek boyutu ve işgali hızı 37 arasındaki ilişkiyi haritasına. Böyle atomik kuvvet mikroskobu (AFM) olarak microrheology uygun diğer teknikler, uygulanabilir, ama öncelikle de numune yüzeyinde puan sondalama ve için uzunlamasına ölçümler 38 zorlaştırıyor kültür kısırlık sorunları oluşturabilecek.

Burada, biz güvenilir mekansal haritalama video partikül izleme ve analiz yöntemleri için gömülü floresan problar ile ECM içine transferi için uygun 3D tümör sferoidlerin büyümesi için yöntemleri içeren kapsamlı bir protokol açıklarkültür içinde zamanla microrheology olarak değişir. Mevcut uygulamada, 3D tümör modelleri bu biçim için elverişli diğer geleneksel deneyler (örneğin, sitotoksisite) ile microrheology ölçümleri dahil sağlayacak bir şekilde çok-yuvalı formatta büyütülür. PANC-1 hücreleri kullanılarak bu yöntem biz kültür in vitro 3D küremsi Bu temsili örnek olarak, sferoidler 39, ancak bu tarifnamede tarif edilen bütün ölçümler oluşturmak için bilinen bir kurulan pankreas kanseri hücre soyu hücre çizgileri, çeşitli kullanılarak katı tümörlerin incelemek için geniş çapta uygulanabilir olduğunu 3D kültür için uygundur. Bu yöntem, doğal görüntüleme bazlı olduğundan bu ideal hücre büyümesi, göç ve fenotip değişiklikleri bildirmek büyük görüş iletilen ışık alanları ile yüksek çözünürlüklü microrheology veri co-kayıt için uygundur. PTM uygulanması mikroskop sahne WH tekrarlanabilir konumlandırma varsayar bu şekilde iletilen ışık mikroskobu ile entegreich motorlu ticari widefield epifluorışıma biyolojik mikroskopları üzerinde genellikle mevcuttur. Aşağıda geliştirilen protokol herhangi bir makul donanımlı otomatik floresan biyolojik mikroskop ile uygulanabilir. Bu çevrimdışı işleme için dijital video mikroskopi gigabayt veri edinimini gerektiren bir doğal veri-yoğun bir yöntemdir.

Aşağıdaki protokolde, Protokol 1 agaroz üzerinde kalıbı kullanılarak burada tarif edilmiştir, fakat bu asılı damla 40 ya da 41 döner kültür teknikleri gibi çeşitli yöntemler ile ikame edilmiş olabilir, tümör küremsiler başlangıç ​​hazırlanması ile ilgilidir. Protokol 2 alternatif olarak, in vitro 3B tümörler, kapsülleme ya da yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler ECM 12,15 gömülmesi de, yerine tek bir önceden oluşturulmuş yapışmayan sferoitler tarafından yetiştirilen edilebilir olsa da, bir kollajen iskele sferoidler gömme işlemi tarif eder. Müteakip protokoller o prosedürleri tarifsırasıyla, Video mikroskopi veri edinme ve işleyerek zaman çözüme microrheology ölçümleri btaining. Veri işleme (bkz. http://www.physics.emory.edu/, MATLAB kullanarak orjinal da yoğun farklı yazılım platformları için geliştirilmiş olan Crocker ve Grier 42, tarafından açıklanan algoritmalar üzerine inşa PTM'sinden açık kaynak rutinleri yararlanarak tarif edilir ~ hafta / Idl /).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Kültürleme Tümör küremsileri

  1. Bir% 1 agaroz çözelti elde etmek için 0.1 g agaroz ile hücre kültürü dereceli su 10 ml karıştırın.
  2. 96 oyuklu bir plaka üzerinde bir kuyuya agaroz çözeltisi 40 ul aliquoting önce 70 ° C'nin üzerinde (standart mikrodalga ya da bir ısıtma plakası kullanılarak yaklaşık 14 saniye) için ısı agaroz çözüm.
  3. Standart teknikler kullanılarak hücreler hasat sırasında en az 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin konsantrasyonunu belirlemek için bir hemasitometre kullanarak.
  5. 1000 hücre / ml hücre süspansiyonu seyreltilir ve de tedavi agaroz yatak içeren, bu seyreltme 100 ul ilave edin.
  6. 37 ° C'de ve% 5 CO2 de ayarlanan bir inkübatör içinde gece boyunca bir karıştırıcıda örnek yerleştirin.
  7. Çalkalayıcı dan bir numune alın ve hücre kültür ortamı içinde 100 ul ilave edin.
  8. İstenen çapı ulaşılana kadar küremsilerin inkübe edin. Örneğin, sonra 9 gün, spheroid çap olarak yaklaşık 450 mikron olacaktır. Bu süre boyunca, taze büyüme ortamı, oyuklara ilave edilebilir, ancak bu, sfero çıkarılmasıyla neden olacaktır çünkü aspirasyon kaçınılmalıdır.

