Cellodling in vitro modell för Toxic Inhalerat Chemical Testing

Summary

Detta protokoll är utformad för att påvisa exponering metod för cellkulturer till inhalerade giftiga kemikalier. Exponering av differentierad luft-vätska gränssnitt (ALI) kulturer av epitelceller i luftvägarna ger en unik modell av luftvägs exponering för giftiga gaser som klor. I detta manuskript beskriver vi effekten av klor exponering på luft-vätska gränssnitt kulturer av epitelceller och nedsänkt kultur av hjärtmuskelceller. In vitro exponeringssystem tillåter viktiga mekanistiska studier för att utvärdera vägar som sedan skulle kunna användas för att utveckla nya läkemedel.

Abstract

Cellodlingar är oumbärliga för att utveckla och undersöka effektiviteten för terapeutiska medel, före deras användning i djurmodeller. Vi har en unik förmåga att modellera väl differentierade mänsklig luftvägsepitel och hjärtmuskelceller. Detta kan vara ett ovärderligt verktyg för att studera de skadliga effekterna av giftiga inhalerade kemikalier, såsom klor, som normalt kan interagera med cellytorna, och bildar olika biprodukter vid reaktion med vatten, och begränsa deras effekter i nedsänkta kulturer. Vår modell med hjälp av väl differentierade mänskliga luftvägs epitelial cellkulturer vid luft liqiuid gränssnitt kringgår denna begränsning samt ger en möjlighet att utvärdera kritiska mekanismer för toxicitet av potentiella giftiga inhalerade kemikalier. Vi beskriver ökad förlust av membranintegritet, caspase utsläpp och död på giftiga inhalerad kemikalier såsom klor exponering. I den här artikeln föreslår vi metoder för att modellera klor exponering i däggdjur hjärta och luftvägar epitelceller calnar i kultur och enkla tester för att utvärdera dess effekt på dessa celltyper.

Introduction

Exponering för giftiga inhalerade kemikalier (tics) / gaser som klor (Cl ₂₎ är fortfarande ett pågående hälsoproblem i oavsiktliga exponeringar samt deras potentiella användning som ett kemiskt hot agent. Även om lungorna är det primära målet, är organ som hjärta och hjärna påverkas också ^1-3. In vivo-modeller används i allmänhet för toxicitetstester från tics, men in vitro-tester för bedömning toxicitet är enklare, snabbare och mer kostnadseffektivt. I vitro-modeller tillåter också för en omfattande utredning av agent-cell interaktioner som kan vara svåra in vivo för att utvärdera. Sådana in vitro-exponering system är sällsynta och dessutom i vissa konventionella modeller där toxiska medel tillsätts till odlingsmediet i vilket cellerna är nedsänkta, kan egenskaperna hos de ombud ändras på grund av växelverkan och bindning till komponenter i mediet. I sådana scenarier cellkultursystem som luft-vätska gränssnitt (ALI) kulturer av primära mänskliga epitelceller i luftvägarna, som föreslås här, som kan vara direkt utsatta för gasformiga ämnen kan vara lovande.

Epitelceller som kantar luftvägarna är de första raderna i försvar mot inhalerade giftiga kemikalier. Den humana luftvägsepitel bildar en fysisk barriär mellan lumen och de underliggande cellerna i lungan och deltar i svaret hos lungan. Den producerar ett antal cytokiner och andra pro-och antiinflammatoriska medel samt utsöndrar slem / luftvägsytan vätska (ASL) som täcker epitelet. En av begränsningarna i konventionell nedsänkt i odlings vitro-system är också att ASL och slem som täcker epitelytan avlägsnas eller spädas. Detta återspeglar inte det fysiologiska tillståndet hos lungepitelceller som utsätts för luft. Därför bör ett ideal i systemet vitro för test TIC toxicitet replikera denna arkitektur. Det finns ett stort intresse för att utveckla snabbscreening metod som förutsäger in vivo toxicitet. Epitelceller odlas vid ALI differentiera och har väl-differentierade strukturer och funktioner i jämförelse med celler som odlats nedsänkta och servera en överlägsen modell av luftvägarna.

I denna studie beskriver vi användningen av luft-vätske-interface kultur av människans luftvägar (tracheobronchial) epitelceller för att testa giftig toxicitet inandad gas och jämföra det med en nedsänkt cellkultur cardiomyocyte, därför studera ett annat viktigt mål för toxiciteten.

Protocol

1. Rat cardiomyocyte kulturer

1. Alla experiment utfördes under protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén, IACUC.
2. Skaffa råttkardiomyocyter från hjärtan (ventriklarna) i hanråttor (240-260 g) med hjälp av metoder som beskrivits tidigare ^4. Kortfattat, söva djuren med användning av en intraperitoneal injektion av pentobarbital (100 mg / kg; bekräfta anestesi genom toe pinch-metoden) och sedan ta bort hjärtan till 10,0 ml, 1 mM Ca ^{2 +} innehållande Krebs Ringer-buffert, pH 7,4.
3. Skölj hjärtan 5-6x för att avlägsna blod och sedan byta till en ^{Ca2 +} fri Krebs Ringer buffert innehållande 0,02% proteas och 0,06% kollagenas A (5,0 ml / hjärta). Inkubera hjärtan i denna lösning under 10 till 15 min vid 37 ° C med skakning då och då.
4. Efter 10 till 15 minuter, tvätta ur den enzymatiska lösningen med ^{Ca2 +-fri} Krebs Ringer-buffert under ytterligare 5 min. Släpp cellerna från slapp vävnad ossning en 25 ml pipett genom att pipettera suspensionen upp och ned flera gånger.
5. Separera cellerna från vävnaden genom filtrering genom ett 70 | im nylonnät och tillåta dem att reglera med Krebs Ringer-buffert innehållande 0,1 mM Ca ^{2 +.} Suspendera cellpelleten i 1,0 ml Krebs Ringer-buffert innehållande 0,2 mM Ca ^{2 +.}
6. Skiktet försiktigt över 5,0 ml 60 ^ g / ml bovint serumalbumin, BSA, i 15 ml centrifugrör, för att separera kardiomyocyter från nonmyocytes och tillåta dem att sedimentera under 30 min. De kardiomyocyter är tyngre och flytta till botten av röret. Ta försiktigt bort supernatanten celler och media. Upprepa detta steg en gång för att ytterligare rena cellerna.
7. Gradvis övergång genom tvättning (i steg med användning av 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM och 1,0 mM Ca ^{2 +} innehållande buffert) ventrikulära myocyter / kardiomyocyter till 1,0 mM Ca ^{2 +} innehållande buffert och återsuspenderades i ACCT medium bestående av Dulbeccos Modified Eagle Medium , DMEM containing 2 mg / ml BSA, 2 mM L-karnitin, 5 mM kreatin, 5 mM taurin, 100 lU / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin.
8. Plåt kardiomyocyterna i ACCT-medium vid en densitet av 100 till 150 celler / mm ² på 100 mm eller 35 mm lamininbelagda odlingsskålar av plast eller 40 x 22 mm täckglas förbelagda med laminin (1 pg / cm ^2). Efter 1 timme, diska med 2,0 ml ACCT att avlägsna celler som inte sitter fast. Lägg till 10,0 ml av färskt medium och inkubera cellerna.

2. Differentierad Luft-vätske-gränssnitt (ALI) Kultur för Human Airway Epitelial basalceller

1. Upphandla mänskliga tracheobronchial vävnader från National Disease Research Interchange inom Institutional Review Board godkända protokoll. Cell skörd och utföra kultur med hjälp av en publicerad procedur ^5,6. Denna procedur använder cellkulturer som de är en exakt modell för mänsklig inandning exponeringar mot tics, men om det behövs kan man isolera och odla på ALI moanvändning och / eller råtta epitelceller i luftvägarna ^7,8.
2. Kortfattat, gör små bitar (~ ¼ tum) av vävnaden efter att ta bort alla bindväv och lymfkörtlar. Tvätta vävnads flera gånger i Ringer-laktat lösning. Lägg vävnader till ett 50 ml koniskt rör och till proteas-lösning (1% Protease/0.01% DNas i minimalt essentiellt medium, MEM, vävnads till vätskeförhållande (01:10)).
3. Vagga vävnaden vid 4 ° C under natten. Avsluta dissociation av vävnad genom att tillsätta 10% fetalt bovint serum. Skrapa epitelytan med en kirurgisk skalpell och samla upp cellerna genom centrifugering (2000 rpm under 10 min).
4. Plate celler vid passage ett på kollagenbelagda snapwells i speciell ALI mediet som framställts såsom beskrivits i detalj av Fulcher et al ^9. Kultur för 5 dagar innan byte till luft-vätska gränssnitt (ALI) genom att ta bort apikala media.
5. Mata-celler med användning ALI medier varannan dag och tillåta cellerna att differentiera efter ytterligare 2-3 veckor (observera många stryk flimmerhår och slemutsöndring) innan du utför exponeringar. Tvätta den apikala ytan med varmt PBS tillsammans med medie förändringar.

3. Klor Exponering

1. Innehålla klorexponeringssystemet (CES) i en kvalificerad kemisk huva med en operativ fronthastighet 100 fpm som ger den nödvändiga sekundär inneslutning för att undvika exponering av personal vid oavsiktliga klorläckage.
2. Manövrera systemet under svagt positivt tryck (0,5 inches av vatten). Torr luft matas vid 15 L / min och en lämplig nivå av klor matas för att uppnå den önskade slutliga klorkoncentrationen. Kamrarna har en låsning lock med 4 mini BCU lås och en låg durometer silikonpackning för att ge trycktätning.
3. Leverera _Cl2 blandningen genom en Massflödesregulator. CES använder en komprimerad gas cylinder innehållande 1,0% Cl ₂ i torr kvävgas.
4. Reglera utspädnings luftflödet med hjälp avspecialdesignade kontrollpanel och på liknande sätt reglera Cl ₂ avgivna koncentrationen de exponeringskammare. En låg volymprovtagningspumpen drar avgaserna från kamrarna i en klor analysator för att övervaka koncentrationer som sedan spelas in på en datalogger ansluten till analysatorn.
5. Mät flöden inom kamrarna före exponering med hjälp av en flödesmätare för att säkerställa lika och utblåsningspriser.
6. Förbered cellkulturer för exponering genom att ta bort de överstående media och lägga till nytt medium (basolaterala medier i ALI kulturer). Eventuella förbehandlingar med agenter skulle utföras vid denna tidpunkt.
7. Exponera ALI kulturer av epitelceller i luftvägarna till Cl _2-gas (50, 100, eller 300 ppm under 30 min) hos de två förseglade polysulfon biologisk inneslutning kamrarna. De hjärtmuskelceller (nedsänkta eller Sammanflytande kulturer på membran) utsätts för 50 eller 100 ppm Cl ₂ i 15 min.
8. Efter exponering spola kamrarna med luft tills Cl ₂ nivån sjunker under 1 ppm och säkert kan öppnas för att avlägsna celler (inom 5 min).

4. Transepitelial elektriskt motstånd (TER) Mätning

1. Mät TER av luft-vätske-gränssnittet, ALI, kulturerna med en epitelial voltohmmeter med ett par av silverklorid "pinne"-elektroder.
2. Jämvikta chopstick elektrod i ALI media 15 minuter före användning.
3. Tillsätt varmt medium till den apikala (1,0 ml) och basolaterala (2,0 ml)-ytan och mäta TER hjälp av chopstick elektroderna hos voltohmmeter.
4. Doppa den kortare armen av elektroden i apikala media och den längre armen i basolaterala medier. Klicka på "åtgärd"-knappen på voltohmmeter att utvärdera det elektriska motståndet.
5. Det voltohmmeter har möjlighet att mäta ohm eller k ohm. Subtrahera motståndet över en cellfri kultur stöd från resistansen mätt över varje cellskikt för att ge den transepitelial motstånd (TER).

5. Kaspas Mätning

1. Lägg färsk ALI medier (2,0 ml) till den basolaterala ytan efter exponering och inkubera cellen vid rumstemperatur. Samla supernatanten medier vid 4 och 24 timmar.
2. Mät kaspas 3/7 aktivitet i media supernatanterna genom att använda ett kommersiellt kaspas 3/7 analyssats.

6. Western Blot och Immuncytokemi

1. Utför Western blotting med hjälp av cellysat som tidigare beskrivits ^10. Häng proteinet lysatet (20 mikrogram) i 5x reducerad provbuffert och koka i 5 minuter. Utsätta proteinet lysatet för SDS-PAGE (4-15%) och överför de separerade proteinerna till ett nitrocellulosamembran genom elektroblotting.
2. Blockera icke-specifik bindning genom inkubation av membranet med 5% mjölk i tvättbuffert (PBS + 0,1% detergent) och sond membranen med primära antikroppar mot SERCA2 eller sarkomeriskt aktin vid 1:1000 utspädning, över natten vid 4 ° C. Nästa, tvätta och inkubera membran med respektive peroxidaskonjugerade sekundära antikroppar och utvecklas för detektion som beskrivits tidigare ¹⁰ använder kommersiella peroxidas upptäckt kit.
3. För immunocytokemi behandla levande celler odlade på insatser eller täckglas av glas i sex-brunnars plattor med 0,4% Triton-X-100 i 10 mM natriumcitrat-buffert under 20 min efter sköljning med PBS.
4. Blockera icke-specifik bindning genom behandling av cellerna med 5% donkey serum under 20 min, och sedan inkubera cellerna med icke-specifikt IgG eller enskilda primära antikroppar specifika för sarkomeriskt aktin eller Ki-67.
5. Tvätta cellerna med PBS och inkubera med fluorescerande-konjugerade sekundära antikroppar för att detektera den primära antikroppen och en kärn-fläck (1 | ig / ml DAPI).
6. Tvätta med PBS och montera täckglas med hjälp av kommersiella monteringsmedier.
7. Visualisera färgningen med hjälp av en fluorescerande mikroskop.

Representative Results

Primär stavformade hjärtmuskelceller fäster på laminin matriser och sprida sig och differentierar till sammanflytande kulturer (Figur 1A och dess infälld). Dessa celler karakteriserades ytterligare på grundval av sarkomeriskt aktin och SERCA2 uttrycket (figurerna 1B och 1C). Råttkardiomyocyter är mycket mottagliga för klor toxicitet såsom 15 min exponering för 100 ppm klor orsakade omfattande cell avrundning och död i submersa kulturer och störningar av sammanflytande skikt på celler odlade på lamininbelagda membran (figur 1D). Det var också förstärkt apoptotiska celldöd som indikeras av kaspas 3/7 release i hjärtmuskelceller odlas på insatser (figur 1E).

Exponering av differentierad mänsklig luftvägsepitel (Figur 2, infälld till panelen 1 visar ett tvärsnitt av cellodling skär med columnar, cilierade och bägare celler) till klor orsakade sårskorpa och LIFning av cellmembran vid både låga (100 ppm) och hög (300 ppm)-koncentrationer (fig 2 panel A2 och A3). Skador av låga klorhalter var snabbt vände (Figur 2 panel A5), dock celler som utsätts för höga klorhalter hade försenat eller inget reparationsförmåga (figur 2 panel A6) som visas genom visuell inspektion samt celltillväxt bedömning av Ki-67 färgning (Figur 2 panel A9). Trans epitelial elektriskt motstånd, TER mätningar och caspase aktivitet bekräftade vidare dessa resultat och ge bevis för förlust av membranintegritet och apoptotiska celldöd vid klorexponering (Figur 2, panel B och C). Således våra studier beskriver utvecklingen av ett in vitro Cl ₂ exponeringssystem som orsakar förlust av membranintegritet och död luftvägsepitel och hjärtmuskelceller. Denna effekt kan inte vara på grund av icke-fysiologiska pH-förändringar i hjärtmuskelceller sompH hos mediet efter exponering för klor hölls vid ~ 7,4, mätt med användning av en pH-mätare i den uppsamlade medier efterexponering.

Figur 1. Rat cardiomyocyte isolering och exponering för klor. Råttkardiomyocyter isolerades såsom beskrivs i protokollet och pläterade på laminin-belagda plastskålar (panel A, en representativ ljus mikroskopisk bild) eller lamininbelagda skär. Infälld till panel A visar en stavformad cardiomyocyte spridning och differentiering. De hjärtmuskelceller också karakteriseras utifrån den sarkomeriskt aktin uttrycket (panel B visar en representativ bild upptäcks av immunofluorescens och körfält en panel C visar ett representativt western blot scan) och riklig SERCA2 uttryck (panel C körfält b). Klor exponering (100 ppm 15 min) orsakade omfattande celldöd isubmersa kulturer samt sönderdelning av cellmonoskikt på skären (panel D visar representativa mikrofotografier). Caspase 3/7 frisättning (panel E) i supernatanten media av kardiomyocyter odlas på skär, vid 4 timmar och 24 timmar efter klor exponering mättes också såsom beskrivits i texten. Värden som visas är medelvärdet ± SEM och * Indikerar signifikant (p <0,05) skillnad från 0 ppm kontroll.

Figur 2. Verkan av klor exponering på differentierad mänskliga epitelceller i luftvägarna luft-vätska gränssnitt (ALI) kulturer. Mänskliga epitelceller i luftvägarna basala celler odlades på kollagenbelagda snapwells. Efter dag 5 apikala media avlägsnades. Differentierade kulturer (som består av basala, cilierade, columnar, och bägarceller såsom visas i infällningen i översta left panel av panel A) exponerades för klor (100 eller 300 ppm) under 30 min. TER mättes och ändrades medium och cellerna inkuberades under 24 timmar. Vid 24 tim TER mättes igen och apikala media samlades för caspase frigör mätning och cellmembranen har fastställts för immunohistokemi. Den öppna pilen i panel A del 2 och 3 visar sloughed bort epitelskikt och svarta pilar visar tomma utrymmen på insatsen. Den pilspets i panel A del 5 visar regenererad epitel. Delar 7, 8 och 9 visar cellulär proliferation som bedöms av Ki-67 immunfärgning. Värden som visas är medelvärdet ± SEM och * Indikerar signifikant (p <0,05) skillnad från 0 ppm kontroll.

Discussion

Den vanligaste typen av akuta toxiska exponeringar uppstår när man andas en giftig kemikalie i lungorna. Dessa kemikalier kan också snabbt tas upp i blodet och kan påverka andra organ såsom hjärna och hjärta. Toxiciteten av olika agenter som använder djurmodeller Inandning studeras och rapporteras allmänt, men mekanismerna är mindre väl förstådd. Detta är ett stort hinder i utvecklingen av effektiva behandlingar. Avsaknad av in vitro-exponeringssystem är en primär orsak till bristen på mekanistiska insikter. Här beskriver vi cellodlingsmodeller av hjärtmuskeln och luftvägar för att studera effekterna av giftiga inhalerade kemikalier som klor exponering. Klor reagerar snabbt med vattenbaserade ytor för att bilda klorväte och klorsyrlighet ^3,11,12. Klor kan även kombinera med reaktiva syreradikaler (ROS) för att producera mycket reaktiva föreningar som kan leda till oxidation av viktiga proteiner och enzymer av luftvägsytorna ^13. Studiermed hjälp av nedsänkta kulturer kan endast påvisa effekter av produkter såsom HOCl i händelse av klor snarare än gasen. Exponering av differentierade ALI kulturer av humana epitelceller i luftvägarna som beskrivs här skulle möjliggöra studier av direkta interaktioner av tics som klor med cellytor i frånvaro av vattenbaserade media som liknar det som sker in vivo.

Använda primära råttkardiomyocyter beskriver vi också att klor exponering orsakar snabb celldöd i nedsänkta kulturer. Dessa celler är oförmögna att växa vid ALI som de inte polarisera och bildar tight junctions. Därför använde vi även sammanflytande kulturer av hjärtmuskelceller odlas på skär med ett tunt lager av media. Exponering av dessa cellmonolager till klor visade membran störningar och förbättrad caspase frigör tyder apoptos kan spela en roll.

Denna studie visar att luftvägarna (det primära målet för inandning som kan replikeras av ALI cultures) samt organ som hjärta som inte växer vid ALI kan studeras med hjälp av exponerings vitro-system. Dessa in vitro exponeringsmodeller kan lätt anpassas för att bedöma effekterna av andra giftiga inhalerade kemikalier (tics). Med hjälp av dessa modeller räknar vi med att ge detaljerad mekanistisk förståelse av toxicitet och utveckla nya strategier för att mildra de giftiga händelser i samband med TIC / klor och sedan utvärdera dem vidare in vivo. Även om dessa exponeringar är kortvarig exponeringssystemet behöver för att bättre replikera cell odlingsbetingelser. Exponering för gaser såsom klor begränsar användningen av fuktighet eftersom det kan orsaka korrosion på enheten. Ali kulturerna kan vaggas att simulera andning som tidigare utnyttjats i vårt ozonexponering systemet ^14,15. Vi arbetar för närvarande i dessa riktningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode	World Precision Instruments	EVOM and STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon cell strainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment chambers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomeric actin antibody	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antibody	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antibody	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-conjugated secondary antibody	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer solution	Abott Laboratories	7953
Donkey serum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detection kit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497
Collagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