Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

Published: June 10, 2014 doi: 10.3791/51302
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Physics, University of Massachusetts Boston
* These authors contributed equally

Summary

Microrheology-particella di monitoraggio può essere utilizzato per non distruttivo quantificare e spazialmente mappare i cambiamenti nella matrice extracellulare proprietà meccaniche in modelli tumorali 3D.

Abstract

Il microambiente meccanico ha dimostrato di agire come un regolatore cruciale del comportamento di crescita tumorale e di segnalazione, che è a sua rinnovato e modificato come parte di una serie di complesse interazioni bidirezionale mechanosensitive. Mentre lo sviluppo di biologicamente rilevanti modelli tumorali 3D hanno facilitato studi meccanicistici sull'impatto della reologia matrice sulla crescita del tumore, il problema inverso dei cambiamenti di mappatura dell'ambiente meccanica indotta da tumori rimane difficile. Qui, descriviamo l'attuazione di particella inseguimento microrheology (PTM) in combinazione con i modelli 3D di cancro pancreatico come parte di un approccio efficaci e validi per monitorare longitudinalmente cambiamenti fisici nel microambiente tumorale, in situ. La metodologia qui descritta integra un sistema di preparazione di modelli in vitro 3D incorporato in un modello di matrice extracellulare (ECM) scaffold di collagene di tipo I con sonde fluorescente distribuiti uniformemente per Po-zione e tempo-dipendenti misurazioni microrheology in tutto il campione. tumori in vitro sono placcati e sondate in condizioni parallele utilizzando lastrine pozzetti. Basandosi su metodi stabiliti, i video dei movimenti della sonda traccianti vengono trasformati tramite il Relation Generalized Stokes Einstein (GSER) per segnalare il complesso dipendente dalla frequenza viscoelastica modulo di taglio, G * (ω). Poiché questo approccio è l'imaging-based, caratterizzazione meccanica è anche mappato su grandi campi spazio-luce trasmessa per segnalare contemporaneamente i cambiamenti qualitativi in ​​termini di dimensioni e fenotipo tumorale 3D. Risultati rappresentativi mostrano contrastanti risposta meccanica in sottoregioni associati localizzata degradazione della matrice invasione indotta e calibrazione del sistema, dati di convalida sono presentati. Esiti indesiderati da errori sperimentali comuni e la risoluzione dei problemi di questi problemi sono anche presentati. Il formato da 96 pozzetti placcatura cultura 3D realizzato in questo protocollo è conducive alla correlazione delle misure microrheology con test di screening terapeutici o imaging molecolare per acquisire nuove intuizioni impatto dei trattamenti o stimoli biochimici sul microambiente meccanico.

Introduction

E 'chiaro da una crescente evidenza nella letteratura che le cellule tumorali, come con le cellule epiteliali di mammifero non maligne, sono molto sensibili alle proprietà meccaniche e biofisiche della matrice extracellulare circostante (ECM) e altri componenti del microambiente 1-9. Studi meccanicistici eleganti hanno fornito informazioni sul ruolo di rigidità extracellulare come partner segnalazione meccanosensibili complesso che regola il comportamento crescita maligna e la morfogenesi 2,3,10,11. Questo lavoro è stato facilitato in particolare dallo sviluppo del 3D in modelli tumorali in vitro che ripristinano biologicamente architettura dei tessuti rilevante e possono essere coltivate in materiali impalcatura con la meccanica accordabili e ripreso da microscopia ottica 12-19. Tuttavia, l'altro lato di questa finestra mechanoregulatory tra tumore e microambiente, attraverso il quale le cellule tumorali a sua volta modificare la reologia del loro ambiente, rimane alquantopiù difficile da studiare. Ad esempio, durante i processi di invasione, cellule alla periferia di un tumore possono subire la transizione epitelio mesenchimale (EMT) e aumentare l'espressione delle metalloproteasi della matrice (MMPs) che causano degradazione locale di ECM 20-22, che a sua volta influenza il comportamento di crescita di meccanosensibili altre cellule tumorali prossimali. Attraverso una serie di processi biochimici, cellule tumorali continuamente comporre la rigidità locale del loro ambiente su e giù secondo processi differenti in momenti diversi. La metodologia qui descritta è motivata dalla necessità di strumenti analitici che segnalano variazioni locali nella rigidità e la conformità della ECM durante la crescita, che possono essere integrati con i modelli tumorali in 3D e correlati longitudinalmente con i cambiamenti biochimici e fenotipiche senza terminare la cultura.

Alla ricerca di una tecnica appropriata per l'attuazione in questo contesto, microrheology particella-tracking (PTM) emerge come un candidato forte.Questo metodo, sperimentato originariamente da Mason e Weitz 23,24, utilizza il movimento delle sonde traccianti incorporati in un fluido complesso per segnalare il modulo complesso dipendente dalla frequenza viscoelastico taglio, G * (ω) su scale micron. Questo approccio generale è stato sviluppato con diverse variazioni adatti per diverse applicazioni in morbidi Materia Condensata, colloidi, biofisica e fisica dei polimeri 25-31. PTM presenta alcuni vantaggi rispetto ad altri metodi, poiché letture di viscoelasticità locale sono ottenute dalla non distruttiva immagini video di sonde traccianti biochimicamente inattivi che sono incorporati al momento della preparazione cultura e rimangono sul posto per periodi prolungati di crescita. Questo è in contrasto con misure standard oro con un taglio oscillante rinfusa reometro, che richiede necessariamente la cessazione della cultura e riporta la reologia macroscopico massa del campione piuttosto che misurazioni di punti all'interno del complesso microenvir tumore 3Dbiente. Infatti numerosi studi hanno dimostrato l'utilità di interpretazione delle misure di movimenti sonda tracciante ao vicino cellule tumorali o non tumorali per misurare deformazioni associati migrazione cellulare 32, stress meccanico indotto da uno sferoide espansione 33, reologia intracellulare 34,35, e per mappare sollecitazioni meccaniche nei tessuti ingegnerizzati 36, e della relazione tra dimensione dei pori e la velocità dell'invasione 37. Altre tecniche adatte per microrheology, quali microscopia a forza atomica (AFM) possono essere realizzate, ma soprattutto per sondare punti alla superficie del campione, oppure possono rappresentare coltura problemi di sterilità che complicano misurazioni longitudinali 38.