2.. ECM Gömülü 3D Tümör sferoidler hazırlanıyor

  1. Laminar akış içinde gerekli malzemeleri ile bir iş istasyonu hazırlayın.
  2. 25 parça steril su ile 2 kısım stok sondalar (% 2 katı) ekleyerek karboksilat-modifiye 1 mikron çapında floresan probları tracer seyreltilmiş bir karışım hazırlayın.
  3. Buzdolabından 3.1 mg / ml sığır kollajeni bir şişe kaldırma ve buz üzerine yerleştirin.
  4. Kısım 125, boş bir şişe içine 2 ml kolajen ul.
  5. Probları dağıtmak için kısaca kolajen ve vorteks içeren şişeye seyreltilmiş tracer sondası çözeltisinin 50 ul ekle.
  6. Uygun hücre kültür ortamı 41 toplam hacim fenol kırmızı (ki sarı dönecek) içeren 235 ul ekleyinKısaca 205 ml (yarım toplam hacim) kaldırılması ve yeni bir 2 ml'lik cam şişede yerleştirmeden önce 0 ml ve vorteks. Vial 1 tümör sfero içerir ve Vial 2, bir kontrol karışımı olacaktır.
  7. Nötr pH (fenol kırmızısı içeren kültür ortamı kırmızı dönmelidir) geri çözüm getirmek için 1 flakon 1 M NaOH ~ 2 ul ekleyin. Bu karışım, buz üzerinde tutulur değilse kür başlamak neden olacağını not edin. Karıştırmak için vorteks kısaca, sonra hemen buz rafa dönmek.
    NOT: sfero kültür ve agaroz yataktan çıkartılmasını 9 gün sonra hassas bir iştir çıplak gözle zorlukla görülebilir. Diseksiyon mikroskop kullanımı, bazı kullanıcılar için yararlı olabilir. Transfer sırasında sfero bütünlüğünü korumak önemlidir.
  8. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, yavaşça de tümör sfero ihtiva eden ikinci medya 40 ul çıkarın. Sonraki adımı yürütürken bu 40 ul saklayın.
  9. Görmek için kuyu kontrol edin spheroidÖnceki adımda çıkarıldı. Eğer öyle olsaydı, 1 flakon için sfero içeren 40 ul ekleyin. Değilse, geri kuyuya 40 ul yerleştirin ve önceki adımı tekrarlayın.
  10. Yavaşça, 96 oyuklu bir plakanın üç ayrı oyuklarına 60 ul kısımlar halinde karışımın aktarmadan önce (bu küremsi zarar verebilir, vorteks riski yoktur) Vial 1 karıştırın. Iyi küremsi içeren belirlemek için karışımın ilave edildikten sonra bir mikroskop ile de, her kontrol edin.
  11. Ekle ~ 2 ul 1 M NaOH ve 40 Vial 2 hücre kültür ortamı ul ve bir kontrol olarak 96 oyuklu plaka ve etiketleme iyi boş bu karışım 60 ul aliquotting önce girdap.
  12. En az 1 saat boyunca tedavi etmek için bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde plaka koyun.

3.. Örnek Noktalar Izgara Construct ve her noktada bir video atın

  1. Mikroskop sahneye inkübatör örnek plaka aktarın. Numune için 10 dakika Equil izin verısıtılmış bir sahne mevcut değilse, oda sıcaklığı ile ibrate.
  2. Emin sağlam ve görüntüleme için hazır hale getirmek için düşük güçlü objektifler ile örnek gözlemlemek. Kuyunun içindeki tümör konumunu belirler.
  3. Almak için kaç puan örnek karar verin. Tipik olarak, sfero etrafında konsantrik halkalar dağıtılan her kuyuda 20 numune noktaları, yeterince ayrıntılı sonuçlar üretecektir.
  4. Her istenen pozisyona sahne taşımak ve x ve y koordinatları (veya yazılımı arayüzü kullanılamıyor ise rekor elle koordinatları) kaydetmek için mikroskop arayüz yazılımı kullanın.
  5. Yüksek enerjili objektif lens (genellikle 100X) için mikroskop geçin ve izleyici probları uyarma dalga boyu için uygun filtre küpü seçin. Kılavuzdaki ilk noktaya taşımak için adım 3.4 oluşturulan noktaların listesini kullanın.
  6. Kuyunun dibini bulmak için odağı ayarlayın, sonra (FOV) birkaç odakta trac içeren bir görüş alanına bulmak için yukarı taşımaksondalar er.
  7. Yoğunluk histogram gözlemlemek ve görüntü doymuş hale gelmez sağlarken en dinamik aralığı vermek için mümkün maruz kalma yoğunluğu ve zaman ayarlayın.
  8. Kare başına 20-30 msn bir kare hızında video dizisini elde (yaklaşık 800 kare veya uzunluğu 16-24 sn her uzamsal ızgara noktada toplama süresini en aza indirmek için ihtiyacı ile dengeli sağlam MSD hesaplanması için yeterli istatistik sağlamak için tavsiye edilir) ve uygun bir kongre ile kaydedin. Kayıt sırasında, mikroskop veya tabloyu dokunmayın.
  9. Tekrar Kılavuzdaki her numune noktası için 3,6-3,9 adımları.
  10. Tekrar deneyde her bir kuyu için 3,3-3,10 adımları.

