Summary
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Belichtungsverfahren von Zellkulturen zu inhalierenden toxischen Chemikalien zeigen. Exposition der differenzierten Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) Kulturen von Epithelzellen der Luftwege bietet eine einzigartige Modell von Atemwegs Exposition gegenüber toxischen Gasen, wie Chlor. In dieser Handschrift beschreiben wir Wirkung von Chlor-Exposition auf die Luft-Flüssigkeits-Grenzkulturen von Epithelzellen und Tauchkultur der Herzmuskelzellen. In-vitro-Belichtungssysteme erlauben wichtige mechanistische Studien, um Wege, die dann genutzt werden, um neue therapeutische Mittel zu entwickeln beurteilen.
Abstract
Zellkulturen sind unverzichtbar für die Entwicklung und Studie die Wirksamkeit von therapeutischen Mitteln, vor ihrem Einsatz in Tiermodellen. Wir haben die einzigartige Fähigkeit, gut differenzierten humanen Atemwegsepithel und Herzmuskelzellen zu modellieren. Dies könnte ein wertvolles Werkzeug, um die schädlichen Wirkungen toxischer inhalierten Chemikalien wie Chlor, die normalerweise mit der Zelloberfläche interagieren, und bilden verschiedene Nebenprodukte bei der Reaktion mit Wasser, und ihren Effekten in Submerskulturen zu studieren. Unser Modell mit gut differenzierten menschlichen Atemwege epithelialen Zellkulturen bei Luft-liqiuid Schnittstelle umgeht diese Beschränkung auf und bietet die Möglichkeit, kritische Mechanismen der Toxizität von möglichen giftigen Chemikalien inhalativen beurteilen. Wir beschreiben eine verbesserte Verlust der Membranintegrität, Caspase Mitteilung und Tod auf toxische chemische inhalativen Exposition wie Chlor. In diesem Artikel schlagen wir Methoden, um Chlor Exposition in Säugetier-Herz und Atemwegsepithelzellen c modellierenEllen in Kultur und einfache Tests, um ihre Wirkung auf diese Zelltypen zu evaluieren.
Introduction
Inhalativen Exposition gegenüber toxischen Chemikalien (TIC) / Gase wie Chlor (Cl 2) bleibt eine laufende Gesundheitsproblem in zufälligen Positionen als auch in ihren möglichen Einsatz als chemische Bedrohung Mittel. Obwohl die Lunge das primäre Ziel sind Organe wie Herz und Gehirn betroffen 1-3. In vivo-Modelle sind in der Regel für die Prüfung Toxizität von TIC verwendet, aber in vitro-Assays zur Beurteilung Toxizität sind einfacher, schneller und kostengünstiger. In vitro-Modellen auch für die umfangreiche Untersuchung von Mittel-Zell-Interaktionen, die schwer zu in vivo zu beurteilen sein kann zu ermöglichen. Wie in vitro-Belichtungssysteme sind selten und außerdem in einigen herkömmlichen Modellen, bei denen giftige Substanzen werden dem Kulturmedium der Zellen hinzugefügt taucht, die Eigenschaften der Mittel kann aufgrund von Wechselwirkungen und die Bindung an Komponenten in dem Medium ändern. In solchen Szenarien Zellkultursystemen, wie Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) Kulturen von primären humanen Epithelzellen der Atemwege, hier vorgeschlagen, die direkt in den gasförmigen Mittel ausgesetzt werden könnte vielversprechend.
Epithelzellen der Atemwege sind die ersten Verteidigungslinien gegen giftige Chemikalien eingeatmet. Der menschliche Luftwegsepithel bildet eine physikalische Barriere zwischen dem Lumen und den darunterliegenden Zellen in der Lunge und nimmt an der Reaktion der Lunge. Es produziert eine Anzahl von Cytokinen und anderen pro-und anti-inflammatorische Mittel sowie Schleim sekretiert / Atemwegsoberflächenflüssigkeit (ASL), die das Epithel. Eine der Einschränkungen bei herkömmlichen in vitro-Kultursystemen untergetaucht ist auch, dass die ASL und Schleim, die Epitheloberfläche Abdeckung entfernt oder verdünnt. Dies entspricht nicht den physiologischen Zustand der Lungen Epithelzellen, die der Luft ausgesetzt sind. Daher sollte ein ideales in vitro-System für die TIC Toxizität dieser Architektur repliziert werden. Es gibt ein großes Interesse an der Entwicklung schnelle Screening methoden, die in vivo-Toxizität vorherzusagen. Epithelzellen an der ALI gewachsen zu differenzieren und haben gut differenzierten Strukturen und Funktionen im Vergleich zu Zellen gewachsen untergetaucht und servieren ein überlegenes Modell der Atemwege.
In dieser Studie beschreiben wir den Einsatz von Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche Kultur der Menschenatemwege (tracheobronchiale) Epithelzellen zum Testen eingeatmeten Giftgastoxizität und vergleichen Sie sie mit einem untergetauchten Zellkultur von Kardiomyozyten, damit das Studium ein weiteres wichtiges Ziel der Toxizität.
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Protocol
1. Rat Cardiomyocyte Kulturen
- Alle Experimente wurden unter Protokolle, die von der institutionellen Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschuss genehmigt IACUC durchgeführt.
- Erhalten Rattenherzmuskelzellen aus den Herzen (Ventrikel) der männlichen Ratten (240-260 g) unter Verwendung zuvor 4 beschriebenen Verfahren. Kurz gesagt, Tiere anästhesiert unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (100 mg / kg; bestätigen Anästhesie durch Zehenklemmverfahren) und dann Herzen in 10,0 ml, 1 mM Ca 2 + enthält, Krebs-Ringer-Puffer, pH 7,4, zu entfernen.
- Spülen Sie die Herzen 5-6x, um Blut zu entfernen und dann wechseln Sie zu einem Ca 2 +-freien Krebs-Ringer-Puffer mit 0,02% und 0,06% Protease Kollagenase A (5,0 ml / Herz). Die Herzen in dieser Lösung für 10-15 min bei 37 ° C unter gelegentlichem Schütteln.
- Nach 10-15 min, waschen die enzymatische Lösung mit Ca 2 +-freien Krebs-Ringer-Puffer für weitere 5 min. Lassen Sie die Zellen aus dem Gewebe schlaff unsten eine 25-ml-Pipette durch Pipettieren der Suspension nach oben und unten mehrmals.
- Trennen Sie die Zellen von Gewebe durch Filtrieren durch eine 70 um Nylon-Mesh und es ihnen ermöglichen, in Krebs-Ringer-Puffer mit 0,1 mM Ca 2 + zu begleichen. Aussetzung des Zellpellets in 1,0 ml Krebs-Ringer-Puffer, enthaltend 0,2 mM Ca 2 +.
- Vorsichtig Schicht über 5,0 ml 60 ug / ml Rinderserumalbumin, BSA, in 15 ml Zentrifugenröhrchen, zu Kardiomyozyten aus nonmyocytes trennen und es ihnen ermöglichen, für 30 Minuten absetzen. Die Herzmuskelzellen sind schwerer und bewegen sich auf den Boden des Röhrchens. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand Zellen und Medien. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal, um weiter zu reinigen, die Zellen.
- Schrittweise Übergang durch Waschen (in den Schritten unter Verwendung von 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM und 1,0 mM Ca 2 +-haltigen Puffer) die ventrikulären Myocyten / Kardiomyozyten bis 1,0 mM Ca 2 +-haltigen Puffer und ACCT Medium, bestehend aus Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium resuspendiert , DMEM containing 2 mg / ml BSA, 2 mM L-Carnitin, 5 mM Kreatin, 5 mM Taurin, 100 IU / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
- Platte der Kardiomyozyten in ACCT Medium in einer Dichte von 100 bis 150 Zellen / mm 2 auf 100 mm oder 35 mm Laminin beschichteten Kunststoffkulturschalen oder 40 x 22 mm Deckgläschen mit Laminin (1 ug / cm 2) schwemmt. Nach 1 Stunde, waschen das Geschirr mit 2,0 ml ACCT zu Zellen, die nicht gebunden sind, zu entfernen. In 10,0 ml frisches Medium und Inkubation der Zellen.
2. Differenzierte Air-Liquid-Interface (ALI) Kultur der Menschen Airway Epithelial Cells Basal
- Procure menschlichen Geweben tracheobronchiale von National Disease Research Interchange unter Institutional Review Board genehmigt Protokolle. Zellernte und durchzuführen, Kultur mit einem veröffentlichten Verfahren 5,6. Dieses Verfahren verwendet Zellkulturen, wie sie sind ein präzises Modell für den menschlichen Einatmung von TIC jedoch, wenn nötig kann man isolieren und zu wachsen ALI mozu verwenden und / oder Ratte Epithelzellen der Atemwege 7,8.
- Kurz gesagt, stellen kleine Stücke (~ ¼ Inch) des Gewebes nach dem Entfernen aller Bindegewebe und Lymphknoten. Mehrmals in Ringer-Laktat-Lösung waschen Gewebe. Hinzufügen Gewebe zu einer 50 ml konischen Röhrchen und fügen Protease-Lösung (1% Protease/0.01% DNase in Minimalmedium, MEM, Gewebe Fluidverhältnis (1:10)).
- Rock the Gewebe bei 4 ° C über Nacht. Enden die Dissoziation des Gewebes durch Zugabe von 10% fötalem Rinderserum. Kratzen die Epitheloberfläche mit einem chirurgischen Skalpell und Sammeln der Zellen durch Zentrifugation (2.000 Upm für 10 min).
- Platten Zellen bei Passage auf einem kollagenbeschichteten snapwells in speziellen ALI Medium hergestellt, wie ausführlich von Fulcher et al 9 beschrieben. Kultur für 5 Tage vor dem Wechsel zum Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) durch Entfernen apikalen Medium.
- Füttern Sie die Zellen mit ALI Medien jeden zweiten Tag und damit die Zellen für weitere 2-3 Wochen (zu unterscheidenbevor Expositionen beobachten zahlreiche Schläge Cilien und Schleim Sekretion). Waschen Sie die apikale Oberfläche mit warmem PBS zusammen mit Medienwechsel.
3. Chlor Belichtungs
- Enthält die Chlor-Belichtungssystem (CES) in einem qualifizierten chemischen Abzugshaube mit einer Betriebsgeschwindigkeit von 100 Gesicht fpm, die die notwendige Auffang Exposition von Personal im Falle des zufälligen Chlor Lecks zu verhindern bietet.
- Betreiben Sie das System unter leichten Überdruck (0,5 Zoll Wasser). Trockene Luft bei 15 L / min und einem angemessenen Niveau von Chlor zugeführt wird, um die gewünschte endgültige Chlorkonzentration zu erreichen zugeführt. Die Kammern haben einen Verschlussdeckel mit 4 Mini-BCU Schleusen und einem niedrigen Härtegrad Silikondichtung, um den Druck Dichtung zu schaffen.
- Geben Sie sich die Cl 2-Gemisch durch einen Massendurchflussregler. Die CES verwendet eine Druckgasflasche, die 1,0% Cl 2 in trockenem Stickstoff.
- Regulieren Sie den Luftstrom mit Hilfe der Verdünnungkundenspezifische Systemsteuerung und ähnlich regeln die Cl 2-Konzentration in den Expositionskammern geliefert. Ein geringes Volumen Probenahmepumpe zieht die Abgase aus den Kammern in eine Chlor-Analysator zu Konzentrationen, die dann auf einem Datenlogger an den Analysator angeschlossen aufgezeichnet werden, zu überwachen.
- Messen Sie die Durchflussmengen in den Kammern vor der Belichtung mit einem Durchflussmesser gleich und Abgasraten zu gewährleisten.
- Bereiten Sie die Zellkulturen für die Exposition durch Entfernen der überstehenden Medien und Zugabe von frischem Medium (basolateralen Medien in ALI-Kulturen). Alle Vorbehandlungen mit Agenten konnte zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden.
- Expose die ALI Kulturen der Epithelzellen der Atemwege zu Cl 2-Gas (50, 100 oder 300 ppm für 30 Minuten) in den beiden verschlossenen Polysulfon biocontainment Kammern. Die Herzmuskelzellen (untergetaucht oder konfluenten Kulturen auf Membranen) auf 50 oder 100 ppm Cl 2 für 15 Minuten ausgesetzt.
- Nach der Belichtung bündig die Kammern mit Luft, bis das Cl 2 Stand unter 1 ppm und sicher geöffnet werden, um Zellen (innerhalb von 5 min) zu entfernen.
4. Transepitheliale Elektrischer Widerstand (TER) Mess
- Messen Sie die TER der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, ALI, Kulturen mit einem epithelialen voltohmmeter mit einem Paar von Silberchlorid "Stäbchen"-Elektroden.
- Äquilibrieren Sie die Essstäbchen Elektrode in der ALI Medien 15 min vor dem Gebrauch.
- In warmen Medien zur apikalen (1,0 ml) und basolateralen (2,0 ml) und messen Sie die Oberfläche mit den Ess-Stäbchen TER Elektroden der voltohmmeter.
- Tauchen Sie den kürzeren Arm der Elektrode in apikalen Medien und den längeren Arm in den basolateralen Medien. Klicken Sie auf die "Maßnahme"-Taste auf der voltohmmeter, den elektrischen Widerstand zu beurteilen.
- Die voltohmmeter hat die Möglichkeit, Ohm oder k Ohm messen. Subtrahieren den Widerstand über einem zellfreien Kulturträger aus dem Widerstand über jede Zelle gemessen Schicht trans zu ergebenepithelialen Widerstand (TER).
5. Caspase Mess
- Add frischen ALI Medien (2,0 ml) zur basolateralen Oberfläche nach der Belichtung und Inkubation der Zelle bei Raumtemperatur. Sammeln Stand Medien bei 4 und 24 Stunden.
- Messen Sie Caspase 3/7 Aktivität in den Medienüberständen mit Hilfe eines kommerziellen Caspase 3/7 Assay-Kit.
6. Western Blot und Immunzytochemie
- Führen Western Blots mit Zelllysaten wie zuvor beschrieben 10. Hängen Sie das Proteinlysat (20 ug) in 5x Probenpuffer reduziert und kochen für 5 min. Betreff des Proteinlysat SDS-PAGE (4-15%) und die Übertragung der getrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran durch elektrophoretische Blot.
- Blockieren nicht-spezifischer Bindung durch Inkubation der Membran mit 5% Milch in Waschpuffer (PBS + 0,1% Detergens) und die Sonde die Membranen mit primärem Antikörper gegen Actin SERCA2 oder sarcomeric bei 1:1000 Verdünnung, über Nacht bei 4 ° C. Weiter, waschen und Inkubation mit den jeweiligen Membranen Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper zu entwickeln und für den Nachweis nach wie vor mit handelsüblichen 10-Peroxidase-Nachweis-Kit beschrieben.
- Für Immunzytochemie Behandlung lebenden Zellen auf Einlagen oder Deckgläschen in 6-Well-Platten für 20 min nach dem Spülen mit PBS mit 0,4% gewachsen Triton-X-100 in 10 mM Natriumcitrat-Puffer.
- Block unspezifische Bindung durch Behandlung der Zellen mit 5% Eselserum für 20 min inkubiert und dann die Zellen mit nicht-spezifischen IgG oder einzelne primäre Antikörper spezifisch sarcomeric Actin oder Ki-67.
- Waschen der Zellen mit PBS und Inkubation mit Fluoreszenz-konjugierte sekundäre Antikörper an den primären Antikörper und einem Nuklearfarbstoff (1 &mgr; g / ml DAPI) zu erfassen.
- Mit PBS waschen und montieren Deckgläser mit handelsüblichen Montage Medien.
- Visualisieren Sie die Färbung mit einem Fluoreszenzmikroskop.
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Representative Results
Primäre stabförmigen Kardiomyozyten befestigen auf Laminin Matrizen und zu verbreiten und differenzieren sich in konfluenten Kulturen (Abbildung 1A und seinen Kasten). Diese Zellen wurden weiter auf der Grundlage des sarko Aktin und SERCA2 Ausdruck (Fig. 1B und 1C) gekennzeichnet. Kardiomyozyten sind sehr anfällig für Chlor Toxizität als 15 min Einwirkung von 100 ppm Chlor verursachte umfangreiche Zellabrundung und Tod in Submerskulturen und Störungen der konfluente Schichten von Zellen auf Laminin-beschichtete Membranen (1D) gezüchtet. Es wurde ebenfalls verbessert apoptotischen Zelltod durch Caspase angegeben 7.3 Release in Kardiomyozyten auf Einsätze (1E) gewachsen.
Die Exposition von differenzierten humanen Epithel der Atemwege (Abbildung 2, auf Platte 1 eingelassen, die einen Querschnitt der Zellkultur-Einsätze mit säulenförmig, Flimmer-und Becherzellen) zu Chlor verursacht Häutung und lifting von Zellmembranen sowohl bei niedrigen (100 ppm) und hoher (300 ppm)-Konzentrationen (Abbildung 2 Tafel A2 und A3). Schäden, die durch geringen Chlorkonzentrationen wurde schnell umgekehrt (Abbildung 2 Panel A5), jedoch Zellen zu höheren Chlorkonzentrationen ausgesetzt verzögert hatte oder keine Reparaturfähigkeit (Abbildung 2 Tafel A6) wie durch visuelle Inspektion sowie die Zellproliferation Bewertung durch Ki-67 gezeigt Färbung (Abbildung 2 Panel A9). Trans epithelialen elektrischen Widerstand, TER-Messungen und Caspase-Aktivität weiter bestätigt diese Ergebnisse und den Nachweis erbringen, für den Verlust der Membranintegrität und apoptotischen Zelltod nach Chlor Exposition (Abbildung 2, Abbildung B und C). Somit unsere Studien beschreiben die Entwicklung eines in vitro-Cl 2-Belichtungssystem, die den Verlust der Membranintegrität und Tod Atemwegsepithel und Herzmuskelzellen verursacht. Dieser Effekt kann nicht durch nicht-physiologischen pH-Veränderungen in den Herzmuskelzellen als seinder pH-Wert des Mediums nach der Einwirkung von Chlor bei etwa 7,4 gehalten, wie durch Verwendung eines pH-Meters in der gesammelten Medien Nachbelichtung gemessen.
Abbildung 1. Rat Kardiomyozyten Isolation und der Exposition gegenüber Chlor. Ratten Kardiomyozyten wurden isoliert, wie im Protokoll beschrieben und auf Laminin-beschichteten Kunststoffschalen (Panel A, ein Vertreter lichtmikroskopische Aufnahme) oder Laminin beschichteten Einsätze plattiert. Auf Tafel A Einschub zeigt ein stabförmiges Kardiomyozyten Verbreitung und Differenzierung. Die Kardiomyozyten wurden ebenfalls auf der Basis der sarcomeric Aktin-Expression (Abbildung B zeigt eine durch Immunfluoreszenz-und Spur ein Panel C zeigt einen repräsentativen Western-Blot-Scan repräsentatives Bild) und reichlich SERCA2 Ausdruck (Panel C Spur b) gekennzeichnet. Chlor-Exposition (100 ppm 15 min) verursachte umfangreiche Zelltod inSubmerskulturen sowie der Unterbrechung der Zellmonoschicht auf der Inserts (Panel D zeigt die repräsentativen Mikroaufnahmen). Caspase 3/7 Release (Panel E) in der überstehenden Medien von Kardiomyozyten auf Einsätze geworden, bei 4 Stunden und 24 Stunden nach der Exposition Chlor wurde auch gemessen, wie im Text beschrieben. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte ± SEM und * signifikant (p <0,05) Unterschied von 0 ppm Kontrolle.
2. Wirkung von Chlor Exposition auf differenzierte menschliche Luftwegsepithelzellen Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) Kulturen. Menschliche Luftwegsepithelzellen basalen Zellen wurden auf Kollagen beschichteten snapwells kultiviert. Nach Tag 5 der apikale Medium wurde entfernt. Differenzierte Kulturen (bestehend aus Grund, Flimmer, säulenförmig, und Becherzellen wie in der Neben in Top-lef gezeigtt Tafel Tafel A) wurden zu Chlor (100 oder 300 ppm) für 30 min ausgesetzt. Die TER wurde gemessen und Medien geändert wurde und die Zellen für 24 Stunden inkubiert. Nach 24 h TER wurde erneut für die Caspase-Release Messung gemessen und apikal Medien gesammelt und die Zellmembranen wurden für die Immunhistochemie fixiert. Der offene Pfeil im Feld A die Teile 2 und 3 zeigt abgestoßen Epithelschicht und schwarze Pfeile zeigen leere Räume auf dem Einsatz. Die Pfeilspitze in A Teil 5 zeigt regenerierte Epithel. Teile 7, 8 und 9 zeigen die Zellproliferation durch Ki-67-Immunfärbung beurteilt. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte ± SEM und * signifikant (p <0,05) Unterschied von 0 ppm Kontrolle.
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Discussion
Die häufigste Form der akuten toxischen Expositionen tritt auf, wenn man eine giftige Chemikalie in die Lunge atmet. Diese Chemikalien können auch schnell in den Blutkreislauf aufgenommen werden und andere Organe wie Herz und Gehirn beeinflussen. Giftigkeit beim Einatmen von verschiedenen Agenten mit Hilfe von Tiermodellen untersucht und darüber berichtet, aber die Mechanismen sind weniger gut verstanden. Dies ist eine große Hürde bei der Entwicklung wirksamer Therapien. Das Fehlen von in-vitro-Belichtungssysteme ist ein Hauptgrund für den Mangel an mechanistischen Einsichten. Hier beschreiben wir Zellkulturmodelle des Herzmuskels und der Atemwege, um toxische Auswirkungen inhalierten Chemikalien wie Chlor-Exposition. Chlor reagiert schnell mit wässriger Salzsäure Oberflächen und Hypochlorsäure 3,11,12 bilden. Chlor kann auch mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu kombinieren, um hochreaktive Verbindungen, die zur Oxidation von kritischen Proteine und Enzyme der Atemwege führen können Flächen 13 zu erzeugen. StudiumVerwendung Submerskulturen nur Wirkungen von Nebenprodukten, wie HOCl im Falle von Chlor anstelle des Gases selbst zu zeigen. Exposure von differenzierten ALI Kulturen von menschlichen hier beschriebenen Epithelzellen der Atemwege erlauben würde Studie der direkten Wechselwirkungen von TIC wie Chlor mit Zelloberflächen in Abwesenheit von wässrigen Medien ähnlich dem, was in vivo auftritt.
Mit primären Ratten-Herzmuskelzellen beschreiben wir auch, dass Chlor Exposition bewirkt eine schnelle Zelltod in taucht Kulturen. Diese Zellen sind nicht in der Lage zu wachsen ALI sie nicht polarisieren und bilden feste Verbindungen. Daher haben wir auch konfluenten Kulturen von Kardiomyozyten auf Einsätze mit einer dünnen Schicht von Medien gezüchtet verwendet. Belichtungs dieser Zellmonoschichten zu Chlor nachgewiesen Membranzerstörung und verbesserte Caspase Release hindeutet Apoptose eine Rolle spielen.
Diese Studie zeigt, dass die Atemwege (das primäre Ziel der Inhalation durch die ALI kulturellen repliziert werden kann,n) sowie Organe, wie Herz, nicht ALI wachsen können unter Verwendung von in vitro-Belichtungssysteme untersucht werden. Diese in vitro Exposition Modelle können leicht angepasst werden, um Effekte anderer giftiger inhalierten Chemikalien (TIC) zu beurteilen. Mit Hilfe dieser Modelle, die wir antizipieren, um detaillierte mechanistische Verständnis der Toxizitäten bieten und entwickeln neue Strategien, um die toxischen Veranstaltungen mit TIC / Chlor zu mindern und dann bewerten sie weiter in vivo. Obwohl diese Forderungen sind von kurzer Dauer das Belichtungssystem braucht, um Zellkulturbedingungen besser zu replizieren. Exposition gegenüber Gasen, wie Chlor schränkt die Verwendung von Feuchtigkeit, da es die Vorrichtung zu korrodieren. Die ALI-Kulturen könnte erschüttert werden, um die Atmung zu simulieren, wie bereits in unserem System 14,15 Ozonbelastung eingesetzt. Wir arbeiten in diesen Richtungen.
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Acknowledgments
Diese Forschung wird von der CounterACT Programm, National Institutes of Health (NIH), das Büro des Direktors, und dem National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Grant Number U54 ES015678 (CWW) unterstützt. SA wird auch von Kinderkrankenhaus Colorado / Colorado School of Mines Collaboration Pilot-Award # G0100394 und Kinderklinik Colorado Forschung Institue Pilot-Award # G0100471 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
References
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