Qui, descriviamo un protocollo completo che comprende metodi per la crescita di sferoidi tumorali 3D adatti per il trasferimento in ECM con sonde fluorescenti embedded per il video di particelle di tracciamento e di analisi per la mappatura attendibile spazialecambiamenti nella microrheology nel tempo nella cultura. Nel presente di attuazione, modelli tumorali 3D sono coltivate in formato più pozzetti con vista verso l'incorporazione di misure microrheology con altri metodi tradizionali (ad esempio, citotossicità), che questo formato è favorevole al. In questa illustrazione rappresentativo di questa metodologia che coltura in vitro sferoidi 3D in Uso PANC-1 le cellule, una linea cellulare di cancro del pancreas stabilito noto per formare sferoidi 39, ma tutte le misurazioni qui descritti sono largamente applicabile per studiare di tumori solidi utilizzando una varietà di linee cellulari adatto per la cultura 3D. Poiché si basa Imaging-questo metodo intrinsecamente è ideale per la co-registrazione dei dati microrheology ad alta risoluzione con grandi campi a luce trasmessa di vista che segnalano cambiamenti nella crescita delle cellule, la migrazione e fenotipo. L'attuazione del PTM integrato con microscopia ottica trasmessa in questo modo assume un posizionamento riproducibile dei wh palco microscopioich è in genere disponibile sul motorizzati commerciale epifluorescenza widefield microscopi biologici. Il protocollo messo a punto sotto può essere realizzata con qualsiasi fluorescenza automatizzato microscopio biologico ragionevolmente attrezzata. Questo è un metodo ad alta intensità di dati intrinsecamente, che richiede l'acquisizione di gigabyte di dati microscopia video digitale per l'elaborazione offline.

Nella seguente protocollo, protocollo 1 riguarda la preparazione iniziale di sferoidi tumorali che viene descritto qui utilizzando overlay su agarosio ma potrebbero essere sostituiti con una varietà di altri metodi come appendere goccia 40, o coltura rotante 41 tecniche. Protocollo 2 descrive il processo di inserimento sferoidi in un'impalcatura di collagene però in alternativa, in vitro tumori 3D in potessero essere coltivate da incapsulamento o incorporamento di cellule risospese in ECM 12,15, piuttosto che singoli sferoidi non aderenti pre-formate. Protocolli successivi descrivono le procedure per OOME OTTENERE misurazioni microrheology risolta in tempo per l'acquisizione e l'elaborazione dei dati di microscopia video, rispettivamente. Il trattamento dei dati è descritta utilizzando MATLAB, facendo uso di routine open source per PTM costruita su algoritmi originariamente descritti da Crocker e Grier 42, che sono anche stati ampiamente sviluppati per piattaforme software differenti (vedi http://www.physics.emory.edu/ ~ settimane / idl /).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Spheroids Culturing tumorali

  1. Miscelare 10 ml di acqua di grado coltura cellulare con 0,1 g di agarosio per ottenere una soluzione di agarosio all'1%.
  2. Soluzione di agarosio calore sopra 70 ° C (circa 14 secondi in un forno a microonde standard o mediante una piastra riscaldante) prima aliquotando 40 ml di soluzione di agarosio in un pozzo su una piastra a 96 pozzetti.
  3. Incubare la piastra a 37 ° C per almeno 1 ora mentre la raccolta delle cellule usando tecniche standard.
  4. Utilizzare un emocitometro per determinare la concentrazione di cellule in sospensione.
  5. Diluire sospensione cellulare a 1000 cellule / ml e aggiungere 100 ml di tale diluizione al pozzetto contenente il letto di agarosio guarito.
  6. Porre il campione in un agitatore durante la notte in un incubatore a 37 ° 5% di CO 2 C e.
  7. Rimuovere il campione dal shaker e aggiungere 100 ml di coltura cellulare multimediale.
  8. Incubare sferoidi fino al raggiungimento del diametro desiderato. Ad esempio, dopo 9 giorni, una spheroid saranno circa 450 micron di diametro. Durante questo tempo, mezzi di crescita fresco può essere aggiunto ai pozzetti ma l'aspirazione deve essere evitata poiché questo provocherà rimozione dello sferoide.

