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Bioengineering

कण ट्रैकिंग Microrheology 3 डी का उपयोग ट्यूमर मॉडल में बाह्य मैट्रिक्स कठोरता के अनुदैर्ध्य मापन

Published: June 10, 2014 doi: 10.3791/51302
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Physics, University of Massachusetts Boston
* These authors contributed equally

Summary

कण ट्रैकिंग microrheology गैर विध्वंस यों और स्थानिक 3 डी ट्यूमर मॉडल में बाह्य मैट्रिक्स यांत्रिक गुणों में परिवर्तन नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

यांत्रिक microenvironment ही remodeled और जटिल, दो तरह mechanosensitive बातचीत का एक सेट के भाग के रूप में संशोधित किया गया है जो ट्यूमर के विकास व्यवहार और संकेतन का एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में कार्य करने के लिए दिखाया गया है. जैविक प्रासंगिक 3D ट्यूमर मॉडल के विकास के ट्यूमर के विकास पर मैट्रिक्स rheology के प्रभाव पर यंत्रवत अध्ययनों में मदद की है, वहीं ट्यूमर से प्रेरित यांत्रिक वातावरण में मानचित्रण परिवर्तन की व्युत्क्रम समस्या चुनौती बनी हुई है. यहाँ, हम अनुलंबीय बगल में, ट्यूमर microenvironment में शारीरिक परिवर्तन की निगरानी के लिए एक मजबूत और व्यावहारिक दृष्टिकोण के भाग के रूप में अग्नाशय के कैंसर की 3 डी मॉडलों के साथ संयोजन के रूप में कण ट्रैकिंग microrheology (PTM) के कार्यान्वयन का वर्णन है. यहाँ वर्णित पद्धति के साथ fluorescently लेबल जांच समान रूप से पुलिस के लिए वितरित की एक मॉडल के बाह्य मैट्रिक्स मैं कोलेजन प्रकार की (ईसीएम) पाड़ में एम्बेडेड में इन विट्रो 3D मॉडल तैयार करने की एक प्रणाली को एकीकृतविपक्षी और नमूना भर में समय पर निर्भर microrheology माप. इन विट्रो ट्यूमर चढ़ाया और multiwell इमेजिंग प्लेट का उपयोग समानांतर स्थिति में जांच कर रहे हैं. स्थापित तरीकों पर आकर्षित, ट्रेसर जांच आंदोलनों की वीडियो जटिल आवृत्ति पर निर्भर viscoelastic कतरनी मापांक, जी * (ω) की रिपोर्ट के सामान्यीकृत स्टोक्स आइंस्टीन रिलेशन (GSER) के माध्यम से बदल रहे हैं. इस दृष्टिकोण इमेजिंग आधारित है, इसलिए यांत्रिक लक्षण वर्णन भी एक साथ 3 डी ट्यूमर के आकार और phenotype में गुणात्मक परिवर्तन रिपोर्ट करने के लिए बड़े प्रेषित प्रकाश स्थानिक क्षेत्रों पर मैप किया जाता है. स्थानीयकृत आक्रमण प्रेरित मैट्रिक्स गिरावट के साथ ही प्रणाली अंशांकन के साथ जुड़े उप क्षेत्रों में यांत्रिक प्रतिक्रिया विषम दिखा प्रतिनिधि परिणाम, सत्यापन डेटा प्रस्तुत कर रहे हैं. आम प्रयोगात्मक त्रुटियों और इन मुद्दों का निवारण से अवांछनीय परिणामों को भी प्रस्तुत कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल में लागू 96 अच्छी तरह से 3 डी संस्कृति चढ़ाना प्रारूप सी हैचिकित्सकीय स्क्रीनिंग assays या यांत्रिक microenvironment पर उपचार या जैव रासायनिक उत्तेजनाओं के प्रभाव में नए अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए आणविक इमेजिंग के साथ microrheology माप के सहसंबंध को onducive.

Introduction

यह कैंसर की कोशिकाओं, गैर घातक स्तनधारी उपकला कोशिकाओं के साथ ही, आसपास के बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) और अन्य सूक्ष्म घटकों 1-9 की मैकेनिकल और biophysical गुणों को अत्यधिक संवेदनशील होते हैं कि साहित्य में सबूत के एक बढ़ती शरीर से स्पष्ट है. सुरुचिपूर्ण यंत्रवत अध्ययनों घातक वृद्धि व्यवहार और morphogenesis 2,3,10,11 को नियंत्रित करता है कि एक जटिल mechanosensitive संकेतन भागीदार के रूप में बाह्य कठोरता की भूमिका में अंतर्दृष्टि प्रदान की है. इस काम के जैविक रूप से प्रासंगिक ऊतक वास्तुकला बहाल करने और ट्यून करने योग्य यांत्रिकी के साथ पाड़ सामग्री में वृद्धि हुई है और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी 12-19 ने उतारी जा सकता है कि इन विट्रो ट्यूमर मॉडल में 3 डी के विकास के द्वारा विशेष रूप से मदद की गई है. हालांकि, ट्यूमर और बदले में कैंसर की कोशिकाओं को अपने आसपास के rheology संशोधित जिसके माध्यम से सूक्ष्म, के बीच इस mechanoregulatory संवाद के दूसरी ओर, कुछ हद तक रहता हैअध्ययन करने के लिए और अधिक कठिन. उदाहरण के लिए, आक्रमण प्रक्रिया के दौरान, एक ट्यूमर की परिधि में कोशिकाओं में बारी की mechanosensitive वृद्धि व्यवहार को प्रभावित करती है जो ईसीएम 20-22, स्थानीय गिरावट का कारण है कि mesenchymal संक्रमण (EMT) को उपकला से गुजरना और मैट्रिक्स metalloproteases (एम एम पी) की अभिव्यक्ति को बढ़ा सकता है अन्य समीपस्थ ट्यूमर कोशिकाओं. जैव रासायनिक प्रक्रियाओं की एक किस्म के माध्यम से, कैंसर की कोशिकाओं को लगातार अलग अलग समय पर विभिन्न प्रक्रियाओं के अनुरूप करने के लिए ऊपर और नीचे अपने वातावरण के स्थानीय कठोरता डायल. यहाँ वर्णित पद्धति 3D ट्यूमर मॉडलों के साथ एकीकृत और संस्कृति को समाप्त किए बिना जैव रासायनिक और प्ररूपी परिवर्तन के साथ longitudinally सहसंबद्ध किया जा सकता है कि विकास के दौरान कठोरता और ईसीएम के अनुपालन में स्थानीय परिवर्तन, रिपोर्ट है कि विश्लेषणात्मक उपकरणों के लिए जरूरत से प्रेरित है.

इस संदर्भ में लागू करने के लिए एक उचित तकनीक की खोज में, कण ट्रैकिंग microrheology (PTM) एक मजबूत उम्मीदवार के रूप में उभर रहे हैं.इस विधि, मेसन और वेईत्ज़ 23,24 द्वारा मूल रूप से बीड़ा उठाया है, माइक्रोन लंबाई पैमाने पर आवृत्ति पर निर्भर जटिल viscoelastic कतरनी मापांक, जी * (ω) की रिपोर्ट के एक जटिल तरल पदार्थ में एम्बेडेड ट्रेसर जांच की गति का उपयोग करता है. यह सामान्य दृष्टिकोण नरम संघनित पदार्थ, कोलाइड, बायोफिज़िक्स और बहुलक भौतिकी 25-31 में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त कई बदलाव के साथ विकसित किया गया है. स्थानीय viscoelasticity के readouts संस्कृति तैयारी के समय में शामिल किया और विकास की विस्तारित अवधि से अधिक जगह में रहते हैं कि biochemically निष्क्रिय ट्रेसर जांच की गैर विनाशकारी वीडियो इमेजिंग द्वारा प्रदान की जाती हैं, क्योंकि PTM, अन्य तरीकों के सापेक्ष कुछ फायदे हैं. यह जरूरी संस्कृति की समाप्ति की आवश्यकता है और जटिल 3D ट्यूमर microenvir भीतर बिंदु माप के बजाय नमूना के थोक macroscopic rheology जो रिपोर्ट एक oscillatory कतरनी थोक Rheometer, साथ सोने के मानक माप के विपरीत हैonment. दरअसल अध्ययन का एक नंबर सेल प्रवास 32, एक विस्तार उपगोल 33, intracellular rheology 34,35 से प्रेरित यांत्रिक तनाव के साथ जुड़े विकृतियों को मापने के लिए या कैंसर या गैर कैंसर कोशिकाओं के आसपास ट्रेसर जांच आंदोलनों की माप की व्याख्या की उपयोगिता सचित्र, और है यांत्रिक तनाव और दबाव इंजीनियर के ऊतकों 36 में, और ध्यान में लीन होना आकार और आक्रमण गति 37 के बीच संबंध मैप करने के लिए. ऐसे परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) के रूप में microrheology के लिए उपयुक्त अन्य तकनीकों, कार्यान्वित किया जा सकता है, लेकिन मुख्य रूप से भी नमूना सतह पर अंक की जांच कर रही है और के लिए अनुदैर्ध्य माप 38 उलझा कि संस्कृति बाँझपन मुद्दों खड़ी हो सकती है.

यहाँ, हम मज़बूती से स्थानिक मानचित्रण के लिए वीडियो कण ट्रैकिंग और विश्लेषण के तरीकों के लिए एम्बेडेड फ्लोरोसेंट जांच के साथ ईसीएम में स्थानांतरण के लिए उपयुक्त 3D ट्यूमर spheroids के विकास के लिए तरीकों को शामिल एक व्यापक प्रोटोकॉल का वर्णनसंस्कृति में समय के साथ microrheology में बदल जाता है. वर्तमान कार्यान्वयन में, 3 डी ट्यूमर मॉडल इस प्रारूप के लिए अनुकूल है जो अन्य पारंपरिक assays (जैसे, cytotoxicity) के साथ microrheology माप के समावेश की दिशा में एक दृश्य के साथ multiwell प्रारूप में बड़े हो रहे हैं. PANC-1 कोशिकाओं का उपयोग इस पद्धति को हम संस्कृति में इन विट्रो 3D spheroids के इस प्रतिनिधि उदाहरण में, spheroids 39 है, लेकिन इस के साथ साथ वर्णित सभी मापन के लिए फार्म में जाना एक स्थापित अग्नाशय के कैंसर कोशिका लाइन सेल लाइनों की एक किस्म का उपयोग ठोस ट्यूमर का अध्ययन करने के लिए मोटे तौर पर लागू कर रहे हैं 3D संस्कृति के लिए उपयुक्त. इस विधि स्वाभाविक इमेजिंग आधारित है क्योंकि यह आदर्श सेल के विकास, प्रवास और phenotype में परिवर्तन है कि रिपोर्ट देखने की बड़ी प्रेषित प्रकाश क्षेत्रों के साथ उच्च संकल्प microrheology डेटा के सह पंजीकरण के लिए अनुकूल है. PTM के कार्यान्वयन खुर्दबीन मंच क की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थिति हो जाती है इस तरह से प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ एकीकृतआईसीएच मोटर चालित व्यावसायिक widefield epifluorescence जैविक सूक्ष्मदर्शी पर आम तौर पर उपलब्ध है. नीचे विकसित प्रोटोकॉल किसी भी हद सुसज्जित स्वचालित प्रतिदीप्ति जैविक खुर्दबीन के साथ लागू किया जा सकता है. इस ऑफ़लाइन प्रसंस्करण के लिए डिजिटल वीडियो माइक्रोस्कोपी डेटा के गीगाबाइट के अधिग्रहण की आवश्यकता है जो एक स्वाभाविक डेटा गहन विधि है.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल, प्रोटोकॉल 1 agarose पर ओवरले का उपयोग कर यहाँ वर्णित है, लेकिन इस तरह की फांसी ड्रॉप 40, या रोटरी संस्कृति 41 तकनीकों के रूप में अन्य तरीकों की एक किस्म के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जो ट्यूमर spheroids की प्रारंभिक तैयारी से संबंधित है. प्रोटोकॉल 2 वैकल्पिक रूप से, इन विट्रो 3D ट्यूमर encapsulation या resuspended कोशिकाओं के embedding ईसीएम 12,15 में है, बजाय एक पूर्व गठित गैर पक्षपाती spheroids द्वारा विकसित किया जा सकता है, हालांकि एक कोलेजन पाड़ में spheroids एम्बेड करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है. इसके बाद प्रोटोकॉल ओ के लिए प्रक्रियाओं का वर्णनक्रमशः, वीडियो माइक्रोस्कोपी डेटा प्राप्त करने और प्रसंस्करण द्वारा समय हल microrheology माप btaining. डाटा प्रोसेसिंग (देखें http://www.physics.emory.edu/, MATLAB का उपयोग मूल रूप से भी बड़े पैमाने पर अलग सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों के लिए विकसित किया गया है जो क्रोकर और Grier 42, द्वारा वर्णित एल्गोरिदम पर बनाया गया PTM के लिए खुला स्रोत दिनचर्या का इस्तेमाल कर रही है वर्णन किया गया है ~ हफ्तों / आईडीएल /).

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Protocol

1. संवर्धन ट्यूमर Spheroids

  1. एक 1% agarose समाधान प्राप्त करने के लिए agarose के 0.1 जी के साथ सेल संस्कृति ग्रेड पानी की 10 मिलीलीटर मिलाएं.
  2. एक 96 अच्छी तरह से थाली पर एक कुएं में agarose समाधान के 40 μl aliquoting से पहले 70 डिग्री सेल्सियस से ऊपर (एक मानक माइक्रोवेव में या एक हीटिंग प्लेट का उपयोग करके लगभग 14 सेकंड) के लिए हीट agarose समाधान.
  3. मानक तकनीक का उपयोग कोशिकाओं की कटाई, जबकि कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
  4. निलंबन में कोशिकाओं की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक hemacytometer का प्रयोग करें.
  5. 1,000 कोशिकाओं / एमएल सेल निलंबन पतला और अच्छी तरह से ठीक हो agarose बिस्तर युक्त करने के लिए इस कमजोर पड़ने के 100 μl जोड़ें.
  6. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक मशीन सेट में रातोंरात एक प्रकार के बरतन पर नमूना रखें.
  7. एक प्रकार के बरतन से नमूना निकालें और सेल संस्कृति मीडिया के 100 μl जोड़ें.
  8. वांछित व्यास तक पहुँच जाता है spheroids सेते हैं. उदाहरण के लिए, के बाद 9 दिन, एक सपाheroid व्यास में लगभग 450 मीटर होगी. इस समय के दौरान, ताजा वृद्धि मीडिया वेल्स को जोड़ा जा सकता है लेकिन इस अंडाकार आकृति को हटाने में परिणाम होगा के बाद से आकांक्षा से बचा जाना चाहिए.

2. ईसीएम में एंबेडेड 3D ट्यूमर Spheroids तैयारी

  1. एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर आवश्यक सामग्री के साथ एक काम स्टेशन तैयार करें.
  2. 25 भागों बाँझ पानी के लिए 2 भागों स्टॉक जांच (2% ठोस) जोड़कर कार्बोक्सिलेट संशोधित 1 माइक्रोन व्यास फ्लोरोसेंट ट्रेसर जांच का एक पतला मिश्रण तैयार करें.
  3. फ्रिज से 3.1 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय कोलेजन की एक बोतल निकालें और बर्फ पर जगह है.
  4. विभाज्य 125 एक खाली 2 मिलीलीटर शीशी में कोलेजन की μl.
  5. जांच वितरित करने के लिए संक्षेप में कोलेजन और भंवर युक्त शीशी को पतला ट्रेसर जांच समाधान के 50 μl जोड़ें.
  6. उचित सेल संस्कृति मीडिया 41 की कुल मात्रा के लिए फिनोल लाल (जो पीला हो जाएगा) युक्त के 235 μl जोड़ेंसंक्षेप में 205 मिलीलीटर (आधा कुल मात्रा) को हटाने और एक नया 2 मिलीलीटर शीशी में रखने से पहले 0 मिलीलीटर और भंवर. शीशी 1 ट्यूमर अंडाकार आकृति में शामिल होंगे और शीशी 2 एक नियंत्रण मिश्रण होगा.
  7. तटस्थ पीएच (फिनोल लाल युक्त संस्कृति मीडिया लाल करने के लिए वापस आ जाना चाहिए) को वापस समाधान लाने के लिए 1 शीशी को 1 एम NaOH के ~ 2 μl जोड़ें. इस मिश्रण यह बर्फ पर नहीं रखा जाता है तो इलाज शुरू करने के लिए कारण होगा कि ध्यान दें. मिश्रण करने के भंवर संक्षिप्त, तो तुरंत बर्फ रैक पर लौटें.
    नोट: उपगोल संस्कृति और agarose बिस्तर से हटाने के 9 दिनों के बाद एक नाजुक काम है नंगी आंखों से मुश्किल से दिखाई दे रहा है. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल की कुछ उपयोगकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है. स्थानांतरण के दौरान अंडाकार आकृति की अखंडता को बनाए रखने के लिए सर्वोपरि है.
  8. एक चौड़े मुंह विंदुक टिप का उपयोग करना, धीरे अच्छी तरह से ट्यूमर अंडाकार आकृति युक्त से मीडिया के 40 μl हटा दें. अगले कदम का आयोजन करते हुए इस 40 μl को बनाये रखें.
  9. देखने के लिए अच्छी तरह से जांच उपगोलपिछले चरण में हटा दिया गया था. अगर यह था, 1 शीशी अंडाकार आकृति युक्त 40 μl जोड़ें. यदि नहीं, तो वापस कुएं में 40 μl जगह है और पिछले चरण दोहराएँ.
  10. धीरे से एक 96 अच्छी तरह से थाली के तीन अलग कुओं में 60 μl भागों में मिश्रण स्थानांतरित करने से पहले (यह अंडाकार आकृति को नुकसान पहुंचा सकता है, vortexing खतरा नहीं है) शीशी 1 हलचल. अच्छी तरह से अंडाकार आकृति होता है जो निर्धारित करने के लिए मिश्रण को जोड़ने के बाद एक खुर्दबीन के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक का निरीक्षण किया.
  11. जोड़ें ~ 2 μl 1 एम NaOH और 40 शीशी 2 के लिए सेल संस्कृति मीडिया की μl और एक नियंत्रण के रूप में 96 अच्छी तरह से थाली और लेबलिंग में अच्छी तरह से एक खाली करने के लिए इस मिश्रण की 60 μl aliquotting से पहले भंवर.
  12. कम से कम 1 घंटे के लिए इलाज करने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली प्लेस.

3. नमूना अंक का ग्रिड का निर्माण और प्रत्येक बिंदु पर एक वीडियो ले

  1. खुर्दबीन मंच को इनक्यूबेटर से नमूना प्लेट हस्तांतरण. नमूने के लिए 10 मिनट equil करने की अनुमति देंएक गर्म मंच उपलब्ध नहीं है अगर कमरे के तापमान के साथ ibrate.
  2. यकीन है कि यह बरकरार है और इमेजिंग के लिए तैयार है बनाने के लिए कम संचालित उद्देश्य लेंस के साथ नमूना निरीक्षण करें. अच्छी तरह से भीतर ट्यूमर की स्थिति का निर्धारण करते हैं.
  3. लेने के लिए कितने नमूना अंक फैसला. आमतौर पर, अंडाकार आकृति के चारों ओर गाढ़ा के छल्ले में वितरित प्रत्येक कुएं में 20 नमूना अंक, पर्याप्त रूप से विस्तृत परिणाम देगा.
  4. प्रत्येक इच्छित स्थान के लिए मंच ले जाएँ और एक्स और वाई निर्देशांक (या सॉफ्टवेयर interfacing अनुपलब्ध है अगर रिकॉर्ड को मैन्युअल निर्देशांक) दर्ज करने के लिए माइक्रोस्कोप interfacing सॉफ्टवेयर का उपयोग करें.
  5. एक उच्च स्तरीय उद्देश्य लेंस (आमतौर पर 100x) को माइक्रोस्कोप जाएँ, और दरियाफ्त जांच की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के लिए उपयुक्त फिल्टर क्यूब का चयन करें. ग्रिड में पहला बिंदु को स्थानांतरित करने के लिए कदम 3.4 में बनाया अंक की सूची का उपयोग करें.
  6. अच्छी तरह से नीचे खोजने के लिए ध्यान समायोजित, तो (FOV) कई में फोकस Trac युक्त देखने के एक क्षेत्र को खोजने के लिए ऊपर ले जाएँजांच एर.
  7. तीव्रता हिस्टोग्राम निरीक्षण करें और छवि संतृप्त नहीं हो जाता कि यह सुनिश्चित करते हुए सबसे बड़ी गतिशील रेंज संभव देने के लिए जोखिम तीव्रता और समय समायोजित करें.
  8. फ्रेम प्रति 20-30 मिसे के एक फ्रेम दर पर एक वीडियो अनुक्रम प्राप्त (लगभग 800 फ्रेम या लंबाई में 16-24 सेकंड प्रत्येक स्थानिक ग्रिड बिंदु पर अधिग्रहण के समय को कम करने के लिए जरूरत के साथ संतुलित मजबूत एमएसडी गणना के लिए पर्याप्त आंकड़े उपलब्ध कराने की सिफारिश की है) और एक उचित सम्मेलन के साथ बचा. रिकॉर्डिंग के दौरान, माइक्रोस्कोप या मेज पर नहीं टिकते.
  9. दोहराएँ ग्रिड में प्रत्येक नमूना बिंदु के लिए 3.6-3.9 कदम.
  10. दोहराएँ प्रयोग में प्रत्येक के लिए अच्छी तरह 3.3-3.10 कदम.

4. प्रत्येक नमूने प्वाइंट पर rheological गुण गणना करने के लिए वीडियो डेटा का विश्लेषण

  1. (संभवतः एक अलग कंप्यूटर पर) एक विश्लेषण फ़ोल्डर में सभी वीडियो डेटा की प्रतिलिपि.
  2. MATLAB में आयात छवि डेटा या अन्य विश्लेषण सॉफ्टवेयर.
    कोईते: यहाँ अपनाया MATLAB कण ट्रैकिंग दिनचर्या के सेट के बारे में व्यापक प्रलेखन पर उपलब्ध है http://people.umass.edu/kilfoil . विभिन्न पदों पर एकाधिक फ़ाइलों का प्रसंस्करण स्वचालित के लिए एक कस्टम फोन समारोह का उपयोग की सिफारिश की है.
  3. उचित जांच केन्द्र पदों की पहचान करने के लिए चयन और अस्वीकृति मानकों (आकार, bandpass, आदि) निर्धारित करने के लिए वीडियो के कई फ्रेम का विश्लेषण करके सॉफ्टवेयर जांचना. इन महत्वपूर्ण कदम के लिए व्यापक पृष्ठभूमि क्रोकर और Grier द्वारा वर्णित है.
  4. स्वचालित रूप से सभी वीडियो फ्रेम के लिए हर जांच की स्थिति का निर्धारण और फिर प्रक्षेप पथ में इन पदों से जोड़ने के लिए सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
  5. आदि विशिष्ट उद्देश्य लेंस, किसी भी पिक्सेल binning, के लिए उपयुक्त स्थानिक अंशांकन कारक (पिक्सेल प्रति माइक्रोन) लागू करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा, समय अंतराल के एक समारोह के रूप में मतलब चुकता विस्थापन (एमएसडी) की गणना करने के प्रक्षेपवक्र डेटा का उपयोग करें (आमतौर पर किया जाता हैमेटा डेटा में).
  6. एक विशेष नमूना 24,28,43 के लिए GSER की प्रयोज्यता की सीमा. वैकल्पिक रूप से, उपयोगकर्ताओं को केवल शक्ति कानून स्केलिंग, पठार की तुलना द्वारा एमएसडी से सीधे ईसीएम गुणों की व्याख्या करने के लिए इच्छा हो सकती है ध्यान में रखा सामान्यीकृत स्टोक्स आइंस्टीन संबंध का उपयोग जी * (गणना करें विविधता या अन्य मानकों के मूल्यों, सूचकांक.
  7. दोहराएँ प्रयोग में प्रत्येक FOV के लिए 4.6 के माध्यम से 4.2 कदम.
  8. ब्याज की एक विशेष आवृत्ति में viscoelastic मापांक साथ 3.4 कदम से स्थिति डेटा सह रजिस्टर. इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप के निर्माता पर निर्भर करता है, इस कदम माइक्रोस्कोप मेटाडेटा या स्थिति डेटा को मैन्युअल सारणीबद्ध किया जा सकता है जो पढ़ता एक कस्टम दिनचर्या से मदद की जा सकती है.
  9. ईसीएम के एक स्थानिक rheology नक्शा उत्पन्न करने के लिए 3 डी प्रक्षेप कार्यों का प्रयोग करें.

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Representative Results

जी * एक जटिल मॉडल ट्यूमर microenvironment भीतर स्थानीयकृत पदों पर (ω) माप की वैधता सत्यापित करने के लिए, दो प्रारंभिक मान्यता प्रयोगों का आयोजन किया गया. सबसे पहले, हम थोक oscillatory कतरनी rheometry की "सोने के मानक 'के खिलाफ हमारे माप को मान्य करने की मांग की. हम 1.0 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन की एकाग्रता में (कोशिकाओं) के बिना कोलेजन मैट्रिक्स के समान नमूने तैयार. इन नमूनों ("(इस प्रोटोकॉल भर के रूप में एक ही मापदंड का प्रयोग करके) और जी के परिणामस्वरूप माप '(ω) और जी एक थोक rheometer (40 मिमी समानांतर थाली ज्यामिति का उपयोग टीए उपकरण AR-G2,) के साथ और PTM द्वारा जांच किए गए ω ) (2A चित्रा) की तुलना में थे. उत्कृष्ट समझौता दो मापन के बीच पाया गया. दूसरे, हम एक 1.0 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन मैट्रिक्स और एम्बेडेड ट्रेसर मोती तैयार ईसीएम rheology में बिंदु में परिवर्तन को मापने के लिए इस प्रोटोकॉल की क्षमता स्थापित करने के लिए. नमूना फिर एक साथ इलाज किया गया थातेजी से कोलेजन हज़म जो 5 μl dispase (चित्रा 2 बी), के केंद्रीकृत इंजेक्शन. स्थानीय कोलेजन पाचन होने के लिये अनुमति देने के लिए 3 घंटे के लिए incubating के बाद ", वीडियो डेटा इंजेक्शन साइट से बदलती दूरी पर ले जाया गया था, और जी के माप '(ω) और जी (ω) प्रत्येक मामले में किए गए थे. जी का परिमाण "(ω = 1 रेड / सेक) इंजेक्शन स्थल पर (ω = 1 रेड / सेक) 'जी की तुलना में बड़ा हो पाया था. इंजेक्शन साइट से बढ़ती दूरी पर माप लिया जी * के एक बढ़ती हुई परिमाण, साथ ही जी जी की एक बढ़ती हुई अनुपात '"(चित्रा -2) है पाया गया. ~ 2 मिमी की अत्यधिक अपमानित क्षेत्र के आकार η = 10 के चिपचिपाहट के साथ पचा कोलेजन के माध्यम से hydrodynamic त्रिज्या आर एच = 1 एनएम के साथ एक प्रोटीन के प्रसार की अनुमानित दूरी (dispase की आणविक वजन 32.5 केडीए है) के साथ संगत है - 3 पा · 37 डिग्री सेल्सियस पर सेक: . इसलिए परिणाम इंजेक्शन स्थल के निकट मैट्रिक्स की उम्मीद नरमी के साथ सहमत हैं, और मैट्रिक्स rheology के सही, स्थानीय मापन करने के लिए हमारी क्षमता प्रदर्शित करता है.

इस प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार एक 3 डी ट्यूमर मॉडल से प्रतिनिधि डेटा. वीडियो डेटा ट्यूमर के आसपास किसी न किसी ग्रिड (चित्रा 3) के गठन, कोलेजन पाड़ के भीतर 19 तय स्थानों पर एकत्र किया गया था 3 चित्र में दिखाया गया है. इस डेटा समन्वय ईसीएम कठोरता (3B चित्रा) की एक स्थानिक नक्शा बनाने के लिए जी का मूल्यों की गणना '(ω) के साथ जोड़ दिया गया था. इस स्थानिक नक्शा स्पष्ट रूप से कोलेजन चतुर्थ, laminin वी एक के बयान के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है जो दिन 2 में ट्यूमर अंडाकार आकृति, को तुरंत समीपस्थ बढ़ कठोरता का एक क्षेत्र का पता चलता हैडी अन्य तहखाने झिल्ली घटक उपगोल ही 17,18,44,45, या विस्तार के अंडाकार आकृति से ईसीएम के स्थानीय संपीड़न द्वारा जमा.

ट्यूमर के विकास और मैट्रिक्स आक्रमण की घटनाओं 4 दिनों में निगरानी की गई. दोनों क्षेत्रों में कोई ट्यूमर परिधि में आक्रामक कोशिकाओं का सबूत है, या कोशिकाओं (चित्रा -3 सी) पर हमले की स्पष्ट सबूत या तो होने के रूप में पहचान की गई. PTM माप क्षेत्रों 1 और 2 पर 4 दिनों में ले जाया गया. सुबह 4 से, दोनों क्षेत्रों (चित्रा 3 डी) के बीच (1 रेड / सेकंड में रिपोर्ट) जी में एक महत्वपूर्ण अंतर 'नहीं था. क्षेत्र 2, आक्रामक क्षेत्र (चित्रा 3E) पर ईसीएम के 4 दिन शो महत्वपूर्ण नरमी पर क्षेत्रों 1 और 2 के लिए जी 'और जी "की आवृत्ति पर निर्भर माप. 4 दिन क्षेत्र में दो दर्शाती है जी "साजिश (चित्रा 3E) का चिपचिपा स्केलिंग से स्पष्ट एक तरल की तरह viscoelastic प्रतिक्रिया,.

उप इष्टतम प्रतिनिधिआम प्रयोगात्मक और विश्लेषण त्रुटियों से परिणाम चित्रा 4 में दिखाया गया. शायद त्रुटि का सबसे स्पष्ट स्रोत वीडियो माइक्रोस्कोपी किया जाता है जिस पर सेटअप की स्थिरता में निहित है. प्रयोगशाला बेंच विस्थापित है या कंपन के कुछ अन्य बाहरी स्रोत है, तो मनका trajectories कृत्रिम रूप से डेटा में एक बहाव में जो परिणाम को प्रभावित किया जा सकता है. बहाव एमएसडी उच्च अंतराल समय पर नाटकीय रूप से भी 'जी का कारण बनता है जो (चित्रा -4 ए) (ω) को बढ़ाने के लिए और जी "(ω) मूल्यों की गणना कम आवृत्तियों (चित्रा 4 बी) में तेजी से वृद्धि का कारण बनता है. बहाव एक साँस, हवा तकिये प्रयोगशाला बेंच के उपयोग के माध्यम से कम, और बस वीडियो रिकॉर्ड किया जा रहा है, जबकि सेटअप टक्कर नहीं करने के लिए ध्यान रखने से किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, बहाव सॉफ्टवेयर दिनचर्या का उपयोग कर पोस्ट प्रोसेसिंग के दौरान हटाया जा सकता है. ये दिनचर्या लगभग एक ज्ञात समय अंतराल पर एक समान है जो बहाव को दूर करने के लिए उपयुक्त हैं. अनियमित बहाव (शायद कारण बना) डाटा अधिग्रहण के दौरान मंच bumping से अधिक समस्याग्रस्त है. इसलिए यह नमूना डेटा संग्रह के दौरान पर्यावरण से यंत्रवत् अलग रहता है कि यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है.

स्पष्ट नहीं परिणामों के एक अन्य संभावित स्रोत नमूना विविधता की अनुचित व्याख्या से आता है. एक नमूने में स्थानिक विविधता का निरीक्षण और यों क्षमता वास्तव में PTM 26 (पारंपरिक थोक rheology माप में खो जाता है और कुछ और) के विख्यात शक्तियों में से एक है, जांच trajectories के समूहों के अनुचित समूहीकरण गलत निष्कर्ष करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. सामग्री ही देखने के किसी भी क्षेत्र में है, के रूप में इस पद्धति द्वारा रिपोर्ट ईसीएम कठोरता में परिवर्तन स्वाभाविक विषम रहे हैं यह देखते हुए कि, लचीलेपन से कोलेजन फाइबर द्वारा ही सीमित है और stochastically बड़ा पानी का पता लगाने के लिए इस तरह मुक्त नहीं कर रहे हैं कि कुछ दरियाफ्त जांच हो सकती है pores (चित्रा 4C) से भरे. ये "ढीला" जांच प्रदर्शनी एमobility एक विशुद्ध रूप से चिपचिपा पर्यावरण के साथ लगभग संगत. सारे जांच के लिए डेटा औसत निकाला जाता है के बाद से viscoelastic moduli गणना कर रहे हैं, इससे पहले कि किसी दिए गए नमूने क्षेत्र में कुछ ढीली जांच (मद्देनजर क्षेत्र) होने (चित्रा 4D) बेतहाशा भिन्न हो कि जी * (ω) की आवृत्ति निर्भर भूखंडों का उत्पादन कर सकते हैं.

अनुचित सॉफ्टवेयर अंशांकन वीडियो संग्रह और विश्लेषण के दौरान त्रुटियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. वीडियो डेटा संग्रह के दौरान, यह तीव्रता हिस्टोग्राम निरीक्षण और छवि संतृप्त नहीं हो जाता कि यह सुनिश्चित करते हुए सबसे बड़ी गतिशील रेंज संभव देने के लिए जोखिम समय समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है. विश्लेषण प्रत्येक पिक्सेल की तीव्रता मूल्य को एकीकृत करके प्रत्येक ट्रेसर जांच के लिए परिष्कृत केंद्र पदों की गणना. छवि संतृप्त है, तो इस एकीकरण के कारण तीव्रता प्रोफाइल के एक 'फ्लैट टॉप' अनुभाग को कम सटीक होंगे. इसके अतिरिक्त, सुविधा ढूँढने अंशांकन सटीक परिणाम सुनिश्चित करने में एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है. चयन मापदंडों का उचित विकल्प सर्वोपरि है. इस प्रक्रिया क्रोकर और Grier 42, Savin और डोयले 43, और दूसरों के द्वारा बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रायोगिक प्रक्रिया के योजनाबद्ध. (ए) ट्यूमर spheroids agarose बेड पर गठित, और फिर एम्बेडेड ट्रेसर जांच युक्त एक 3 डी मैट्रिक्स में स्थानांतरित कर रहे हैं. (बी) वीडियो डेटा बहुत दूर ट्यूमर अंडाकार आकृति से करने के लिए आसन्न और दोनों, अच्छी तरह से नमूना भीतर कई जगहों पर ले जाया जाता है. (सी) प्रत्येक वीडियो में जांच के stochastic गति प्रत्येक नमूना बिंदु पर मैट्रिक्स के स्थानीय rheological गुण निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया है. इस डेटा अच्छी तरह से भर ईसीएम कठोरता की एक स्थानिक मानचित्रण में संकलित किया है.ad/51302/51302fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
माप की चित्रा 2. सत्यापन. (ए) जी * (ω) के घटक यहाँ दिखाए जाते हैं. PTM का उपयोग जी के मूल्यों की गणना '(ω) और जी "(ω) एक थोक rheometer के माध्यम से प्राप्त उन लोगों के लिए बहुत समान हैं. (बी) dispase के 5 μl जी * (ω) में स्थानिक परिवर्तन को मापने के लिए 1.0 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन युक्त त्रिज्या r = 8.5 मिमी के साथ एक अच्छी तरह से केंद्र को जोड़ा गया है. Dispase इंजेक्शन के स्थल, साइट से 1.5 मिमी, और साइट से 3 मिमी (सी) की गणना जी के मूल्यों '(ω) और जी "(ω). इसके अतिरिक्त, एक नियंत्रण माप एक ही कोलेजन जेल बी युक्त एक कुएं में बनाया गया थाकोई dispase उपचार के साथ ut. उपचार साइट जी '(ω) (ω) "जी से छोटी है पास. जेल (ω) (ω) "जी से भी बड़ा बन उपचार साइट जी का मान 'से आगे नमूना, और जी * के परिमाण (ω) बढ़ जाती है के रूप में. माप dispase इंजेक्शन के बाद 2.5 घंटा ले जाया गया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. स्थानीय मैट्रिक्स आक्रमण की शुरुआत के साथ ईसीएम rheology सहवर्ती में परिवर्तन बढ़ाता. (ए) अच्छी तरह से एक PANC -1 3 डी अंडाकार आकृति युक्त ट्यूमर के आसपास कोलेजन ईसीएम भर में कई स्थानों पर जांच की है. (बी) के समन्वय डेटा सी के साथ संयुक्त हैalculated जी '(ω) प्रत्येक स्थान के लिए एक स्थानिक ईसीएम कठोरता नक्शा निर्माण करने के लिए. (सी) ट्यूमर के विकास और आक्रमण व्यवहार 4 दिनों में निगरानी की गई. दोनों क्षेत्रों के कोई हमलावर कोशिकाओं के साथ बातचीत (क्षेत्र 1, नीला तारांकन) या अनायास बड़े प्राथमिक बहुकोशिकीय अंडाकार आकृति द्रव्यमान (क्षेत्र 2, लाल तारांकन) से बाहर branched जो कोशिकाओं पर हमला करने के साथ भारी बातचीत या तो होने के रूप में पहचान की गई. (डी) Rheological माप क्षेत्रों 1 और 2 पर 4 दिनों में ले जाया गया. चौथे दिन तक, दोनों क्षेत्रों के बीच (1 रेड / सेकंड में रिपोर्ट) जी में एक महत्वपूर्ण अंतर 'नहीं था. ठीक आक्रामक आबादी की उपस्थिति के साथ सहसंबद्ध क्षेत्र 2 में ईसीएम, के 4 दिन शो महत्वपूर्ण नरमी पर क्षेत्रों 1 और 2 के लिए (ई) आवृत्ति निर्भर जी की माप '(ω) और जी "(ω). जी '(ω) और भरा और बिंदु जोड़कर unfilled के रूप में जी "एमएसडी डेटा के लिए एक बिजली कानून फिट उपयोग कर की गणना (ω) मान दिखाए जाते हैंpectively. दिन 4, क्षेत्र दो कलाकृतियों पर के रूप में एक तरल की तरह viscoelastic प्रतिक्रिया जी "(ω) साजिश और जी के लिए फिट रेखा '(ω) की अनुपस्थिति का चिपचिपा स्केलिंग से स्पष्ट है. का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा.

चित्रा 4
चित्रा 4. डाटा बहाव की वजह से और ईसीएम विविधता की गलत व्याख्या उप इष्टतम परिणामों से. (ए) एक जटिल सामग्री में कैद एक अनुरेखक जांच की एमएसडी ~ τ α (शक्ति कानून स्केलिंग <Δr 2 (τ)> निम्नानुसार 0 ≤ α ≤ 1). तदनुसार, एमएसडी मूल्यों लंबे अंतराल समय पर एक पठार से संपर्क करना चाहिए. नमूने में बहाव कृत्रिम रूप से इस व्यवहार, एल समाप्त कर सकते हैंलंबे अंतराल समय पर एमएसडी मूल्यों तना को eading. (बी) एमएसडी में लंबे समय अंतराल के बहाव 'जी के मूल्यों का कारण होगा (ω) और जी "(ω) कम आवृत्तियों पर काफी गलत हो जाते हैं. बहाव नमूना यंत्रवत् डेटा संग्रह के दौरान अलग है कि यह सुनिश्चित करने के द्वारा या विश्लेषण के दौरान बहाव को दूर करने के लिए सॉफ्टवेयर दिनचर्या का उपयोग करके या तो समाप्त या कम किया जा सकता है. (सी) भी देखने के एक छोटे से क्षेत्र में, जांच trajectories के दो अलग किस्मों मौजूद हो सकता है. इस उदाहरण में, जांच के सबसे मैट्रिक्स में ही सीमित है, लेकिन कुछ 'ढीला' कर रहे हैं - उनके trajectories बहुत कम विवश कर रहे हैं. (डी) दोनों विवश और नमूना विविधता की उचित व्याख्या के बिना एक ही समय में स्वेच्छापूर्ण जांच viscoelastic moduli की माप उलझाना होगा से एमएसडी डेटा की व्याख्या करने का प्रयास. कृपया सीएलआईइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए सी.के..

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में हम अनुलंबीय 3D ट्यूमर मॉडल में ईसीएम कठोरता में स्थानीय परिवर्तन पर नज़र रखने के लिए एक मजबूत और व्यापक रूप से लागू रणनीति परिचय. हम इस पद्धति को ट्यूमर के विकास और आक्रमण की प्रक्रिया के दौरान मैट्रिक्स remodeling में फंसा mechanosensitive व्यवहार में रुचि कैंसर जीव और biophysicists द्वारा अपनाया जा सकता है कि कल्पना. मैट्रिक्स गिरावट कैनेटीक्स की सटीक मात्रा का ठहराव सीधे मैट्रिक्स remodeling के लिए जुड़े हुए हैं कि 3 डी ट्यूमर मॉडल में मैट्रिक्स metalloproteases, lysyl ऑक्सिडेज़ या अन्य प्रासंगिक जैव रासायनिक प्रजातियों की गतिविधि का अध्ययन करने वालों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है. 3 डी ट्यूमर मॉडलों के लिए आवेदन यहाँ वर्णित के अलावा, एक और समय के साथ मैट्रिक्स rheology के संशोधन महत्वपूर्ण भूमिकाओं 46,47 निभाता है जिसमें अन्य रोग मॉडल प्रणाली के साथ संयोजन के रूप में इस दृष्टिकोण के कार्यान्वयन कल्पना कर सकता है. इस विधि की उपयोगिता सॉफ्टवेयर में सुधार के माध्यम से बढ़ाया जा जारी है और आगे आटोमैटिकप्रक्रिया ई और बढ़ा throughput के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं. इस बहु - अच्छी तरह स्वरूपों में उपयोग के लिए एक साथ कई नमूनों की भौतिक परिदृश्य, के तेजी से विस्तृत फोटो का परिणाम देगा.

यहाँ हम विशेष रूप से की श्रृंखला में रैखिक viscoelastic प्रतिक्रिया की माप के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है जो 3 डी ट्यूमर मॉडल में निष्क्रिय कण ट्रैकिंग microrheology, के कार्यान्वयन का वर्णन ~ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बाह्य मैट्रिक्स उत्पादों (गोजातीय कोलेजन, EHS ट्यूमर के अर्क के ठेठ पास्कल के दसियों या वाणिज्यिक nanofiber scaffolds). स्टोकेस्टिक का अवलोकन, छोटे जांच विस्थापन यों को भी उच्च संख्यात्मक एपर्चर प्रकाशिकी के साथ thermally संचालित गति, स्वाभाविक इन अपेक्षाकृत नरम ईसीएम वातावरण के रैखिक शासन तक ही सीमित है, लेकिन और अधिक कठोर सामग्री की जांच करने के लिए इच्छुक जांचकर्ताओं इस प्रोटोकॉल अनुकूलन करने में सक्षम हो सकता है जांच के 48 ऑप्टिकल या चुंबकीय फँसाने 49 के माध्यम से सक्रिय जोड़तोड़ के साथ प्रयोग के लिए. Sincई ऑप्टिकल या चुंबकीय चिमटी एक नमूना के भीतर एक एकल बिंदु की जांच और नमूने की अखंडता को प्रभावित नहीं करते, इन तकनीकों संभवतः अधिक कठोर नमूने के अनुदैर्ध्य माप प्राप्त करने के लिए ऊपर प्रोटोकॉल में शामिल किया जा सकता है.

यह अन्य सेल उत्पन्न बलों को भी विभिन्न समय के तराजू पर ट्रेसर जांच आंदोलनों के लिए योगदान कर सकते हैं कि निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, घंटे और संस्कृति में दिन के कोर्स पर होने वाली सेल प्रवास के दौरान, जांच के समूहों को धक्का दिया और खींच लिया वजह से सेल आंदोलनों के लिए है और यह वास्तव में कर्षण बल माइक्रोस्कोपी 50,51 में उपयोग किया जाता है कि इस प्रस्ताव है किया जाएगा. microrheology डेटा प्राप्त करने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं जो thermally प्रेरित जांच आंदोलनों सेकंड, एक स्पष्ट रूप से वियोज्य समय के पैमाने के आदेश पर जगह ले लो. यह कर्षण बलों के साथ जुड़े तनाव और दबाव की धीमी गतिशीलता rheology 36, इस इमेजिंग बी की एक ताकत में स्थानीय परिवर्तन करने के लिए योगदान कर सकते हैं कि यह भी सच हैased दृष्टिकोण नमूने में दृश्य और rheological परिवर्तन सहसंबंधी करने की क्षमता में निहित है. एक स्पष्ट मैट्रिक्स आक्रमण और सेल प्रवास घटना इस माइग्रेशन जगह लगने वाले समय के दौरान परिमाण के लगभग चार आदेश के जी में एक परिवर्तन 'के साथ जोड़ा जाता है चित्रा 3, में प्रतिनिधि परिणामों में उदाहरण के लिए.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं नमूना की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थिति प्रदान करता है कि एक मोटर चालित मंच के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग किया है कि मानता है. के रूप में दिखाया यह संभावना स्थिति में एक ही reproducibility हासिल करना मुश्किल होगा, हालांकि इस उपकरण की जरूरत नहीं है कि लैब्स अभी भी, एक ही बिंदु पर दोहराया माप अनुमति देने के लिए नमूना या नमूना वाहक में निशान या अन्य दृश्य cues का उपयोग बिंदु माप कर सकता है यहाँ प्रतिनिधि अनुदैर्ध्य माप. Z-अक्ष पर स्थान ऊपर इन प्रतिनिधि परिणाम के उद्देश्यों, लगभग स्थिर रखा गया था. हालांकि, प्रोटोकॉल couएलडी भी नमूने के एक 3 डी rheological नक्शा बनाने के क्रम में Z-अक्ष के साथ अतिरिक्त माप शामिल करने के लिए संशोधन किया. विधि भी एक स्कैनिंग लेजर confocal या स्कैन गति या किसी दिए गए आवेदन के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता है और नहीं है कि सुलभ ऊपरी आवृत्ति सीमा पर एक सीमा लागू होगा, हालांकि सेक्शनिंग 3 डी के लिए एक multiphoton तकनीकों का उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

इस विधि में, एक महत्वपूर्ण समय की कमी इनक्यूबेटर में कोशिकाओं रहते लौटने की आवश्यकता द्वारा लगाया गया है. तापमान, नमी, और सीओ 2 का स्तर के लिए नियंत्रित करने के लिए एक समय चूक मौसम स्टेशन बाड़े बिना, छवि अधिग्रहण के समय कम से कम किया जाना चाहिए. यहां तक ​​कि उचित उपकरण के साथ, डेटा संग्रह दोनों व्यावहारिक सीमाओं के अधीन हैं जो समय और डिजिटल स्मृति की बड़ी मात्रा में, ऊपर ले जाता है. उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोप और इस अध्ययन में इस्तेमाल कैमरे के साथ, यह एक 96 पर एक भी अच्छी तरह से नक्शा करने के लिए आवश्यक मोटे तौर पर 4000 वीडियो लेने के लिए मोटे तौर पर 35 घंटे के लिए ले जाएगाअच्छी तरह देखने के क्षेत्रों के बीच कोई अंतरिक्ष के साथ एक 100X उद्देश्य लेंस का उपयोग थाली. इन कारकों वास्तविक एकत्र किया जा सकता है कि डेटा बिंदुओं की संख्या पर बाधाओं लागू. विस्तार के स्तर, डेटा संग्रह, डेटा भंडारण अंतरिक्ष और एक पर्यावरण के आवास की उपलब्धता के लिए उपलब्ध समय से लगाया व्यावहारिक बाधाओं को इसलिए अधीन है.

ईसीएम rheology में बदलाव यों क्षमता आगे 3D ट्यूमर मॉडल 17,18,52,53 में चिकित्सकीय प्रतिक्रिया की मात्रा का ठहराव के लिए इमेजिंग आधारित विधियों के साथ एकीकृत किया जा सकता है. दोनों तरीकों में अपनाया बहु अच्छी तरह से 3 डी मॉडल संस्कृति प्रणाली साइटोटोक्सिक प्रतिक्रिया और यांत्रिक पर्यावरण के संशोधन के बीच के संबंध को उपलब्ध कराने के लिए एक समानांतर कार्यान्वयन पता चलता है. यह स्पष्ट रूप से यांत्रिक फेनोटाइप को लक्ष्य या इस क्षमता में मौजूदा चिकित्सा विज्ञान के प्रभाव को स्पष्ट है कि आगे की रणनीतियों के विकास की सुविधा सकता है. ऐसे अंतर्दृष्टि एक के लिए प्रासंगिक हो सकता हैघने कोलेजन युक्त ट्यूमर स्ट्रोमा के माध्यम से दवा वितरण बढ़ाने के लिए pproaches. उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि चित्रण के संदर्भ में हस्तक्षेप स्ट्रोमल कमी regimens, अग्नाशय के कैंसर के 54 के लिए एक तेजी से महत्वपूर्ण चिकित्सीय प्रतिमान स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया जा सकता है, निम्नलिखित में इन विट्रो अग्नाशय के ट्यूमर मॉडलों के साथ यहां मैट्रिक्स गिरावट के मूल्यांकन प्रस्तुत किया.

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Acknowledgments

हम कृतज्ञता (मारिया Kilfoil द्वारा प्रदान MATLAB कण ट्रैकिंग कोड के खुले स्रोत साझा करने को स्वीकार करते हैं http://people.umass.edu/kilfoil/ ), जॉन सी. क्रोकर और एरिक द्वारा प्रदान की पहले आईडीएल कोड और व्यापक प्रलेखन के साथ आर सप्ताह. यह काम राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (NCI / एनआईएच), K99CA155045 और R00CA155045 (जेपीसी पीआई) से धन द्वारा ही संभव बनाया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine type 1 collagen BD Biosciences, San Jose, CA 354231
PANC-1 American Type Cell Culture, Manassas, VA CRL1469 or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres Life Technologies, Carlsbad, CA 906906
Matrigel BD Biosciences, Bedford, MA 354230
Agarose Fisher Bioreagents, Waltham, MA C12H18O9
NaOH Fisher Bioreagents, Waltham, MA NC0480985
96-well Imaging plates Corning Inc., Corning, NY 3904
DMEM Hyclone, Waltham, MA SH30243.01 or appropriate cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software The Mathworks, Natick, MA

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जैव अभियांत्रिकी अंक 88 viscoelasticity mechanobiology बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) मैट्रिक्स remodeling 3 डी ट्यूमर मॉडल ट्यूमर microenvironment स्ट्रोमा मैट्रिक्स Metalloprotease (एमएमपी) उपकला-mesenchymal संक्रमण (EMT)
कण ट्रैकिंग Microrheology 3 डी का उपयोग ट्यूमर मॉडल में बाह्य मैट्रिक्स कठोरता के अनुदैर्ध्य मापन
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Jones, D. P., Hanna, W., El-Hamidi,… More

Jones, D. P., Hanna, W., El-Hamidi, H., Celli, J. P. Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology. J. Vis. Exp. (88), e51302, doi:10.3791/51302 (2014).

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