4. Her örnek Noktasında Reolojik Properties hesapla Video Veri Analiz

  1. (Belki farklı bir bilgisayarda) bir analiz klasöre tüm video verilerini kopyalayın.
  2. MATLAB içine ithal görüntü verileri ya da diğer analiz yazılımı.
    HAYIRTE: Burada benimsenen MATLAB parçacık izleme rutinleri kümesi ilişkin kapsamlı belgeler mevcuttur http://people.umass.edu/kilfoil . Farklı pozisyonlarda birden fazla dosya işleme otomasyonu için özel bir arama işlevinin kullanılması tavsiye edilir.
  3. Uygun prob merkezi pozisyonları belirlenmesi için seçme ve reddetme parametreleri (boy, bant geçiren, vb) belirlemek için videonun çeşitli karelerini analiz ederek yazılımı kalibre. Bu önemli adımlar için kapsamlı plan Crocker ve Grier tarafından açıklanmıştır.
  4. Otomatik olarak tüm video karelerinin her sonda konumunu belirlemek ve daha sonra yörüngeleri içine bu pozisyonları bağlantı yazılımını kullanın.
  5. Vb özel objektif lens, herhangi bir piksel binning için uygun mekansal kalibrasyon faktörü (piksel başına mikron) uygulamak için emin olmak, gecikme zamanın bir fonksiyonu olarak ortalama kare yer değiştirmesini (MSD) hesaplamak için yörünge verileri kullanarak (genellikle taşınanmeta-veri).
  6. Belirli bir numune 24,28,43 için GSER uygulanabilirlik sınırları. Alternatif olarak, kullanıcıları sadece güç kanunu ölçekleme, plato karşılaştırarak MSD doğrudan ECM özelliklerini yorumlamak isteyebilirsiniz dikkate alınır genelleştirilmiş Stokes-Einstein ilişkisini kullanarak G * (hesaplayın heterojenlik ve diğer parametrelerin değerleri, endeksleri.
  7. Tekrar deneyde her FOV için 4,6 ile 4,2 adım.
  8. Ilgi belirli bir frekansta viskoelastik modül kullanılmasına ile adım 3.4 konum verilerini co-kayıt. Kullanılan mikroskop üreticisine bağlı olarak, bu adım mikroskop meta veya konumunu veri elle tablo olabilir okur özel bir rutin kolaylaştırılabilir.
  9. ECM bir mekansal reolojisi harita oluşturmak için 3D interpolasyon fonksiyonları kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

G * Karmaşık bir modeli tümör mikro içinde lokalize pozisyonlarda (ω) ölçümleri geçerliliğini doğrulamak için, iki ilk doğrulama deneyleri gerçekleştirilmiştir. Öncelikle, biz toplu osilatör kesme reometri "altın standart" karşı ölçümleri doğrulamak için çalıştı. Bu, 1.0 mg / ml kolajen konsantrasyonunda (hücreler olmadan) Kolajen matrisin aynı numuneler hazırlandı. Bu örnekler ("(bu protokol boyunca aynı parametreler kullanılarak) ve G elde edilen ölçümler '(ω) ve G, bir toplu rheometrenin (40 mm paralel levha geometrisinin kullanılması ile TA Instruments AR-G2) ve PTM ile problanmıştır ω ) (Şekil 2A) karşılaştırıldı. Mükemmel anlaşma, iki ölçüm arasında bulunmuştur. İkincisi, biz bir 1.0 mg / ml kollajen matris ve gömülü izleyici boncuk hazırlanan ECM reolojinin noktası değişiklikleri ölçmek için bu protokolün yeteneğini kurmak. Numune daha sonra bir ile işlendihızla kolajen sindirir 5 ul dispase (Şekil 2B), merkezi enjeksiyonu. Lokalize kollajen sindirim oluşmasına izin vermek için 3 saat için inkübe edildikten sonra ", video veri enjeksiyon yerinde farklı mesafelerde alındı ​​ve G ölçümleri '(ω) ve G (ω) her durumda yapılmıştır. G'nin büyüklüğü "(ω = 1 rad / sn) enjeksiyon bölgesinde (ω = 1 rad / sn) G 'daha fazla olduğu bulunmuştur. Enjeksiyon yerinde artan mesafelerde alınan ölçümler G * artan büyüklüğü, hem de G G artan oran "'(Şekil 2C) sahip oldukları bulunmuştur. Yaklaşık 2 mm yüksek bozulmuş bölgenin büyüklüğü η = 10 viskozitesi ile sindirilmiş kollajen ile hidrodinamik çapı R = H 1 nm ile bir proteinin yayılma tahmini mesafe (dispase moleküler ağırlığı 32.5 kDa'dır) ile tutarlıdır - · 3 Pa, 37 ° C'de sec: . Bu nedenle sonuçlar enjeksiyon yerinin yakınında matris beklenen yumuşama katılıyorum, ve matris reolojinin doğru, lokalize ölçümler yapmak için yeteneğini göstermek.

Bu protokole uygun olarak hazırlanmış bir 3 boyutlu bir tümör modelinden Örnek Kat. Video veri tümör çevresindeki kaba bir kılavuz (Şekil 3A) oluşturulması, kolajen iskele içinde 19 sabit konumlarda toplandı, Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu koordinat verileri ECM sertlik (Şekil 3B) bir mekansal harita oluşturmak için G hesaplanan değerler '(ω) ile kombine edilmiştir. Bu, açık bir şekilde uzamsal harita kolajen IV, laminin v çökelmesi ile ilişkili olabilir 2. günde tümör sfero, hemen yakın artan sertliğe sahip bir bölge ortaya koymaktadırd başka bazal membran bileşenleri, sfero kendisi 17,18,44,45 ya da genişleyen sfero tarafından ECM'nin yerel sıkıştırma tarafından tevdi.

Tümör büyümesi ve matris istila Olayları 4 gün boyunca izlenmiştir. İki bölgeler herhangi bir tümörün çevresinde invaziv hücre kanıt veya hücreleri (Şekil 3C) istila belirgin kanıt ya sahip olarak tanımlandı. PTM ölçümleri bölgeler 1 ve 2 üzerinde 4 gün sonra alınmıştır. 4. günde, iki bölge (Şekil 3B) arasında (1 rad / sn 'de bildirilmiştir) G önemli bir fark' oldu. Bölgesi 2, invaziv bölgede bulundu (Şekil 3E) da ECM'nin gün 4 göstermek önemli yumuşatılması üzerinde bölgeler 1 ve 2 için, G 've G "frekans bağımlı ölçümleri. 4. gün bölgeye iki sergiler G "arsa (Şekil 3E) viskoz pullanma ile belirgin bir sıvı gibi viskoelastik yanıtını.

Sub-optimal TemsilcisiOrtak deneysel hatalar ve analiz sonuçları Şekil 4'te gösterilmiştir. belki de hatanın en belirgin kaynak video mikroskobu gerçekleştirilir üzerinde kurulum stabilitesine yatmaktadır. Laboratuar tezgah yerinden ya da titreşim başka bir dış kaynağı varsa, boncuk yörüngeleri yapay verilerin bir sürüklenme ile sonuçlanan, etkilenebilir edin. Drift MSD yüksek gecikme zamanlarda önemli ölçüde de 'G neden olur (Şekil 4A) (ω) artırmak ve G "(ω) hesaplanan değerleri düşük frekanslarda (Şekil 4B) de keskin artmasına neden olmaktadır. Drift bir pnömatik, hava yastıklı laboratuar tezgah kullanımı ile azaltılabilir ve sadece video kayıt edilirken kurulum çarpmayın dikkat alarak olabilir. Ayrıca, drift yazılım rutinleri kullanarak sonrası işleme sırasında kaldırılmış olabilir. Bu yordamlar yaklaşık olarak bilinen bir zaman aralığı üzerinde muntazam olduğu sürüklenme çıkarılması için uygundur. Düzensiz sürüklenme (belki de neden oldu) veri alımı sırasında sahne darbeleme tarafından daha problemlidir. Bu nedenle örnek veri toplama sırasında çevreden mekanik izole kalır emin olmak önemlidir.

Belirsiz sonuçların başka potansiyel kaynak örnek heterojen yanlış yorumundan geliyor. Bir numunede mekansal heterojenite gözlemlemek ve ölçmek için kabiliyeti gerçekten PTM'sinden 26 (geleneksel toplu rheolojisi ölçümlerinde kaybolur ve bir şey) ve not güçlerinden biri olmasına rağmen, prob yörüngeleri kümeleri yanlış gruplama yanlış sonuçlara yol açabilir. Malzemenin kendisi görüş herhangi bir alanda olduğu gibi bu metodoloji tarafından bildirilen ECM sertlik değişiklikler, doğal olarak heterojen olduğu göz önüne alındığında, elastik kolajen lifleri tarafından sınırlı ve davranışsal büyük su keşfetmek dolayısıyla özgür olmayan bir kaç izleyici sondaları orada olabilir gözenekler (Şekil 4C) dolgulu. Bu "gevşek" sondalar sergi mobility saf viskoz ortamı ile yaklaşık tutarlı. Bütün problar için veriler ortalama kabul edilir yana viskoelastik modül hesaplanmıştır önce, belirli bir numune alma bölgede birkaç gevşek sondalar (bakış alanı) sahip olan (Şekil 4D) çok fazla değişiklik gösterir G * (ω) frekans bağımlı araziler üretebilir.

Yanlış yazılım kalibrasyon video toplama ve analizi sırasında hatalara yol açabilir. Video, veri toplama sırasında, yoğunluk histogram gözlemlemek ve görüntü doymuş hale gelmez sağlarken en dinamik aralığı vermek için mümkün pozlama süresini ayarlamak için önemlidir. Analizi, her pikselin yoğunluk değerini bütünleştirerek her izleyici prob için rafine merkezi pozisyonları hesaplar. Görüntü doymuş ise, bu entegrasyon nedeniyle yoğunluk profilinin bir 'düz üst' bölümüne daha doğru olacaktır. Ayrıca, özellik bulgu kalibrasyon doğru sonuçlar sağlanması son derece önemli bir adımdır. Seçim parametreleri uygun seçim önemlidir. Bu işlem Crocker ve Grier 42, Savin Doyle ve 43, ve diğerleri tarafından yaygın olarak tarif edilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1.. Deneysel Prosedür şematik. (A) Tümör küremsiler agaroz yatak üzerinde oluşan ve daha sonra gömülü izleyici sondalar içeren bir 3B matriks içine aktarılır. (B) video verileri uzak tümör sfero gelen bitişik ve hem de numune içindeki çeşitli noktalarda alınır. (C) Her bir video sondaların stokastik hareketi her bir numune noktasında matrisin yerel reolojik özelliklerini belirlemek için analiz edilir. Bu veriler kuyunun boyunca ECM sertlik mekansal haritalama derlenmiş.ad/51302/51302fig1highres.jpg "target =" _blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Ölçümler Şekil 2.. Doğrulama. (A) G * (ω) ve bileşenleri burada gösterilmektedir. PTM kullanılarak G'nin hesaplanan değerler '(ω) ve G "(ω) bir kütle reometre ile elde edilenlere benzer. (B) dispase 5 ul G * (ω) mekansal değişiklikleri ölçmek için, 1.0 mg / ml kolajen ihtiva eden yarı çapı r = 8.5 mm olan bir iyi merkezine ilave edildi. Dispase enjeksiyon sitesinde, siteden 1.5 mm ve siteden 3 mm (C) Hesaplanan G değerleri '(ω) ve G "(ω). Buna ek olarak, bir kontrol ölçümü aynı kollajen jel b içeren bir kuyu içinde yapıldıHiçbir dispase tedavi ile ut. Tedavi sitesi G '(ω) (ω) "G küçüktür civarında. Jel (ω) (ω) "G daha büyük hale tedavi sitenin G değerleri 'den fazla örneklenmiş ve G * büyüklüğü (ω) artar gibi. Ölçümler dispase enjeksiyondan sonra 2.5 saat alındı. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3,. Yerel matris istilasının başlangıcı ile ECM reoloji eşlik eden değişiklikler nicel. (A) İyi bir PANC-1 3B sfero ihtiva tümörü çevreleyen kollajen ECM içinde birden fazla noktada incelenir. (B) koordinat verileri c ile birleştiriliralculated G '(ω) her konum için bir mekansal ECM katılık haritası üretmek. (C) Tümör büyümesi, istilası ve davranış, 4 gün boyunca izlenmiştir. İki bölgeler hiçbir işgalci hücreleri ile etkileşimi (bölge 1, mavi yıldız) ya da kendiliğinden büyük birincil hücreli küremsi kütlesi (bölge 2, kırmızı yıldızla) dışarı dallı hücreleri istila ile ağır etkileşim ya sahip olarak tespit edilmiştir. (D) Reoloji ölçümleri bölgeler 1 ve 2 üzerinde 4 gün sonra alınmıştır. Dördüncü gün, iki bölge arasında (1 rad / sn yok) G önemli bir fark 'oldu. Tam invaziv nüfusu varlığı ile ilişkili bölge 2 de ECM, günlük 4 göstermek önemli yumuşatılması üzerinde bölgeler 1 ve 2 için (E) frekans bağımlı G ölçümleri '(ω) ve G "(ω). G '(ω) ve doldurulmuş ve nokta res doldurulmamış olarak G "MSD verilere bir güç kanunu uyum kullanılarak hesaplanır (ω) değerleri gösterilmiştirpectively. 4. gün, bölge iki sergiler gibi bir sıvı gibi viskoelastik tepki G "(ω) arsa ve G için uygun hat '(ω) yokluğu viskoz ölçeklendirme ile açıktır. daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakam.

Şekil 4,
Şekil 4. Veri kayması nedeniyle ve ECM heterojen yanlış yorumlanması alt-optimal sonuçları. (A) kompleks bir malzeme sınırlı bir izleyici prob MSD ~ τ α (güç hukuk ölçekleme <Ír 2 (τ)> izler 0 ≤ α ≤ 1). Buna göre, MSD değerleri uzun lag kez bir plato yaklaşım gerekir. Örnekteki Drift yapay bu davranış, l ortadan kaldırabilirUzun gecikme zamanlarda MSD değerleri tırmanan eading. (B) MSD uzun gecikme süresi sürüklenme 'G değerlerini neden olacaktır (ω) ve G "(ω) kısa frekanslarda anlamlı hatalı olmak. Drift örnek mekanik olarak, veri toplama sırasında izole edilir sağlayarak ya da analiz sırasında kaymasını ortadan kaldırmak için yazılım rutinleri kullanarak ya da ortadan kaldırılabilir veya azaltılabilir. (C) bile görüş küçük bir alanda, prob yörüngeleri iki ayrı çeşidi mevcut olabilir. Bu örnekte, problar en matris içinde tutulmuştur, fakat bir kaç "gevşek" in - kendi yörüngeleri daha az kısıtlanır. (D) hem de kısıtlı ve örnek heterojen uygun yorumlanması olmadan aynı anda kısıtsız sondalar viskoelastik modülünün ölçümleri bulandırabilir gelen MSD verileri yorumlamak için çalışılıyor. Lütfen cliBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya ck.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolde boylamasına 3D tümör modelleri ECM katılık yerel değişiklikleri izleme için güçlü ve yaygın olarak uygulanabilir bir strateji tanıtmak. Bu metodoloji, tümör büyümesi ve işgali süreçlerinde matris yeniden karıştığı mechanosensitive davranış ilgilenen kanser biyologlar ve fizikçinin tarafından kabul edilebileceğini öngörülüyor. Matris bozulması kinetiği kesin miktar, doğrudan matris yeniden bağlantılıdır 3B tümör modellerinde matris metaloproteazların, lisil oksidaz ya da diğer ilgili biyokimyasal tür aktivitesini incelemek olanlar için özellikle önemli olabilir. 3D tümör modelleri uygulama burada açıklanan ötesinde, bir başka zamanla matris reolojinin modifikasyonu önemli rol 46,47 oynadığı diğer hastalık modeli sistemleri ile birlikte bu yaklaşımın uygulanmasını düşünebiliriz. Bu yöntemin program yazılımı iyileştirmeler yoluyla geliştirilmiş devam ettiğini ileri otomatişlem e ve artan verimlilik çalışmaları için izin verir. Bu çok-çukurlu formatta kullanım için aynı anda birçok örneklerin fiziksel manzara, gittikçe daha ayrıntılı anlık neden olur.