2. Preparazione Spheroids tumorali 3D incorporati in ECM

  1. Preparare una stazione di lavoro con materiali necessari all'interno di una cappa a flusso laminare.
  2. Preparare una miscela diluita di 1 micron di diametro sonde traccianti fluorescenti carbossilato modificato con l'aggiunta di sonde 2 parti di riserva (2% solidi) a 25 parti di acqua sterile.
  3. Rimuovere una bottiglia di 3,1 mg / ml di collagene bovino dal frigorifero e posizionarlo sul ghiaccio.
  4. Aliquota 125 ml di collagene in un vuoto flaconcino da 2 ml.
  5. Aggiungere 50 ml di soluzione della sonda tracciante diluito al flaconcino contenente il collagene e vortice brevemente per distribuire le sonde.
  6. Aggiungere 235 ml di appropriati mezzi di coltura cellulare contenente rosso fenolo (che diventa giallo) per un volume totale di 410 ml e vortex brevemente prima di togliere 205 ml (metà del volume totale) e l'immissione in un nuovo flaconcino da 2 ml. Vial 1 conterrà sferoide tumore e Vial 2 sarà un misto di controllo.
  7. Aggiungi ~ 2 ml di 1 M NaOH al flaconcino 1 per portare nuovamente la soluzione a pH neutro (terreni di coltura contenente rosso fenolo dovrebbe tornare al rosso). Si noti che questo causerà la miscela per iniziare curare se non è tenuta in ghiaccio. Vortex brevemente per mescolare, per poi tornare a cremagliera ghiaccio immediatamente.
    NOTA: Il sferoide è appena visibile ad occhio nudo, dopo 9 giorni di cultura e la sua rimozione dal letto agarosio è un compito delicato. L'uso di un microscopio dissezione può essere utile per alcuni utenti. Mantenendo l'integrità dello sferoide durante il trasferimento è fondamentale.
  8. Usando una pipetta a bocca larga, rimuovere delicatamente 40 ml di supporto dal pozzetto contenente il sferoide tumore. Conservare questo 40 microlitri mentre conduceva il passo successivo.
  9. Controllare il bene per vedere se sferoideè stato rimosso nel passaggio precedente. Se fosse, aggiungere 40 microlitri contenenti sferoide a Fiala 1. Caso contrario, posizionare i 40 microlitri di nuovo nel bene e ripetere il passaggio precedente.
  10. Mescolare delicatamente Vial 1 (non rischiare vortex, può danneggiare la sferoide) prima di trasferire il composto in 60 porzioni microlitri in tre pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti. Ispezionare ciascun pozzetto con un microscopio dopo l'aggiunta di miscela per determinare quale contiene ben sferoide.
  11. Aggiungere 2 microlitri ~ 1 M NaOH e 40 ml di coltura cellulare multimediale a fiala 2 e vortex prima aliquotting 60 ml di questa miscela in un pozzo vuoto nella piastra a 96 pozzetti e l'etichettatura come controllo.
  12. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C per la cura per almeno 1 ora.

3. Costruire Rete di Punti di campionamento e di prendere un video in ogni punto

  1. Trasferire la piastra campione dal incubatrice al palco microscopio. Lasciare 10 minuti per il campione EQUILibrate con la temperatura ambiente se una fase riscaldata non è disponibile.
  2. Osservare il campione con bassi lenti dell'obiettivo alimentati per assicurarsi che sia integro e pronto per l'imaging. Determinare la posizione del tumore all'interno del pozzo.
  3. Decidere quanti punti di campionamento per prendere. Tipicamente, 20 punti di campionamento in ciascun pozzetto, distribuiti in anelli concentrici intorno alla sferoide produrranno risultati sufficientemente dettagliati.
  4. Spostare il palco per ciascuna posizione desiderata e utilizzare il microscopio interfacciamento software per registrare le coordinate xey (o le coordinate registrare manualmente se interfacciare il software non è disponibile).
  5. Passare il microscopio per una lente obiettivo alta potenza (tipicamente 100X), e selezionare il cubo filtro appropriato per la lunghezza d'onda di eccitazione delle sonde traccianti. Utilizzare l'elenco dei punti creati nel passaggio 3.4 per passare al primo punto nella griglia.
  6. Regolare il fuoco per trovare il fondo del pozzo, poi passare a trovare un campo di vista (FOV) contenente vari trac a fuocoer sonde.
  7. Osservare l'istogramma intensità e regolare l'intensità di esposizione e il tempo per dare possibile la più ampia gamma dinamica, garantendo nel contempo che l'immagine non diventa satura.
  8. Ottenere una sequenza video con un frame rate di 20-30 msec per fotogramma (circa 800 fotogrammi o 16-24 sec di lunghezza si raccomanda di fornire statistiche sufficienti per robusto calcolo MSD bilanciato con la necessità di ridurre al minimo il tempo di acquisizione in ogni punto della griglia spaziale) e salvare con una apposita convenzione. Durante la registrazione, non toccare il microscopio o un tavolo.
  9. Ripetere i passaggi 3,6-3,9 per ogni punto campione nella griglia.
  10. Ripetere i passaggi 3,3-3,10 per ogni bene per l'esperimento.

4. Analisi Video dati per calcolare le proprietà reologiche in ogni punto del campione

  1. Copiare tutti i dati video a una cartella di analisi (possibilmente su un computer diverso).
  2. Importazione di dati immagine in MATLAB o altri software di analisi.
    NOTE: Ampia documentazione riguardante la serie di MATLAB particelle routine di rilevamento adottato qui è disponibile a http://people.umass.edu/kilfoil . Si raccomanda l'uso di una funzione telefonica personalizzata per automatizzare l'elaborazione di più file in posizioni diverse.
  3. Calibrare il software analizzando diversi fotogrammi del video per determinare adeguatamente selezione e rifiuto parametri (dimensioni, passa-banda, ecc) per individuare posizioni centrali della sonda. Sfondo esteso per questi passaggi cruciali è descritto da Crocker e Grier.
  4. Utilizzare il software per determinare automaticamente ogni posizione della sonda per tutti i fotogrammi e quindi collegare queste posizioni in traiettorie.
  5. Utilizzare i dati di traiettoria per calcolare lo spostamento quadratico medio (MSD) in funzione del tempo di ritardo, avendo cura di applicare il fattore di calibrazione spaziale appropriata (micron per pixel) per la lente obiettivo specifico, ogni pixel binning, ecc (normalmente effettuatenel meta-dati).
  6. Calcola G * (utilizzando il generalizzato relazione di Stokes-Einstein presi in considerazione i limiti di applicabilità di GSER per un particolare campione 24,28,43. In alternativa, gli utenti potrebbero voler interpretare le proprietà ECM direttamente da MSD, semplicemente confrontando legge di potenza di scala, plateau valori, indici di eterogeneità o di altri parametri.
  7. Ripetere i passaggi da 4.2 tramite 4.6 per ogni FOV nell'esperimento.
  8. Co-registrati i dati di posizione dal punto 3.4 con modulii viscoelastico ad una particolare frequenza di interesse. A seconda del produttore del microscopio utilizzato, questo passo può essere facilitato da una routine personalizzata che legge i metadati microscopio o posizione dati possono essere tabulati manualmente.
  9. Utilizzare le funzioni di interpolazione 3D per generare una reologia mappa spaziale della ECM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Per verificare la validità di G * (ω) misurazioni in posizioni localizzate all'interno di un complesso microambiente modello di tumore, sono stati condotti due esperimenti di validazione iniziali. In primo luogo, abbiamo cercato di validare le nostre misure contro il "gold standard" della massa oscillante taglio reometria. Abbiamo preparato campioni identici di matrice di collagene (senza cellule) ad una concentrazione di 1,0 mg / ml di collagene. Questi campioni sono stati sondati con un reometro bulk (TA Instruments AR-G2, utilizzando 40 millimetri geometria a piatti paralleli) e dal PTM (utilizzando gli stessi parametri in questo protocollo) e le misurazioni risultanti di G '(ω) e G "(ω ) sono stati confrontati (Figura 2A). È stata trovata eccellente accordo tra le due misure. In secondo luogo, per stabilire la capacità di questo protocollo per misurare le variazioni del punto di ECM reologia abbiamo preparato un 1.0 mg / ml matrice di collagene e perline traccianti incorporati. Il campione è stato poi trattato con unainiezione centralizzata di 5 microlitri dispasi (Figura 2B), che digerisce rapidamente collagene. Dopo aver incubato per 3 ore per consentire localizzata collagene digestione si verifichi, i dati video è stato preso a varie distanze dal sito di iniezione, e le misure di G '(ω) e G "(ω) sono stati effettuati in ogni caso. La grandezza di G "(ω = 1 rad / sec) è risultato essere maggiore di quella di G '(ω = 1 rad / sec) al sito di iniezione. Le misurazioni effettuate a distanze crescenti dal sito di iniezione sono stati trovati per avere una grandezza crescente di G *, nonché un rapporto di aumento di G 'a G "(Figura 2C). La dimensione della regione altamente degradata di ~ 2 mm coerente con una distanza stimata di diffusione di una proteina con raggio idrodinamico R H = 1 nm (il peso molecolare di dispasi è 32,5 kDa) attraverso collagene digerito con viscosità η = 10 - 3 Pa · sec a 37 ° C: . Pertanto, i risultati sono in accordo con l'ammorbidimento atteso della matrice, vicino al sito di iniezione, e dimostrano la nostra capacità di fare accurate misurazioni localizzate di reologia matrice.

Dati indicativi di un modello di tumore 3D preparata in questo protocollo è mostrato in Figura 3. Dati video sono stati raccolti a 19 posizioni fisse all'interno del ponteggio collagene, formando una griglia ruvida intorno al tumore (Figura 3A). Questi dati di coordinate è stato associato con i valori calcolati di G '(ω) per creare una mappa spaziale di ECM rigidità (Figura 3B). Questa mappa spaziale rivela chiaramente una zona di rigidità accresciuta immediatamente prossimale sferoide tumore al giorno 2, che potrebbe essere correlata con la deposizione di collagene IV, laminina V und altri componenti della membrana basale depositati dalla sferoide sé 17,18,44,45, o compressione locale della ECM dal sferoide espansione.

La crescita del tumore e la matrice eventi di invasione sono stati monitorati oltre 4 giorni. Due regioni sono stati identificati come aventi una assenza di cellule invasive alla periferia del tumore, o prove pronunciato di invadere le cellule (Figura 3C). Misure PTM sono state prese in regioni 1 e 2 oltre 4 giorni. Di giorno 4, c'era una differenza significativa in G '(riferito a 1 rad / sec) tra le due regioni (Figura 3D). Misure di frequenza-dipendente di G 'e G "per le regioni 1 e 2 il giorno 4 mostra significativa ammorbidimento della ECM in zona 2, la regione invasiva (Figura 3E). Il giorno 4 regione due mostre una risposta viscoelastica liquido-like, evidente dalla scala viscoso della trama G "(Figura 3E).

Rappresentante sub-ottimaleRisultati da errori sperimentali ed analisi comuni sono riportati nella Figura 4. Forse la fonte più ovvia di errore sta nella stabilità della configurazione in cui viene eseguita la microscopia video. Se il banco di laboratorio è spostato o se c'è qualche altra fonte esterna di vibrazioni, traiettorie tallone può essere influenzato artificialmente, che si traduce in una deriva nei dati. Drift provoca l'MSD aumentare drammaticamente a tratti elevato lag (Figura 4A) che provoca anche il G '(ω) e G "(ω) valori calcolati per aumentare drasticamente alle basse frequenze (Figura 4B). Drift può essere ridotto attraverso l'uso di un pneumatico, l'aria imbottito banco di laboratorio, e semplicemente avendo cura di non urtare il setup durante la registrazione video. Inoltre, la deriva può essere rimosso durante la post-elaborazione utilizzando routine software. Queste routine sono adatti per la rimozione di deriva che è approssimativamente uniforme su un intervallo di tempo noto. Drift irregolare (forse causatourtando il palco durante l'acquisizione dei dati) è più problematico. Pertanto, è importante assicurarsi che il campione rimane meccanicamente isolato dall'ambiente durante la raccolta dei dati.

Un'altra potenziale fonte di risultati poco chiari proviene da un'interpretazione non corretta di campione eterogeneità. Sebbene la capacità di osservare e quantificare l'eterogeneità spaziale in un campione è infatti uno dei punti di forza noti del PTM 26 (e qualcosa che si perde nelle misurazioni di massa reologia tradizionali), il raggruppamento improprio dei cluster di traiettorie delle sonde può portare a conclusioni errate. Poiché la modifica dei ECM rigidità riportati da questa metodologia sono intrinsecamente eterogenea, come è il materiale stesso, in un dato campo di vista, ci potrebbe essere un paio di sonde traccianti che non sono elasticamente confinati da fibre di collagene e quindi liberi di esplorare stocasticamente acqua più grande pori (Figura 4C)-riempita. Queste sonde "sciolti" per mostre mobility circa coerente con un ambiente puramente viscoso. Poiché i dati di tutte le sonde sono in media prima moduli viscoelastici sono calcolati, con un paio di sonde sciolti in una determinata regione di campionamento (campo di vista) in grado di produrre frequenze trame a carico di G * (ω) che variano selvaggiamente (Figura 4D).

Calibratura del software improprio può portare a errori durante la raccolta e l'analisi video. Durante la raccolta dei dati video, è importante osservare l'istogramma dell'intensità e regolare il tempo di esposizione per dare possibile la più ampia gamma dinamica garantendo che l'immagine non diventa satura. L'analisi calcola posizioni centrali raffinate per ogni sonda tracciante integrando il valore di intensità di ciascun pixel. Se l'immagine è satura, questa integrazione sarà meno preciso grazie ad una sezione 'superiore piana' del profilo di intensità. Inoltre, la calibrazione caratteristica scoperta è un passo estremamente critiche per assicurare risultati accurati. La corretta scelta dei parametri di selezione è fondamentale. Questo processo è stato descritto ampiamente da Crocker e Grier 42, Savin e Doyle 43, e altri.

Figura 1
Figura 1. Schema di Procedura sperimentale. (A) sferoidi tumorali sono formati su letti di agarosio, e poi trasferiti in una matrice 3D contenente sonde traccianti incorporati. (B) i dati video viene acquistata in più punti all'interno del campione, adiacenti e non lontano dal sferoide tumore. (C) Il movimento stocastico delle sonde in ogni video è analizzato per determinare le proprietà reologiche locali della matrice in ciascun punto di campionamento. Questi dati viene compilato in una mappatura spaziale di ECM rigidezza tutto il bene.ad/51302/51302fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Verifica di misurazioni. (A) I componenti di G * (ω) sono mostrati qui. I valori calcolati di G '(ω) e G "(ω) utilizzando PTM sono molto simili a quelli ottenuti con un reometro rinfusa. (B) 5 pl di dispasi stato aggiunto al centro di un pozzo di raggio r = 8,5 mm avente 1,0 mg / ml di collagene per misurare le variazioni spaziali di G * (ω). (C) I valori calcolati su G '(ω) e G "(ω) presso il sito di iniezione dispasi, 1,5 millimetri dal sito, e 3 mm dal sito. Inoltre, una misurazione di controllo è stato effettuato in un pozzetto contenente lo stesso gel di collagene but senza alcun trattamento dispasi. Nei pressi del sito di trattamento G '(ω) è inferiore G "(ω). Poiché il gel viene campionato ulteriormente dal sito di trattamento i valori di G '(ω) diventa maggiore di G "(ω), e la grandezza di G * (ω) aumenta. Le misurazioni sono state prese 2.5 ore dopo l'iniezione dispasi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Quantificare variazioni di ECM reologia concomitante con insorgenza di invasione matrice locale. (A) Il pozzetto contenente un PANC-1 sferoide 3D ​​sia rilevato in più posizioni per tutta la ECM collagene che circonda il tumore. (B) Coordinare i dati vengono combinati con calculated G '(ω) per ogni posizione per produrre un spaziale ECM rigidità mappa. (C) la crescita tumorale e comportamento invasione sono stati monitorati oltre 4 giorni. Due regioni sono stati identificati come aventi una interazione con le cellule invasori (regione 1, blu asterisco) o l'interazione pesante con la invadere le cellule che spontaneamente si diramavano dalla grande massa primario pluricellulari sferoide (regione 2, asterisco rosso). Misure (D) reologiche sono state prese a regioni 1 e 2 oltre 4 giorni. Al quarto giorno, vi era una differenza significativa in G '(riferito a 1 rad / sec) tra le due regioni. (E) Frequenza misure a carico di G '(ω) e G "(ω) per le regioni 1 e 2 il giorno 4 mostrano significativo ammorbidimento della ECM in zona 2, precisamente correlata con la presenza di popolazioni invasive. G '(ω) e G "valori (ω) calcolati con una legge di potenza adatta ai dati MSD sono come pieno e non riempito res pointture rispettivamente. Il giorno 4, regione due mostre una risposta viscoelastica liquido come come è evidente dal ridimensionamento viscoso della trama G "(ω) e l'assenza della linea di misura per G '(ω). Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Dati dai risultati sub-ottimali a causa di deriva e di interpretazione errata di ECM eterogeneità. (A) L'MSD di una sonda tracciante confinato in un materiale complesso segue il potere legge di scala <Ar 2 (τ)> ~ τ α (0 ≤ α ≤ 1). Di conseguenza, i valori MSD dovrebbero avvicinarsi un altopiano a tempi di latenza lunghi. Drift nel campione in grado di eliminare artificialmente questo comportamento, leading all'escalation valori MSD in tempi di latenza lunghi. (B) Il lungo ritardo deriva nel MSD farà sì che i valori di G '(ω) e G "(ω) di diventare significativamente errata in brevi frequenze. Drift può essere eliminata o ridotta sia garantendo che il campione è isolato meccanicamente durante la raccolta dati o utilizzando routine software per rimuovere deriva durante l'analisi. (C) Anche in un piccolo campo di vista, due distinte varietà di traiettorie delle sonde possono essere presenti. In questo esempio, la maggior parte delle sonde sono confinati nella matrice, ma pochi sono 'sciolti' - loro traiettorie sono molto meno vincolato. (D) Il tentativo di interpretare i dati MSD sia da limitate e le sonde non vincolate allo stesso tempo senza una corretta interpretazione di campione eterogeneità si confondono misure di moduli viscoelastici. prega click qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In questo protocollo si introduce una strategia robusta e ampiamente applicabile per longitudinalmente rilevamento delle modifiche locali in ECM rigidità nei modelli tumorali 3D. Prevediamo che questa metodologia possa essere adottato da biologi cancro e biofisici interessati nel comportamento meccanosensibili implicati nel rimodellamento della matrice durante la crescita del tumore e dei processi di invasione. Quantificazione precisa di matrice cinetica di degradazione possa essere particolarmente utile a coloro che studiano l'attività delle metalloproteasi della matrice, lysyl ossidasi o di altre rilevanti specie biochimici in modelli tumorali 3D che sono direttamente collegate al rimodellamento della matrice. Oltre all'applicazione di modelli tumorali 3D descritto qui, si potrebbe immaginare ulteriormente l'attuazione di questo approccio in combinazione con altri sistemi modello malattia in cui modificazione della reologia matrice nel tempo gioca ruoli importanti 46,47. L'utilità di questo metodo continua ad essere migliorata attraverso miglioramenti software che ulteriori automatvia e il processo e consentire l'aumento studi di throughput. Ciò comporterà istantanee sempre più dettagliate paesaggio fisico di molti campioni, contemporaneamente, per uso in formati multi-pozzetto.

Qui noi descriviamo specificamente l'attuazione del passivo microrheology particella-tracking in modelli tumorali 3D, che è adatto per la misura della risposta viscoelastica lineare nell'intervallo ~ decine di Pascal tipiche di prodotti di matrice extracellulare disponibili in commercio (collagene bovino, estratti EHS-tumorali o impalcature nanofibre commerciali). L'osservazione di stocastico, movimento alimentato termicamente, anche con elevate ottiche apertura numerica di quantificare piccoli spostamenti della sonda, è intrinsecamente limitato al regime lineare di questi ambienti ECM relativamente morbidi, ma investigatori desiderano sondare materiali più rigidi può essere in grado di adattare questo protocollo per l'uso con manipolazioni attive tramite ottico o magnetico 48 intrappolamento 49 di sonde. Since le pinzette ottiche o magnetiche sondare un singolo punto all'interno di un campione e non influenzano l'integrità del campione, queste tecniche potrebbero eventualmente essere incorporati nel protocollo di cui sopra per ottenere misurazioni longitudinali di campioni più rigidi.

E 'importante osservare che altre forze di cellule generate possono anche contribuire a movimenti sonda traccianti a diverse scale temporali. Ad esempio, durante la migrazione delle cellule che si verificano nel corso di ore e giorni in coltura, gruppi di sonde dovranno essere spinto e tirato a causa di movimenti cellulari ed è davvero questo movimento che viene utilizzata in forza di trazione microscopia 50,51. I movimenti guidati sonda termica che vengono analizzati per ottenere dati microrheology avvengono nell'ordine di secondi, un lasso di tempo chiaramente separabili. Mentre è anche vero che le dinamiche più lente di danneggiamento associati alle forze di trazione possono contribuire a cambiamenti locali in reologia 36, una forza di questa rappresentazione-bapproccio ased sta nella capacità di correlare cambiamenti visivi e reologiche del campione. Ad esempio nei risultati rappresentativi in figura 3, un evento invasione matrice e cellula migrazione evidente è correlata con una variazione in G 'di quasi quattro ordini di grandezza durante il tempo questa migrazione avviene.

Il protocollo qui descritto presuppone che gli utenti abbiano accesso a un microscopio con un palco motorizzato che fornisce il posizionamento riproducibile del campione. Labs che non hanno questa strumentazione potrebbero ancora fare misurazioni di punti utilizzando marchi o altri segnali visivi nel porta-campioni o campione per consentire misurazioni ripetute allo stesso punto, anche se sarebbe probabilmente difficile per ottenere lo stesso riproducibilità nel posizionamento come mostrato nella misure longitudinali rappresentativi qui. Ai fini di questi risultati rappresentativi di cui sopra, posizionamento sul asse z è stata mantenuta pressoché costante. Tuttavia, il cou protocollold anche essere modificato per includere ulteriori misurazioni lungo l'asse z al fine di creare una mappa 3D reologico del campione. Il metodo può anche essere modificato per utilizzare un confocale a scansione laser o un tecniche multiphoton per 3D sezionamento se velocità di scansione imporrebbe una limitazione dei limiti di frequenza superiore accessibili che possono o non possono essere problematico per una data applicazione.

In questo metodo, un vincolo temporale significativo è imposta dalla necessità di ricorrere cellule vive per l'incubatore. Senza un time-lapse stazione meteo custodia per il controllo di temperatura, umidità e CO 2 livelli, immagine Tempo di acquisizione deve essere ridotto al minimo. Anche con l'attrezzatura adeguata, la raccolta dei dati richiede grandi quantità di tempo e di memoria digitale, che sono entrambi soggetti a limitazioni pratiche. Ad esempio, con il microscopio e telecamera utilizzata in questo studio, ci vorrebbero circa 35 ore per prendere i circa 4.000 video necessarie per mappare un singolo bene su una 96-Pozzetti utilizzando una lente obiettivo 100X senza spazi tra i campi di vista. Questi fattori pongono limiti al numero di punti di dati che può realisticamente essere raccolti. Il livello di dettaglio è pertanto soggetta ai vincoli pratici imposti dal tempo disponibile per la raccolta dei dati, spazio di immagazzinamento dati e la disponibilità di un alloggiamento ambientale.

La possibilità di quantificare i cambiamenti in ECM reologia potrebbe essere ulteriormente integrato a fianco di metodi di imaging-based per la quantificazione della risposta terapeutica in modelli tumorali 3D 17,18,52,53. Il multi-pozzetto sistema di coltura modello 3D adottato in entrambi i metodi suggerisce un'applicazione parallela fornendo correlazione tra la risposta citotossica e modificazione dell'ambiente meccanica. Questo potrebbe facilitare lo sviluppo di nuove strategie che mirano esplicitamente il fenotipo meccanico o delucidano l'impatto delle terapie esistenti in questa capacità. Tale intuizione potrebbe essere direttamente rilevanti per unpproaches per migliorare la consegna della droga attraverso una fitta ricco di collagene stroma tumorale. Ad esempio, nel contesto della illustrazione rappresentante di questo protocollo presentato qui con modelli tumorali pancreatiche in vitro, la valutazione della degradazione della matrice seguenti interventi potrebbero essere utilizzati per screening regimi stromale esaurimento e delle sempre più importante paradigma terapeutico per il cancro del pancreas 54.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Ringraziamo la condivisione open-source di MATLAB codice particella di monitoraggio fornito da Maria Kilfoil ( http://people.umass.edu/kilfoil/ ), insieme al codice precedente IDL e ampia documentazione fornita da John C. Crocker e Eric R. settimane. Questo lavoro è stato reso possibile da un finanziamento dal National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 e R00CA155045 (PI: JPC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine type 1 collagen BD Biosciences, San Jose, CA 354231
PANC-1 American Type Cell Culture, Manassas, VA CRL1469 or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres Life Technologies, Carlsbad, CA 906906
Matrigel BD Biosciences, Bedford, MA 354230
Agarose Fisher Bioreagents, Waltham, MA C12H18O9
NaOH Fisher Bioreagents, Waltham, MA NC0480985
96-well Imaging plates Corning Inc., Corning, NY 3904
DMEM Hyclone, Waltham, MA SH30243.01 or appropriate cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software The Mathworks, Natick, MA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer metastasis reviews. 28, 113-127 (2009).
  3. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  4. Bershadsky, A. D., Balaban, N. Q., Geiger, B. Adhesion-dependent cell mechanosensitivity. Annual review of cell and developmental biology. 19, 677-695 (2003).
  5. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474, 179-183 (2011).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Prog Biophys Mol Biol. 97, 163-179 (2008).
  7. Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function. Cell Biochem Biophys. 47, 300-320 (2007).
  8. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116, 2377-2388 (2003).
  9. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).
  10. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nat Rev Cancer. 9, 108-122 (2009).
  11. Assoian, R. K., Klein, E. A. Growth control by intracellular tension and extracellular stiffness. Trends Cell Biol. 18, 347-352 (2008).
  12. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4, 359-365 (2007).
  13. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature reviews. Cancer. 5, 675-688 (2005).
  14. Ulrich, T. A., Jain, A., Tanner, K., MacKay, J. L., Kumar, S. Probing cellular mechanobiology in three-dimensional culture with collagen-agarose matrices. Biomaterials. 31, 1875-1884 (2010).
  15. Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix encapsulation of cancer cells. J. Vis. Exp. (34), e1692 (2009).
  16. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  17. Celli, J. P., Rizvi, I., Evans, C. L., Abu-Yousif, A. O., Hasan, T. Quantitative imaging reveals heterogeneous growth dynamics and treatment-dependent residual tumor distributions in a three-dimensional ovarian cancer model. J Biomed Opt. 15, 051603-051610 (2010).
  18. Rizvi, I., et al. Synergistic Enhancement of Carboplatin Efficacy with Photodynamic Therapy in a Three-Dimensional Model for Micrometastatic Ovarian Cancer. Cancer Res. 70, 9319-9328 (2010).
  19. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels. J. Vis. Exp. (42), e2089 (2010).
  20. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell Cycle. 8, (2009).
  21. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Mason, T. G., Weitz, D. A. Optical Measurements of Frequency-Dependent Linear Viscoelastic Moduli of Complex Fluids. Physical Review Letters. 74, 1250 (1995).
  24. Mason, T. G., Ganesan, K., van Zanten, J. H., Wirtz, D., Kuo, S. C. Particle Tracking Microrheology of Complex Fluids. Physical Review Letters. 79, 3282-3285 (1997).
  25. Crocker, J. C., et al. Two-Point Microrheology of Inhomogeneous Soft Materials. Physical Review Letters. 85, 888 (2000).
  26. Valentine, M. T., et al. Investigating the microenvironments of inhomogeneous soft materials with multiple particle tracking. Physical Review E. 64, 061506 (2001).
  27. Helfer, E., et al. Microrheology of Biopolymer-Membrane Complexes. Physical Review Letters. 85, 457 (2000).
  28. Levine, A. J., Lubensky, T. C. One- and Two-Particle Microrheology. Physical Review Letters. 85, 1774 (2000).
  29. Jonas, M., Huang, H., Kamm, R. D., So, P. T. Fast fluorescence laser tracking microrheometry, II: quantitative studies of cytoskeletal mechanotransduction. Biophys J. 95, 895-909 (2008).
  30. Celli, J., et al. Viscoelastic properties and dynamics of porcine gastric mucin. Biomacromolecules. 6, 1329-1333 (2005).
  31. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Phys Rev Lett. 102, 188303 (2009).
  32. Bloom, R. J., George, J. P., Celedon, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Mapping local matrix remodeling induced by a migrating tumor cell using three-dimensional multiple-particle tracking. Biophys J. 95, 4077-4088 (2008).
  33. Gordon, V. D., et al. Measuring the mechanical stress induced by an expanding multicellular tumor system: a case study. Exp Cell Res. 289, 58-66 (2003).
  34. Li, Y., Schnekenburger, J., Duits, M. H. Intracellular particle tracking as a tool for tumor cell characterization. J Biomed Opt. 14, 064005 (2009).
  35. Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical Mapping of Live Cells by Multiple-Particle-Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 83, 3162-3176 (2002).
  36. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of Mechanical Strains and Stresses around Quiescent Engineered Three-Dimensional Epithelial Tissues. Biophysical Journal. 103, 152-162 (2012).
  37. Yang, Y. L., Motte, S., Kaufman, L. J. Pore size variable type I collagen gels and their interaction with glioma cells. Biomaterials. 31, 5678-5688 (2010).
  38. Ludwig, T., Kirmse, R., Poole, K., Schwarz, U. S. Probing cellular microenvironments and tissue remodeling by atomic force microscopy. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 456, 29-49 (2008).
  39. Sipos, B., et al. A comprehensive characterization of pancreatic ductal carcinoma cell lines: towards the establishment of an in vitro research platform. Virchows Archiv : an international journal of pathology. 442, 444-452 (2003).
  40. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
  41. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
  42. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).
  43. Savin, T., Doyle, P. S. Static and Dynamic Errors in Particle Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 88, 623-638 (2005).
  44. Evans, C. L., et al. Killing hypoxic cell populations in a 3D tumor model with EtNBS-PDT. PLoS ONE. 6, e23434 (2011).
  45. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
  46. Celli, J. P., et al. Helicobacter pylori moves through mucus by reducing mucin viscoelasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 14321-14326 (2009).
  47. Bansil, R., Celli, J. P., Hardcastle, J. M., Turner, B. S. The Influence of Mucus Microstructure and Rheology in Helicobacter pylori Infection. Frontiers in immunology. 4, 310 (2013).
  48. Furst, E. M. Applications of laser tweezers in complex fluid rheology. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 10, 79-86 (2005).
  49. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic Tweezers: Micromanipulation and Force Measurement at the Molecular Level. Biophysical Journal. 82, 3314-3329 (2002).
  50. Dembo, M., Wang, Y. -L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76, 2307-2316 (1999).
  51. Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: a new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLoS ONE. 6, e17833 (2011).
  52. Celli, J. P., Petrovic, L., Massdodi, I., Rizvi, I., Hasan, T. Overcoming therapeutic resistance in pancreatic cancer is not a simple mix of PDT and chemotherapy: Evaluation of PDT-chemotherapy combinations in 3D tumor models. Proc SPIE. , 85680R-85680R (2013).
  53. Glidden, M. D., et al. Image-Based Quantification of Benzoporphyrin Derivative Uptake, Localization, and Photobleaching in 3D Tumor Models, for Optimization of PDT Parameters. Theranostics. 2, 827-839 (2012).
  54. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Scientific reports. 4, 3751-3710 (2014).
  55. Celli, J. P. Stromal interactions as regulators of tumor growth and therapeutic response: A potential target for photodynamic therapy. Israel journal of chemistry. 52, 757-766 (2012).
  56. Garber, K. Stromal depletion goes on trial in pancreatic cancer. J Natl Cancer Inst. 102, 448-450 (2010).

Tags

Bioingegneria viscoelasticità mechanobiology matrice extracellulare (ECM) rimodellamento della matrice modelli tumorali 3D microambiente tumorale stroma metalloproteasi della matrice (MMP) la transizione epitelio-mesenchimale (EMT)
Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, D. P., Hanna, W., El-Hamidi,… More

Jones, D. P., Hanna, W., El-Hamidi, H., Celli, J. P. Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology. J. Vis. Exp. (88), e51302, doi:10.3791/51302 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter