Summary
粒子跟踪microrheology可用于非破坏性的量化和空间映射的变化在三维肿瘤模型中的细胞外基质的机械性能。
Abstract
机械微环境已被证明作为肿瘤生长行为和信号传导的关键调节剂，它是本身改造和修饰的一组复杂的，双向的机械敏感性交互的一部分。虽然生物相关的3D肿瘤模型的发展，促进了对基材的流变性对肿瘤生长的影响机理研究，在诱发肿瘤的力学环境映射变化的逆问题仍然充满挑战。在这里，我们描述粒子跟踪microrheology（PTM）在与胰腺癌三维模型相结合实施工作，作为一个强大的和可行的方法为纵向监测在肿瘤微环境的物理变化， 原位部分。这里描述的方法结合制备包埋在模型细胞外基质I型胶原的（ECM）的支架体外三维模型的系统与荧光标记探针为均匀分布婆sition和时间依赖性microrheology测量整个样品的体外肿瘤被镀和使用多孔成像板探测平行的条件。借鉴成熟的方法，示踪探测移动视频是通过广义斯托克斯爱因斯坦关系（GSER）上报复杂的与频率相关的粘弹性剪切模量G *（ω）的转化。因为这种方法是基于成像，机械特性也映射到大型透射光的空间领域同时上报3D肿瘤大小和表型的质变。代表性的结果对比显示与局部浸润引起基质降解以及系统校准相关的子区域的机械响应，验证数据列。从常见的实验误差和对这些问题的故障排除不良后果也被提出。在这个协议中实现的96孔培养三维镀格式为conducive到microrheology测量与治疗筛选试验或分子成像，以获得新的见解的治疗方法或生化刺激对机械微环境影响的相关性。
Introduction
很明显从文献中的证据，癌细胞，与非恶性哺乳动物上皮细胞，是向周围的细胞外基质（ECM）和其他微环境组分1-9的机械和生物物理特性高度敏感越来越多。优雅的机理研究提供了见解外刚度作为调控的恶性生长行为和形态2,3,10,11一个复杂的机械敏感性的信令合作伙伴的角色。这项工作提供了便利尤其是3D的在恢复生物学相关的组织架构和可以种植在支架材料具有可调力学和光学显微镜成像12-19 体外肿瘤模型的发展。然而，肿瘤和微环境，通过这些癌细胞反过来修改其周围的流变性之间的这种mechanoregulatory对话的另一侧，仍有些更难以研究。例如，在侵入过程中，细胞在肿瘤的周围可经历上皮至间质转变（EMT）和增加基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，导致ECM 20-22，这反过来又影响的机械敏感性生长行为的局部降解其他近端肿瘤细胞。通过各种生化过程，癌细胞不断地拨打他们的环境的局部刚度上下，以适应不同的过程在不同的时间。这里描述的方法是由需要该报告在生长过程中的刚性和遵守ECM的局部变化，可与三维肿瘤模型被集成并与生物化学和表型变化的纵向相关性而不终止培养分析工具的动机。
为了寻找一个合适的技术，在此背景下实施的，粒子跟踪microrheology（PTM）的出现作为一个强有力的候选人。这种方法，由梅森和韦茨23,24最初开创，使用嵌入在一个复杂的流体在微米尺度报告的频率依赖的复合粘弹性剪切模量G *（ω）示踪探头的运动。这是一般的做法已经开发出适合在软凝聚态物质，胶体，生物物理学和高分子物理25-31不同应用程序的多个变体。 PTM具有相对于其它方法的某些优点，因为本地粘弹性的读数被并入在培养制备物的时间和保持在原位生长过度长时间的生化无效的示踪探针的非破坏性的视频成像提供。这是相对于黄金标准测量与振荡剪切流变仪本体，这必然需要终止培养，并报告样品的体积宏观流变性而不是复杂的三维肿瘤microenvir内点测量onment。的确许多研究已经说明解释的示踪探测运动中或周围癌或非癌细胞以测量与细胞迁移32，机械应力引起的膨胀球体33，细胞内的流变34,35相关联的变形的测量的效用，并映射的机械应力和应变在工程化组织36，并且孔径和入侵速度37之间的关系。适于microrheology其他技术，例如原子力显微镜（AFM）可以被实现，但是主要用于探测点在样品表面并且还可以构成该复杂纵向测量38培养无菌的问题。
在这里，我们描述了一个全面的协议涵盖为适合传送到ECM与嵌入式荧光探针用于视频粒子跟踪和分析方法可靠地映射空间三维球体瘤生长的方法在文化随时间的变化microrheology。在本实施方式中，三维肿瘤模型是生长在多孔形式与对掺入microrheology测量与其它传统的测定法（ 例如 ，细胞毒性），其中该格式是有利的视图。在这种方法我们培养体外三维使用PANC-1细胞的球状体这代表插图，已知以形成球状体39，但本文所述的所有测量值建立的胰腺癌细胞系是广泛适用的实体瘤的利用各种细胞系，研究适合3D的文化。因为这种方法本质上是基于成像的它非常适合与大视透射光场的报告改变细胞生长，迁移和表型高分辨率microrheology数据配准。 PTM的实施与透射光显微镜集成以这种方式假定在显微镜阶段WH的重现性定位ICH通常可在机动车商业广角落射荧光生物显微镜。下面开发的协议可以与任何合理配备自动荧光生物显微镜来实现。这是一种固有的数据密集型方法，这就需要收购数字视频显微镜数据进行离线处理千兆字节。
在下面的协议，协议1涉及在此所说明利用叠加在琼脂糖，但是可以用各种其他方法，如悬滴40，或旋转式培养41技术被取代肿瘤球状体的初始准备。方案2描述了在胶原蛋白支架嵌入球体虽然可替代地， 在体外三维肿瘤可以由封装或重新悬浮的细胞包埋在细胞外基质12,15，而不是单一的预成形的非粘附球状体生长的过程。随后的协议描述为O过程通过收购和处理视频显微镜数据，分别btaining时间分辨microrheology测量。数据处理是用MATLAB，利用对PTM建立在最初由克罗克和格里尔42，这也为不同的软件平台被广泛开发的算法描述开放源代码例程（见http://www.physics.emory.edu/描述〜周/ IDL /）。
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Protocol
1，培养肿瘤细胞球体
- 将10mL细胞培养级水中0.1克琼脂糖，得到在1％琼脂糖溶液。
- 热的琼脂糖溶液至70℃以上等分40微升的琼脂糖溶液放入井在96孔板中之前（大致14秒在一个标准的微波或通过使用加热板）。
- 培养板在37℃下放置至少1小时，同时用标准技术收获细胞。
- 使用血细胞计数器确定在悬浮液中细胞的浓度。
- 稀释细胞悬液，以1,000个细胞/毫升，加入100微升这种稀释到井含固化琼脂糖床。
- 将样品放置在摇床上过夜的培养箱设定为37℃和5％CO 2。
- 从振动筛取出样品，加入100μl的细胞培养基。
- 孵化球体，直到所需的直径就达到了。例如，9天后，一个SPheroid将是直径约450微米。在此期间，新鲜的生长培养基中可以加入到孔中，但抽吸应该避免，因为这将导致在除去球体。
2，准备3D肿瘤细胞球体嵌入ECM
- 准备与层流罩内所需材料的工作站。
- 通过添加2份股票探针（2％固体），以25份用无菌水制备羧化物修饰为1μm直径荧光示踪探针的稀释的混合物。
- 从冰箱中取出一瓶3.1毫克/毫升的牛胶原蛋白，并将其放置在冰上。
- 分装125微升胶原蛋白的成空机2 ml小瓶的。
- 加入50微升的稀释示踪探测解决方案，含有胶原蛋白和涡简要分配探头的小瓶。
- 添加235微升含有酚红（这会变黄）为41的总体积适当的细胞培养介质的0毫升和涡去除205毫升（一半的总体积），并放置在新的2ml小瓶前短暂。小瓶1将包含肿瘤球体和2瓶将是一个混合的控制。
- 添加〜2微升的1M NaOH至样品瓶1中以使该溶液回到中性pH（含有酚红的培养基应返回到红色）。请注意，这将导致混合物开始固化，如果它不保持在冰上。短暂涡旋混合，然后立即返回到冰架上。
注意：该球体是隐约可见肉眼之后的文化和从琼脂糖床的去除9天是一个棘手的任务。使用解剖显微镜可能对某些用户有帮助的。在传输过程中保持球体的完整性是至关重要的。 - 使用宽口移液管尖轻轻从井中含有肿瘤球体去除40微升的介质。留住这40微升，同时进行下一个步骤。
- 检查井，看是否球体除去在前面的步骤。如果是，添加包含球体到小瓶1的40微升，如果不是，将40微升回入井，并重复前面的步骤。
- 在60微升的部分将所述混合物分成三个独立的96孔板的孔中之前，轻轻搅拌样品瓶1（不冒险的涡流，它可能会损坏球体）。加入混合物，以确定哪些以及包含该球体后检查各孔用显微镜。
- 添加〜2微升的1M NaOH和40μl细胞培养基至瓶2和aliquotting 60微升该混合物在96孔板和标签作为对照的空井之前涡流。
- 将板置于37℃培养箱中培养，以固化至少1小时。
3，构建样本点网格，并采取视频在每个点
- 从培养箱转移样品板的显微镜载物台上。允许10分钟的样品等角球ibrate与室温如果加热阶段不可用。
- 观察样品与低功率的物镜，以确保它是完整的，并准备进行成像。确定在所述井中的肿瘤的位置。
- 决定多少个采样点取。典型地，在每个孔20的采样点，分布在周围的旋转椭球体的同心环将产生足够的详细结果。
- 移动台到各个所需的位置，并使用显微镜接口软件记录的x和y坐标（或记录手动坐标如果接口软件不可用）。
- 显微镜切换到高功率的物镜（通常100X），并选择相应的过滤器立方体的示踪剂探头的激发波长。使用步骤3.4中创建点的列表移动到网格中的第一点。
- 调整焦距，以发现井的底部，然后向上移动，找到视角（FOV）包含几个焦点对准TRAC场呃探头。
- 观察的强度直方图和调整曝光强度和时间，得到的最大动态范围的可能，同时确保图像不会变得饱和。
- 获得视频序列的每帧20至30毫秒的帧速率（约800帧或16-24秒的长度，建议提供足够的统计数据强劲MSD计算的需要尽量减少在每个空间网格点的采集时间平衡）和保存用适当的约定。在录音时，请勿触摸显微镜或桌子上。
- 对网格中的每个采样点重复步骤3.6至3.9。
- 每口井在实验中重复步骤3.3至3.10。
4，分析视频数据来计算流变学特性在每个采样点
- 所有的视频数据复制到一个文件夹中的分析（可能在不同的计算机上）。
- 导入图像数据到MATLAB或其他分析软件。
NOTE：关于一套这里通过MATLAB的粒子跟踪程序的大量文档可在http://people.umass.edu/kilfoil 。建议使用一个自定义的调用函数用于自动在不同位置的多个文件的处理。 - 通过分析视频的多个帧来适当地确定选择和拒绝参数（尺寸，带通等），用于识别探针中心位置校准软件。广泛的背景，这些关键步骤是由克罗克和格里尔描述。
- 使用该软件可自动判断所有视频帧的每个探头的位置，然后将这些位置连接成轨迹。
- 使用轨迹数据来计算均方位移（MSD）作为延迟时间的函数，即确保将适当的空间校准因数（每像素微米）为特定的物镜，任何像素组合等（典型地中的元数据）。
- 计算G *（使用GSER的适用性为特定样品24,28,43的限制。另外，用户可能希望从MSD通过简单地比较幂缩放，高原直接解释ECM性能考虑广义Stokes-Einstein关系异质性或其他参数的值，指数。
- 每个FOV在实验中重复步骤4.2至4.6。
- 从步骤3.4粘弹性modulii在感兴趣的特定频率共同注册位置数据。根据所使用的显微镜的制造商，这一步可以通过它读取显微镜的元数据或位置数据可以手动制表一个自定义例程来促进。
- 使用3D插值函数来生成ECM的空间流变图。
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Representative Results
为了验证G *（ω）在内的复杂模型肿瘤微环境局部位置测量的有效性，两个初始的验证实验。首先，我们试图验证我们的测量对大宗振荡剪切流变的“金标准”。我们以1.0毫克/毫升的胶原蛋白的浓度制备的胶原蛋白基质的相同的样品（无细胞）。这些样品用探针本体流变仪（TA Instruments的AR-G2，使用40毫米平行板几何形状），并通过PTM（使用相同的参数，如在本协议），将得到的G测量'（ω）和G“（ω ）进行了比较（ 图2A）。优良的协议是在两次测量之间找到。其次，要建立这个协议来衡量，我们准备了1.0毫克/毫升的胶原基质和嵌入示踪剂珠在ECM流变学点变化的能力。然后，将样品与治疗集中注射5μl的分散酶（ 图2B），这迅速消化胶原蛋白。温育3小时，以允许局部的胶原消化发生后，视频数据是在不同的距离从注射部位和测量的G'（ω）和G“（ω）在每种情况下作出。图G的大小“（ω= 1弧度/秒）被发现在注射部位为比的G'大（ω= 1弧度/秒）。在从注射部位增加距离的测量中发现有G *的增加幅度，以及的G'与G的增加比率“（ 图2C）。的〜2个毫米高度退化区域的大小是与蛋白质的扩散与流体动力学半径R H = 1毫微米的估计距离（分散酶的分子量为32.5 kDa的）通过消化胶原为η= 10的粘度保持一致- 3帕·秒，在37°C：
从根据本协议编写的一个三维肿瘤模型的代表性数据示于图3，视频数据被收集在胶原蛋白支架内19固定的位置，形成肿瘤周围的一个粗略的网格（ 图3A）。该坐标数据为G的计算值'（ω）被组合以创建ECM刚度（ 图3B）的空间映射。这个空间的地图清楚地揭示了提高刚性的区域立即近端肿瘤球体在第2天，这可能与IV型胶原，层粘连蛋白V时的沉积相关联D其他基底膜成分沉积在球体本身17,18,44,45，或ECM的经扩大球体局部压迫。
肿瘤的生长和基质侵袭事件进行了监测4天以上。两个区域被确定为具有或者没有证据侵袭细胞在肿瘤周围，或侵入细胞（ 图3C）的明显证据。 PTM测量是在区域1和区域2 4天以上。第4天，有G中一个显著差异“的两个区域（ 图3D）之间（报道在1弧度/秒）。的G'和G“为区域1和2的频率依赖于测量细胞外基质在区域2，侵入区域（ 图3E）的4天展会显著软化。第4天区2表现出液体状的粘弹性响应，明显通过的G“曲线（ 图3E）粘稠缩放。
代表性的亚最佳从普通的实验和分析错误结果示于图4。也许错误的最明显的来源在于在其上执行视频显微镜设置的稳定性。如果实验室工作台位移或有振动的一些其他外部源，珠轨迹可以人为的影响，这会导致在数据中的漂移。漂移导致MSD在高滞后时间显着增加（ 图4A），它也使G'（ω）和G“（ω）计算出的值，以在低频率（ 图4B）急剧增加。漂移可以通过使用气动，气垫实验室工作台上的减少，并通过简单的照顾，以不碰撞的设置，同时视频都被记录下来。此外，漂移可以使用软件例程后处理过程中被除去。这些例程适用于去除漂移大约是均匀的一个已知的时间间隔。不稳定的漂移（也许造成通过数据采集过程中碰撞阶段）更成问题。因此，重要的是要确保样品保持从数据收集期间的环境机械隔离。
的结果还不清楚另一个潜在来源是不恰当的解释样本异质性。虽然观察和量化空间异质性样本中的能力的确是PTM 26（和东西是失去了在传统大宗流变学测量）的注意强项之一，集群探头轨迹的分组不当可导致不正确的结论。鉴于报告的这一方法改变细胞外基质的刚性本质上是异质的，因为是材料本身，在视图中的任何给定的领域，有可能是没有弹性胶原纤维的局限，从而自由地探索随机大水中数示踪探头填充孔隙（ 图4C）。这些“宽松”探头展览米obility用纯粘性环境基本一致。由于对所有探头的数据是平均粘弹性模量计算之前，其在给定的采样区域的几个松散的探针（视野）可以产生G *（ω）随频率变化的曲线变化很大（ 图4D）。
不正确的软件校准可以进行视频采集和分析过程中导致错误。在视频数据的采集，以观察亮度直方图并调整曝光时间，得到的最大动态范围的可能，同时确保了图像变得不饱和是重要的。该分析通过将每个像素的亮度值来计算精制的中心位置为每个示踪探针。如果图像是饱和的，这种融合将是不准确的，由于光强分布的一个“平顶”部分。此外，该功能发现校准，以确保准确的结果极为关键的一步。正确选择的选择参数是至关重要的。这个过程已经被广泛地描述由克罗克和格里尔42的Savin和Doyle 43，及其他。
图1。原理实验程序的（A）肿瘤球体形成在琼脂糖床，然后转移到含嵌入式示踪探测三维矩阵。 （B）的视频数据被视为在几个点在样本内井，都相邻并远离肿瘤球体。 （C）在各视频探头的随机运动，以便在每个采样点来确定矩阵的局部流变性能进行了分析。这个数据被编译成ECM刚度的整个井空间的映射。ad/51302/51302fig1highres.jpg“目标=”_blank“>请点击这里查看该图的放大版本。
测量图2。验证（A）G *（ω）的组件显示在这里。为G的使用PTM的计算值'（ω）和G“（ω）非常相似，通过堆积流变仪获得的。 （B）5微升分散酶的加入到一个井的中心，半径为r =8.5毫米含有1.0毫克/毫升的胶原以测量G *（ω）的空间变化。 （C）G的计算值'（ω）和G“（ω）在分散酶注射部位，1.5毫米的站点，和3毫米的站点。此外，控制测量是在含有相同的胶原凝胶B A以及UT斯达康没有分散酶治疗。近治疗部位的G'（ω）是除G较小的“（ω）。作为凝胶被进一步从治疗部位的G'值采样（ω）成为除G大“（ω）和G *的大小（ω）增加。测量是2.5小时分散酶注射后， 请点击此处查看该图的放大版本。
图3。量化变化的ECM流变性伴随发病本地基质浸润的（A）的以及含有PANC-1三维球体在整个肿瘤周围的胶原蛋白的ECM探测在多个位置。 （二）协调数据和C结合而alculated G'（ω）为每个位置产生一个空间的ECM刚性地图。 （ 三）肿瘤的生长和侵袭行为进行监控4天以上。两个区域被确定为有或者没有与侵入细胞的相互作用（区域1，蓝色星号）或入侵细胞自发地从大的初级多细胞球体质量（区域2，红色星号）跨足重互动。 （D）的流变学测量是在区域1和2 4天以上。到了第四天，有两个地区之间在G中一个显著的差异“（报道在1弧度/秒）。 （ 五）频率依赖的G上的ECM在区域2，与入侵的人群的存在恰恰相关的4天展会显著软化区域1和区域2的测量'（ω）和G“（ω）。 G'（ω）和G“（ω），使用幂律拟合到MSD数据计算出的值被显示为填充和未填充点水库pectively。第4天，地区二级表现出类似液体的粘弹性响应是明显的G“（ω）的情节和缺席的情况下拟合线G'（ω）的粘性缩放。 请点击这里查看一台放大版这个数字。
图4。从数据由于漂移和细胞外基质的异质性不正确的解释次优的结果。（一 ）限制在一个复杂的材料示踪探头的MSD遵循幂律标度<ΔR2（τ）>〜τα（0≤ α≤1）。因此，MSD值应该接近一个高原长的滞后时间。漂移的样本中可以人为地消除这种行为，Leading到在很长的滞后时间升级MSD值。 （ 二）长期滞后时间漂在MSD会引起的G值'（ω）和G“（ω）成为显著错误在很短的频率。漂移可以通过确保将样品数据收集过程中机械地分离，或通过使用软件程序来分析过程中除去漂移被消除或减少。 （C）即使在小视野，两种截然不同的品种探头轨迹的可能存在。在这个例子中，大部分的探针被限制在基体中，但有少数是“松散的” - 其运动轨迹是不太约束。 （ 四）试图解释从两个约束和无约束探头，同时没有样品的异质性的正确解释会混淆粘弹性模量测量的MSD数据。 请CLI完蛋此处查看这个数字的放大版本。
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Discussion
在这个协议中，我们介绍一个强大和广泛适用的策略，纵向跟踪三维肿瘤模型在流脑刚度局部变化。我们设想，这种方法可能是癌症生物学家和生物物理学家感兴趣的肿瘤的生长和侵袭过程中牵连的基质重塑机械敏感性行为被采纳。的基质降解动力学精确量化可能是特别有价值的研究基质金属蛋白酶，赖氨酰氧化酶或其他有关生化物质在三维肿瘤模型是直接链接到基质重塑的活性。除了 应用到三维肿瘤模型描述在这里，人们可以进一步想象这种方法与其他疾病模型系统相结合的实施中，基体流变随时间的修改中起着重要的作用46,47。这种方法的效用继续通过软件改进提高，进一步的自动售货机e本程序，并允许更高的吞吐量研究。这将导致许多样品的物理景观，同时，对于在多井格式的使用越来越详细的快照。
在这里，我们具体描述的被动粒子跟踪microrheology在三维肿瘤模型中，这是非常适合的在范围内的线性粘弹性响应测量的实施〜几十帕斯卡的典型的可商购的细胞外基质的产品（牛胶原蛋白，EHS-肿瘤提取物或商业纳米纤维支架）。观察随机的，热驱动运动，即使在高数值孔径光学量化小型探头的位移，在本质上是限于这些相对较软的ECM环境的线性关系，但调查渴望探索更硬的材料可能能够适应这个协议通过探针光48或磁性捕获49与主动的操作使用。正弦E上的光学或磁性镊子探测样品中的单个点，并且不影响样品的完整性，这些技术也可能会被掺入到上述协议获得更加刚性的样品长度的测量。
重要的是要观察到其他细胞产生的力量也可能在不同时间尺度有助于示踪探测运动是很重要的。例如，在发生的时间和文化天的过程中细胞迁移过程中，一簇簇的探针将推拉由于细胞运动，它确实是这项议案的是利用在牵引力显微镜50,51。这是分析，以获得microrheology数据的热驱动探头的动作需要几秒钟，明确可分离时间尺度的顺序位置。同时，这也是事实，与牵引力相关的应力和应变的缓慢的动态特性可以促进局部变化流变36，该成像-B的强度ASED方法在于关联样品中视觉和流变学变化的能力。例如，在图3中，一个明显的基质浸润和细胞迁移活动是在这个迁移发生的时间与相关的近四个数量级的G中的变化“的有代表性的结果。
这里所描述的协议假定用户有权访问的显微镜用电动载物台，提供了样品的可再现的定位。不具有此仪器实验室使用的样品或样品载体的标记或其他视觉线索，以允许重复测量在相同的点仍然可以使点测量，但它很可能是难以实现的相同的再现性在定位中所示代表性的纵向测量在这里。对于以上这些有代表性的结果而言，定位于z轴被保持近似恒定。然而，协议腠LD也被修订，包括以创建样品的3D地图流变沿z轴额外的测量。该方法也可以被修改，以利用扫描激光共焦或者多光子技术的三维切片虽然扫描速度会对该访问的频率上限，可能会或可能不会成为问题对于给定的应用的限制。
在这种方法中，一个显著时间约束是由活细胞返回到培育箱的必要性罚款。没有时间推移气象站外壳，以控制温度，湿度和二氧化碳含量，图像采集时间必须最小化。即使有适当的设备，数据采集占用了大量的时间和数字存储，这两者都是受到实际的限制。比如，用显微镜和在本研究中使用的摄像头，这将需要约35小时，取大约4000视频需要来映射单一井在96井用100X物镜的视场之间没有空格板。这些因素强加的，可以逼真地将采集到的数据点的数量限制。详细程度，因此受到的时间可用于数据采集，数据存储空间和环境住房供应实行的实际限制。
量化变化的ECM流变性的能力，可进一步集成一起的基于成像的方法，在三维肿瘤模型17,18,52,53治疗响应的定量。在这两种方法所采用的多井三维模型培养体系表明了并行执行提供细胞毒性反应和机械环境的修改之间的相关性。这可以促进进一步的战略，明确目标的机械表型或阐明在这方面的能力的现有疗法的影响发展。这种洞察力可以是直接相关的一个pproaches通过密集富含胶原蛋白的肿瘤间质，以提高药物输送。例如，在这个协议的代表图示的背景下提出的在这里与体外胰腺肿瘤模型，基质降解的评价下列措施可以在筛选基质消耗的方案，一个日益重要的治疗模式为胰腺癌54中使用。
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Acknowledgments
我们非常感谢玛丽亚Kilfoil提供（开源共享MATLAB的粒子跟踪代码http://people.umass.edu/kilfoil/ ），以及由约翰·C·克罗克和Eric提供的较早的IDL代码和大量的文档R.周。这项工作之所以成为可能，由国家癌症研究所（NCI / NIH），K99CA155045和R00CA155045（PI：JPC）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine type 1 collagen | BD Biosciences, San Jose, CA | 354231 | |
| PANC-1 | American Type Cell Culture, Manassas, VA | CRL1469 | or other appropriate cell type |
| Fluorescent Microspheres | Life Technologies, Carlsbad, CA | 906906 | |
| Matrigel | BD Biosciences, Bedford, MA | 354230 | |
| Agarose | Fisher Bioreagents, Waltham, MA | C12H18O9 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents, Waltham, MA | NC0480985 | |
| 96-well Imaging plates | Corning Inc., Corning, NY | 3904 | |
| DMEM | Hyclone, Waltham, MA | SH30243.01 | or appropriate cell culture media |
| Zeiss AxioObsever Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | includes high-speed camera and imaging software | |
| MATLAB software | The Mathworks, Natick, MA |
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