Burada özellikle aralığında lineer viskoelastik tepkisinin ölçümü için uygundur 3D tümör modellerinde pasif parçacık izleme microrheology, uygulanmasını tarif etmektedir ticari olarak temin edilebilen hücre dışı matris ürün (bovin kolajen, EHS-tümör ekstreler tipik Pascal onlarca veya ticari nanofiber iskelelerinin). Rassal gözlem, küçük bir prob deplasmanlar ölçmek için bile yüksek sayısal açıklık optik ile termal tahrikli hareket, doğal olarak bu nispeten yumuşak ECM ortamlarda doğrusal rejimine sınırlıdır, ancak daha sert malzemeleri soruşturma isteyen araştırmacılar, bu protokolü adapte olabilir prob 48, optik veya manyetik sıkışması 49 üzerinden aktif manipülasyonlar ile kullanım için. Basınçe, optik ya da manyetik cımbız bir numune içinde tek nokta sonda ve numunenin bütünlüğünü etkilemez, bu teknikler, büyük olasılıkla daha bükülmez numune uzunlamasına ölçümler elde etmek için yukarıdaki protokole dahil edilebilir.

Diğer hücre oluşturulur güçler de çeşitli zaman ölçeklerinde tracer prob hareketlere katkıda bulunduğunu gözlemlemek önemlidir. Örneğin, saat ve kültür gün boyunca oluşan hücre göçü sırasında, probların kümeleri itti ve çekti nedeniyle hücre hareketleri ve gerçekten çekiş kuvveti mikroskobu 50,51 kullanılmaktadır bu hareket edilecektir. Microrheology veri elde etmek için analiz edilir termal tahrik prob hareketleri saniye, açıkça ayrılabilir zaman ölçek sipariş üzerine gerçekleşecek. Bu çekiş güçleri ile ilişkili stresleri ve suşları yavaş dinamikleri reolojisine 36, bu görüntüleme-b bir gücü yerel değişikliklere katkıda bulunabilir olduğu da doğrudur ikenased yaklaşım örneğinde görsel ve reolojik değişiklikleri ilişkilendirmek için yatmaktadır. Açık bir matris istilası ve hücre göçü olay, bu geçiş gerçekleşir süre boyunca büyüklükte yaklaşık dört siparişleri G bir değişiklik "ile ilişkili olan Şekil 3 'de temsili sonuçlarda Örneğin,.

Burada açıklanan protokol kullanıcıların numunenin yeniden üretilebilir konumlandırma sağlayan bir motorlu tabla ile mikroskop erişim hakkına sahip olduğunu varsayar. Gösterildiği gibi, büyük olasılıkla konumlandırma aynı tekrarlanabilirliği elde etmek zor olurdu ama bu aletleri yok Labs hala aynı noktada tekrarlanan ölçümler sağlamak için örnek veya numune taşıyıcı işaretleri veya diğer görsel ipuçlarını kullanarak nokta ölçümleri yapabilir Burada temsili boyuna ölçümleri. Z-ekseni üzerinde konumlandırılması bu yukarıda Örnek sonuçların amaçları, yaklaşık olarak sabit tutulmuştur için. Bununla birlikte, protokol could de örnek bir 3D reolojik harita oluşturmak için z ekseni boyunca ek ölçümler içerecek şekilde tadil edilebilir. Yöntem aynı zamanda bir tarayıcı lazer konfokal veya tarama hızları veya belirli bir uygulama için sorunlu olmayabilir erişilebilir üst frekans limitleri üzerinde bir sınırlama empoze edecek olsa kesit 3D için bir multiphoton teknikleri kullanmak için modifiye edilebilir.

Bu yöntemde, önemli bir zaman kısıtlaması inkübatör, canlı hücreleri dönen gerekliliği ile uygulanmaktadır. Sıcaklık, nem, ve CO 2 düzeyleri kontrol etmek için bir time-lapse hava istasyonu muhafaza olmadan, görüntü elde etme zamanı minimize edilmelidir. Hatta uygun ekipman ile, veri toplama hem pratik sınırlamalara tabi olan zaman ve dijital bellek büyük miktarda alır. Örneğin, mikroskop ve bu çalışmada kullanılan kamera ile, bir 96 üzerinde bir tek kuyu eşleştirmek için gerekli kabaca 4.000 video çekmek için yaklaşık 35 saat alacağını-Iyi görünüm alanları arasında hiçbir boşluk bir 100X objektif lens kullanarak plakası. Bu faktörler gerçekçi toplanabilecek veri noktalarının sayısına kısıtlamalar empoze. Detay seviyesi, veri toplama, veri depolama alanı ve çevre konut kullanılabilirliği için mevcut zaman dayattığı pratik sınırlamaları nedenle tabidir.

ECM reoloji değişiklikleri ölçmek için yeteneği ayrıca 3D tümör modellerinde 17,18,52,53 terapötik yanıtın ölçülmesi için görüntü-bazlı yöntemler ile birlikte entegre edilebilir. Her iki yöntem de kabul multi-iyi 3D model kültür sistemi sitotoksik yanıt ve mekanik çevre değiştirilmesi arasındaki irtibatı sağlayan paralel bir uygulama önerir. Bu açıkça mekanik fenotip hedef ya da bu kapasite mevcut tedavilerin etkisini aydınlatmak daha stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir. Böyle bir anlayış, bir doğrudan alakalı olabiliryoğun kolajen zengin tümör stromasında yoluyla ilaç verilmesini geliştirmek için pproaches. Örneğin, bu protokol temsilcisi örnek bağlamında stromal müdahaleler tükenmesi rejimleri, pankreas kanseri 54 için giderek daha önemli terapötik bir paradigma taranmasında kullanılabilir sonra, in vitro modellerde tümör pankreas burada matris bozunmasının değerlendirilmesini sundu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz minnetle (Maria Kilfoil tarafından sağlanan MATLAB partikül izleme kodu açık kaynak paylaşımını kabul http://people.umass.edu/kilfoil/ ), John C. Crocker ve Eric tarafından sağlanan erken IDL kodu ve kapsamlı belgeler ile birlikte R. Weeks. Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI / NIH), K99CA155045 ve R00CA155045 (: JPC PI) fon tarafından mümkün olmuştur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine type 1 collagen BD Biosciences, San Jose, CA 354231
PANC-1 American Type Cell Culture, Manassas, VA CRL1469 or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres Life Technologies, Carlsbad, CA 906906
Matrigel BD Biosciences, Bedford, MA 354230
Agarose Fisher Bioreagents, Waltham, MA C12H18O9
NaOH Fisher Bioreagents, Waltham, MA NC0480985
96-well Imaging plates Corning Inc., Corning, NY 3904
DMEM Hyclone, Waltham, MA SH30243.01 or appropriate cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software The Mathworks, Natick, MA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer metastasis reviews. 28, 113-127 (2009).
  3. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  4. Bershadsky, A. D., Balaban, N. Q., Geiger, B. Adhesion-dependent cell mechanosensitivity. Annual review of cell and developmental biology. 19, 677-695 (2003).
  5. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474, 179-183 (2011).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Prog Biophys Mol Biol. 97, 163-179 (2008).
  7. Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function. Cell Biochem Biophys. 47, 300-320 (2007).
  8. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116, 2377-2388 (2003).
  9. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).
  10. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nat Rev Cancer. 9, 108-122 (2009).
  11. Assoian, R. K., Klein, E. A. Growth control by intracellular tension and extracellular stiffness. Trends Cell Biol. 18, 347-352 (2008).
  12. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4, 359-365 (2007).
  13. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature reviews. Cancer. 5, 675-688 (2005).
  14. Ulrich, T. A., Jain, A., Tanner, K., MacKay, J. L., Kumar, S. Probing cellular mechanobiology in three-dimensional culture with collagen-agarose matrices. Biomaterials. 31, 1875-1884 (2010).
  15. Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix encapsulation of cancer cells. J. Vis. Exp. (34), e1692 (2009).
  16. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  17. Celli, J. P., Rizvi, I., Evans, C. L., Abu-Yousif, A. O., Hasan, T. Quantitative imaging reveals heterogeneous growth dynamics and treatment-dependent residual tumor distributions in a three-dimensional ovarian cancer model. J Biomed Opt. 15, 051603-051610 (2010).
  18. Rizvi, I., et al. Synergistic Enhancement of Carboplatin Efficacy with Photodynamic Therapy in a Three-Dimensional Model for Micrometastatic Ovarian Cancer. Cancer Res. 70, 9319-9328 (2010).
  19. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels. J. Vis. Exp. (42), e2089 (2010).
  20. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell Cycle. 8, (2009).
  21. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Mason, T. G., Weitz, D. A. Optical Measurements of Frequency-Dependent Linear Viscoelastic Moduli of Complex Fluids. Physical Review Letters. 74, 1250 (1995).
  24. Mason, T. G., Ganesan, K., van Zanten, J. H., Wirtz, D., Kuo, S. C. Particle Tracking Microrheology of Complex Fluids. Physical Review Letters. 79, 3282-3285 (1997).
  25. Crocker, J. C., et al. Two-Point Microrheology of Inhomogeneous Soft Materials. Physical Review Letters. 85, 888 (2000).
  26. Valentine, M. T., et al. Investigating the microenvironments of inhomogeneous soft materials with multiple particle tracking. Physical Review E. 64, 061506 (2001).
  27. Helfer, E., et al. Microrheology of Biopolymer-Membrane Complexes. Physical Review Letters. 85, 457 (2000).
  28. Levine, A. J., Lubensky, T. C. One- and Two-Particle Microrheology. Physical Review Letters. 85, 1774 (2000).
  29. Jonas, M., Huang, H., Kamm, R. D., So, P. T. Fast fluorescence laser tracking microrheometry, II: quantitative studies of cytoskeletal mechanotransduction. Biophys J. 95, 895-909 (2008).
  30. Celli, J., et al. Viscoelastic properties and dynamics of porcine gastric mucin. Biomacromolecules. 6, 1329-1333 (2005).
  31. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Phys Rev Lett. 102, 188303 (2009).
  32. Bloom, R. J., George, J. P., Celedon, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Mapping local matrix remodeling induced by a migrating tumor cell using three-dimensional multiple-particle tracking. Biophys J. 95, 4077-4088 (2008).
  33. Gordon, V. D., et al. Measuring the mechanical stress induced by an expanding multicellular tumor system: a case study. Exp Cell Res. 289, 58-66 (2003).
  34. Li, Y., Schnekenburger, J., Duits, M. H. Intracellular particle tracking as a tool for tumor cell characterization. J Biomed Opt. 14, 064005 (2009).
  35. Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical Mapping of Live Cells by Multiple-Particle-Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 83, 3162-3176 (2002).
  36. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of Mechanical Strains and Stresses around Quiescent Engineered Three-Dimensional Epithelial Tissues. Biophysical Journal. 103, 152-162 (2012).
  37. Yang, Y. L., Motte, S., Kaufman, L. J. Pore size variable type I collagen gels and their interaction with glioma cells. Biomaterials. 31, 5678-5688 (2010).
  38. Ludwig, T., Kirmse, R., Poole, K., Schwarz, U. S. Probing cellular microenvironments and tissue remodeling by atomic force microscopy. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 456, 29-49 (2008).
  39. Sipos, B., et al. A comprehensive characterization of pancreatic ductal carcinoma cell lines: towards the establishment of an in vitro research platform. Virchows Archiv : an international journal of pathology. 442, 444-452 (2003).
  40. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
  41. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
  42. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).
  43. Savin, T., Doyle, P. S. Static and Dynamic Errors in Particle Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 88, 623-638 (2005).
  44. Evans, C. L., et al. Killing hypoxic cell populations in a 3D tumor model with EtNBS-PDT. PLoS ONE. 6, e23434 (2011).
  45. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
  46. Celli, J. P., et al. Helicobacter pylori moves through mucus by reducing mucin viscoelasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 14321-14326 (2009).
  47. Bansil, R., Celli, J. P., Hardcastle, J. M., Turner, B. S. The Influence of Mucus Microstructure and Rheology in Helicobacter pylori Infection. Frontiers in immunology. 4, 310 (2013).
  48. Furst, E. M. Applications of laser tweezers in complex fluid rheology. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 10, 79-86 (2005).
  49. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic Tweezers: Micromanipulation and Force Measurement at the Molecular Level. Biophysical Journal. 82, 3314-3329 (2002).
  50. Dembo, M., Wang, Y. -L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76, 2307-2316 (1999).
  51. Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: a new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLoS ONE. 6, e17833 (2011).
  52. Celli, J. P., Petrovic, L., Massdodi, I., Rizvi, I., Hasan, T. Overcoming therapeutic resistance in pancreatic cancer is not a simple mix of PDT and chemotherapy: Evaluation of PDT-chemotherapy combinations in 3D tumor models. Proc SPIE. , 85680R-85680R (2013).
  53. Glidden, M. D., et al. Image-Based Quantification of Benzoporphyrin Derivative Uptake, Localization, and Photobleaching in 3D Tumor Models, for Optimization of PDT Parameters. Theranostics. 2, 827-839 (2012).
  54. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Scientific reports. 4, 3751-3710 (2014).
  55. Celli, J. P. Stromal interactions as regulators of tumor growth and therapeutic response: A potential target for photodynamic therapy. Israel journal of chemistry. 52, 757-766 (2012).
  56. Garber, K. Stromal depletion goes on trial in pancreatic cancer. J Natl Cancer Inst. 102, 448-450 (2010).

Tags

Biyomühendislik Sayı 88 viskoelastisite mechanobiology hücre dışı matriks (ECM) matriks yeniden 3D tümör modelleri tümör mikro stroma matriks metaloproteaz (MMP) epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT)
Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, D. P., Hanna, W., El-Hamidi,… More

Jones, D. P., Hanna, W., El-Hamidi, H., Celli, J. P. Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology. J. Vis. Exp. (88), e51302, doi:10.3791/51302 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter