Summary
To-foton billeddannelse, koblet til laser nanodissection, er nyttige værktøjer til at studere degenerative og regenerative processer i centralnervesystemet med subcellulær opløsning. Denne protokol viser, hvordan til at mærke, billede, og dissekere enkelt klatring fibre i den cerebellare cortex in vivo.
Introduction
Axonal transection følge af mekanisk skade, giftige fornærmelse eller neurodegenerative sygdomme er normalt efterfulgt af degeneration af den distale del af Axon, der er løsrevet fra cellen kroppen 10-13. Med nogle få undtagelser 2,7,14,15, afhuggede axoner i CNS af voksne dyr er som regel i stand til at aktivere en genvækst program 16.
Lidt er kendt om real-time dynamik degenerative begivenheder på celleniveau og subcelleniveauet. Udviklingen af nye strategier til begrænsning af neuronal skade og fremme neuronal genvækst kræver som et første skridt, der præciserer den mekanisme, som ualmindeligt sårede neuronale celler degenerere og regenerere. Denne undersøgelse er mest direkte behandlet ved at overvåge dynamikken i en enkelt neuron in vivo. Mens den ene-foton fluorescens billeddannelse teknikker er begrænset af intens spredning af synligt lys, to-foton excitation når dybe kortikale lag i live mus med subcellulær opløsning 3,4,17. Drage fordel af transgene mus, hvor fluorescerende proteiner er selektivt udtrykt i subpopulationer af neuroner 18-20 har TPF mikroskopi blevet anvendt til udforskning af synaptisk plasticitet og axonforlængende under udviklingen in vivo 21,22. T han evne ualmindeligt beskadigede neuroner til regrow efter skade kan undersøges ved kobling in vivo overvågning af to-foton billeddannelse med en model af skade specifikt rettet til Axon af interesse. Multi-foton absorption af femtosekund pulser er blevet brugt til at forstyrre enkelt dendritter eller endda enkelte pigge 5,23. Desuden er denne skade paradigme tillader skæring enkelt axonale grene uden at forstyrre kontakte dendritceller 6. Inden for rammerne af dissekere de funktioner, der giver specifik neuronal befolkning til at regenerere deres axoner engang beskadigede, cerebellare klatring fibre (CFS) er en nyttig model since de bevarer bemærkelsesværdige plastiske egenskaber efter skaden, selv i voksne dyr 24,25. For nylig, langsigtet billeddannelse CFS viste, at disse axoner er i stand til fornybare i de dage, der følger laser axotomi 6.
Denne protokol beskriver, hvordan man mærke olivocerebellar neuroner og deres axonforlængende gennem anterograd sporing. Når neuroner af interesse fluorescens-mærkede, kan de blive overvåget gentagne gange på vilkårlige tidspunkter for uger eller måneder under et kranie vindue. Proceduren for at dissekere en enkelt axonale grene ved hjælp af laser axotomi in vivo vil derefter blive vist.
De teknikker, der præsenteres her giver ny indsigt i den mekanisme af axonal remodeling in vivo, og kan bidrage til udviklingen af terapeutiske strategier til at begrænse neuronal degeneration og fremme axonal genvækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Axonale Mærkning
- Klatring fibre kan mærkes ved at injicere enten organiske farvestoffer konjugeret højmolekylære dextraner eller plasmid / vira, der inducerer ekspression af fluorescerende proteiner 26-29. I denne protokol, er den organiske farvestof Alexa Fluor Dextran 488 sprøjtes ind i ringere oliven til at mærke klatring fibre og visualisere dem i den cerebellare cortex (Figur 1). Alle her beskrevne procedurer er blevet godkendt af det italienske sundhedsministerium.
- Forbered glaskapillarrør ved at trække det på en mikropipette aftrækker. Trim spidsen af glaskapillarrør med en saks, indtil den ydre diameter er omkring 30 um.
- Load kapillarrøret med 1-2 ul af dextran-konjugeret farvestof.
- Før du starter, sterilisere alle de kirurgiske instrumenter i en autoklave. Under proceduren, mindske risikoen for forurening ved hjælp af en glasperle sterilisator.
- Bedøve mus (9-12uger) ved intraperitoneal injektion af ketamin (90 mg / kg) og xylazin (9 mg / kg). Sørg for, at dyret er fuldt bedøvet ved hjælp af hale og / eller tå trykker. Brug dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
- Barbere hårene over halsen med enten et barberblad eller hårfjerning creme. Svaber operationsstedet to gange med betadin, vekslede med ethanol 70%.
- Anbring musen på en stereotaktisk holder. Hold dyret varm med en varmepude.
- Skub forsigtigt earbars på knoglen ved siden af ørerne, så hovedet holdes fast. Dreje hovedet for at danne en 140 ° vinkel med kroppen. Den ønskede orientering kan opnås ved forsigtigt at ændre højden af næsen holder stangen på stereotaktisk holderen.
- Påfør nogle dråber lidocain på huden mellem ørerne. Pincet eller et barberblad til at udføre en lodret snit på omkring 1 cm på huden under baghoved.
- Forsigtigt adskille det subkutane væv og muskler ved stump pincets under dissektion mikroskop. Skub ned den vandrette muskel bundt og holde hinanden de to lodrette muskler fascicles for at eksponere dura over foramen magnum.
- Ved hjælp af ekstrem forsigtighed, dissekere dura med en sprøjte nål eller meget skarpe pincet til at afsløre hjernestammen. En lille mængde af cerebrospinalvæske kan løbe ud, når dura er blevet skåret.
- På den stereotaktisk mikromanipulator, rotere indehaveren af kapillar 45 ° fra lodret. Placér kapillarrøret ved midterlinjen ved midtpunktet mellem den caudale kant af cerebellar cortex og den første halshvirvel. Sæt pipetten i en dybde på 2 mm fra overfladen.
- Levere en 0,5-1,5 ul volumen af farvestof i løbet 10-15 min. En mikroinjektion dispenseringssystem tillader kontrolleret tryk levering af væsken i kapillarrøret (Pulstryk = 20 psi, pulsvarighed = 3-4 msek, hyppigheden af puls levering = 12 Hz).
- Lad kapillarrøret i stedet for 15 minutter, derefter slowly (2-3 min) fjerne det. Fint re-justere musklerne og suturere huden ovenfor. Holde musklerne godt hydreret ved at anvende nogle saltvand under hele proceduren.
- For at undgå dehydrering, injiceres subkutant 0,5 ml 0,9% NaCl. Hold dyret i et opvarmet bur indtil fuld bedring efter anæstesi.
- Subkutant administrere Carprofen (5 mg / kg) dagligt i 2-3 dage efter operationen.
2.. Optiske vindue på Cerebellær Cortex
BEMÆRK: farvestoffet transporteres i 2 uger fra ringere olivary kerne op til cerebellare cortex til CFS klemmerne (se figur 1). De tyndt mærkede CFS kan visualiseres under permanent kranie vindue, der kan udføres som følger:
- Sterilisere alle de kirurgiske instrumenter.
- Bedøve mus som beskrevet ovenfor. Brug tå klemmer til at kontrollere dyr fuldt bedøvet.
- Barbere håret over hovedet Tør ski med vekslende aflæser 70% alkohol og betadine og anvende eye salve. Placer musen i en stereotaktisk ramme og placere øret barer for at fast holde hovedet.
- Subkutant administrere Dexamethason (0,2 mg / kg) og Carprofen (5 mg / kg) for at forhindre hævelse af hjernen og mulige betændelser på kraniel vindue site.
- En dråbe af lidocain på huden over kraniet og skære en flap, fra mellem ørerne til over øjnene. Påfør lidokain løsning igen ad periosteum før skrabe det med en skalpel.
- Brug tandlægebor at tynde en halvcirkelformet område af kraniet over lillehjernen. Vinduet er normalt placeret centralt og bagud sutur, så kraniet dybde er næsten konstant over hele omkredsen af halvcirkel. Placering af vinduet for tæt på lambda sutur og gentagne boring i denne meget tyk region kan føre til overophedning af hjernen og dannelsen af ødemer.
- Anvend hæmostatisksvamp på kraniet i tilfælde af blødning.
- Skær et dækglas i to halvdele ved hjælp af et barberblad og pincet. Kontrollér at dækglas er lidt større end Isle of knoglen og har en lignende form, før du fjerner klappen af knogle med pincet; hvis ikke, omforme dækglas eller vælge en anden. Rør ikke dura mater med pincet mens du tegner off ben. Læg forsigtigt ned dækglas på dura. BEMÆRK: vedhæftning af hele overfladen af glasset på dura er fortalt, langvarige kranie vinduer.
- Fjern luftbobler under glasset ved gentagne gange at skylle med saltvand og tørring med bomuld sticks. Dette vil også hjælpe at fjerne nogle overskydende blod, der kunne blive spildt ud fra små kapillærer efter positionering glasset. Seal vinduet med en blanding af akryl lim og dental cement 30.
- Hold dyret på en varmepude i et opsving kammer indtil fuldt tilbagebetalt fra anæstesi. Må ikke genbrugesdrej mus i hjemmet bur indtil fuldt tilbagebetalt; ikke lade dem uden opsyn, indtil de genvandt tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
- Subkutant administrere Carprofen (5 mg / kg) dagligt i 2-3 dage efter operationen.
3. In Vivo Multi-foton laser axotomi
- Vent 2-7 dage efter operationen, før du udfører den første imaging session. Specialbygget to-foton mikroskop anvendt her er forsynet med en Ti: Safir laserkilde (120 fs bredde impulser, 90 MHz impulsfrekvens), som først blev scannet med et par galvanometrisk spejle og fokuseres på prøven ved nedsænkning i vand 20X objektiv (NA 0,95 WD 2 mm). Et lukket kredsløb piezoelektriske fase udfører aksiale forskydninger op til 400 mM af målet. Fotomultiplikatorrør indsamle fluorescens signal.
- Bedøver dyret, placer derefter hovedet i stereotaktisk holder, så kranie vindue lægger parallelt med FORMÅLETve brændplan.
- Udforsk med TPF billeddannelse cortex under kranie vindue. Vælg Axon at være beskadiget blandt de dygtigste virksomheder.
- Erhverve en Z-stabel (normalt synsfelt er 100 x 100 mM 2 på 512 x 512 pixels, 2 um z-aksen trin) for at opnå en 3D-rekonstruktioner af målrettet Axon. Inden for den filmede volumen, vælge læsionssitet på en axonal gren, der ligger for det meste parallel til brændplanet. Denne orientering gør det muligt hurtigt at score morfologiske ændringer, der er forudsigende for en vellykket dissektion.
- Bestråle med en højenergi dosis det valgte punkt på en distal del af et CF. Dette sker gennem LabVIEW software: øge lasereffekten 5-10x mere end den strøm, der bruges til billeddannelse (≈ 300 mW, målt efter objektive linse), angive placeringen af de galvanometrisk spejle til at gøre en linje scanning (~ 4 - 10 um) på læsionsstedet og åbn laser lukker for 400-600 msek. Orientere linjescanningvinkelret på CF-flyet til helt transektere Axon. Bestråle lysere pletter (f.eks., Varicosities) hjælper som regel dissekere Axon. Bølgelængden for laser axotomi er den samme som anvendes til billeddannelse (920 nm).
- Normalt fluorescens Axon i det bestrålede område transient falder på grund af fotoblegning. Erhverve en stabel af samme region par minutter efter bestrålingen at sikre ablation er blevet godt udført. Hvis regionen begyndte hævelse og Axon dannede perle-lignende strukturer, er den neuron blevet dissekeret. I dette tilfælde, i et par timer (fra par snese min til 24 timer) den distale del af Axon vil degenerere og forsvinde helt.
- Desværre dosis nødvendig for at producere en komplet axotomi energi er ikke altid forudsigeligt. Hvis det eneste resultat af bestrålingen fotoblegning bør fluorescens sig hurtigt på grund af farvning af diffusion, og bestrålingen bør gentages effektivly dissekere Axon. Også i tilfælde tegn på hævelse vises ikke inden for 5 - 20 min, eller hævelsen er efterfulgt af nyttiggørelse (. Analogt med hvad der er blevet beskrevet for laser dendrotomy se Allegra Mascaro m.fl. 23), prøv igen med nye scanninger øge opholdstid og / eller lasereffekten.
- Overvåg eventuel ombygning af axon i de dage, der følger laser axotomi med to-foton in vivo-billeddannelse (fig. 2 og 3). Det vaskulære mønster anvendes som reference mønster for at hente det dissekerede axon i de følgende dage.
- Subkutant administrere Carprofen (5 mg / kg) hver billeddannelse session for hele varigheden af eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskrevet, hvordan du udfører axon mærkning, in vivo billeddannelse og laser axotomi på enkelte neuroner. Tidslinje for eksperimentet er vist i figur 1.
Et eksempel på CFS mærket med Alexa Fluor 488 Dextran og visualiseret under kranie vindue ved in vivo to-foton mikroskopi er rapporteret i figur 2.. Som tidligere rapporteret 6,27, de opstigende grene vise en høj stabilitet i hele observationsperioden på flere dage .
Figur 3 viser et eksempel på axonal adskillelse ved hjælp af laser axotomi af en enkelt gren af en CF. Som tidligere beskrevet, blev de skader udføres ved at bestråle en distal gren (~ 30 um under pia) af et CF med en høj dosis energi infrarødt lys. Som vist i det andet panel i figur 3, 15 min efter laserbestråling den distale del af Axon begyndte hævelse og degenerating. Dagen efter den del af Axon distalt læsionsstedet fuldstændig forsvundet (fig. 3, d17). Den degenererede del er fremhævet af de røde pile i tidsforløbet. De sidste to paneler viser også den gradvise dannelse af en ny tværgående gren (grøn pilespids) fra det sårede Axon (flere detaljer om spiring af nye filialer efter laser axotomi in vivo kan findes i 6).
Figur 1.. Tidslinje af laseren nanosurgery eksperimentet. Efter injektion i ringere olivary kerne vil to ugers opsving tillade anterograd dextran-konjugeret farvestof til at mærke klatring fibre. Den cerebellar cortex eksponeres derefter ved at udføre en permanent kraniel vindue. Fra 2-7 senere, kan de mærkede CFS skal afbildes under to-foton microscope in vivo ved vilkårlige tidsintervaller. Laseren nanosurgery på de mærkede axoner kan udføres til enhver tid efter kranie vindue er blevet implanteret.
Figur 2. Climbing fibre mærkning. Det venstre panel viser et eksempel på et CF mærkes med Alexa Fluor 488 Dextran og visualiseres in vivo ved TPF mikroskopi. Højre paneler viser time-lapse billeder af det samme CF fra dag 16 (d16) til D18. Scale bar, 10 um.
Figur 3.. Laser axotomi på en enkelt gren af en klatring fiber. Neuron blev bestrålet hvor de røde pil peger på d16. Røde pilespidser highlight forsvinden af den distale del af Axon efter laser axotomi (D18). En nydannet tværgående filial er påpeget af den grønne pilespids. Scale bar, 10 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol viser, hvordan at mærke neuroner i ringere oliven med et fluorescerende farvestof. Efterfølgende metode til at udføre en kraniel vindue på cerebellar cortex beskrevet. Denne teknik giver optisk adgang til den terminale del af olivocerebellar neuroner, klatring fibre. Desværre, resultatet af både mærkning og craniotomy kirurgi er ganske lav, selv i hænderne på dygtige operatører (normalt 1 ud af 3 mus er mærket, og 1 ud af 3 kranie vinduer forbliver klar efter 1-2 uger).
Proceduren for at udføre laser axotomi i levende mus derefter præsenteres. Denne metode giver dissekere fluorescerende neuroner i udvalgte steder. Mens almindeligt anvendte skade paradigmer, enten ved mekanisk overskæring eller brug af kemikalier, forårsage massive forstyrrelser af hjernevæv, nøglen styrken af denne model er den høje rumlige indespærring og specificitet. Faktisk viste tidligere undersøgelser, at enlige spines kan ablated mens skåne than strukturelle integritet af moderselskabet dendritceller 5; desuden kan enkelt axonale grene blive afbrudt undgå dannelsen af en vedholdende gliøs ar 6. Degeneration proces kan efterfølges i realtid, samt eventuel omdannelse af de sårede neuron. Denne metode er derfor et stærkt værktøj til at studere den grundlæggende mekanisme af axon strukturel plasticitet in vivo.
Muligheden for at dissekere udvalgte strukturer afhænger i første tilnærmelse af dybden af strukturen og dens fluorescensemission intensitet. Selv om to-foton mikroskopi muliggør imaging neuroner op til 600-800 um dyb, fandt vi, at nanosurgery er begrænset til de første lag af cortex (op til 300 mm).
I denne protokol laser axotomi var målrettet til cerebellare klatring fibre, men det kan bruges til at dissekere noget fluorescerende struktur i levende hjerne. Laserbestråling er blevet anvendt til at dissekere enkelt neuronal cell organer, dendritiske grene, axoner eller enlige udløberne af GFP-mærkede pyramideneuroner i cortex af transgene mus 5,8,9,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
| Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
| Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
| Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Ti:Sapphire laser, 120 fsec width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
| Spongostan, hemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
| Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
| Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
| Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
| LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
| Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
| Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
| Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
| Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |
References
- Strata, P., Rossi, F.
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P.
- Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Sacconi, L., et al. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Allegra Mascaro, A. L., et al. In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr Biol. 19, 930-936 (2009).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Canty, A. J., et al. Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex. J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
- Hilliard, M. A. Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war. J Neurochem. 108, 23-32 (2009).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Luo, L., O'Leary, D. D. Axon retraction and degeneration in development and disease. Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).
- Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons. Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).
- Morrison, E. E., Costanzo, R. M. Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system. Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).
- Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity. Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks. Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49, 861-875 (2006).
- Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F.
- Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells. The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P.
- Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43. PLoS One. 6, e20791 (2011).
- Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum. Neuron. 56, 472-487 (2007).
- Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex. Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).
- Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum. Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (12), (2008).
