Summary
इस प्रोटोकॉल साँस जहरीले रसायनों को सेल संस्कृतियों का जोखिम विधि का प्रदर्शन करने के लिए बनाया गया है. विभेदित हवा तरल इंटरफेस airway उपकला कोशिकाओं की (अली) संस्कृतियों का एक्सपोजर क्लोरीन जैसे विषैली गैसों को airway निवेश का एक अनूठा मॉडल उपलब्ध कराता है. इस पांडुलिपि में हम क्लोरीन उपकला कोशिकाओं की हवा तरल इंटरफेस संस्कृतियों पर जोखिम और cardiomyocytes के जलमग्न संस्कृति के प्रभाव का वर्णन. इन विट्रो जोखिम प्रणालियों महत्वपूर्ण यंत्रवत अध्ययनों तो उपन्यास चिकित्सीय एजेंट विकसित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि रास्ते का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देते हैं.
Abstract
सेल संस्कृतियों पूर्व पशु मॉडल में उनके उपयोग के लिए चिकित्सीय एजेंट की प्रभावकारिता को विकसित करने और अध्ययन करने के लिए अपरिहार्य हैं. हम अच्छी तरह से विभेदित मानव airway उपकला और हृदय की मांसपेशी कोशिकाओं मॉडल के लिए अद्वितीय क्षमता है. यह सामान्य रूप से सेल सतहों के साथ बातचीत, और पानी के साथ प्रतिक्रिया, और जलमग्न संस्कृतियों में उनके प्रभाव को सीमित करने पर विभिन्न byproducts के रूप कर सकते हैं कि क्लोरीन जैसे जहरीले साँस रसायन, के हानिकारक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण हो सकता है. एयर liqiuid इंटरफेस में अच्छी तरह से विभेदित मानव airway उपकला सेल संस्कृतियों का प्रयोग हमारे मॉडल इस सीमा में गतिरोध उत्पन्न करने के साथ ही संभावित जहरीला साँस रसायनों की विषाक्तता के महत्वपूर्ण तंत्र का मूल्यांकन करने का अवसर प्रदान करता है. हम झिल्ली अखंडता का बढ़ाया हानि, ऐसे क्लोरीन जोखिम के रूप में विषाक्त साँस रासायनिक पर कस्पासे रिहाई और मृत्यु का वर्णन है. इस अनुच्छेद में, हम स्तनधारी दिल और airway उपकला सी में क्लोरीन जोखिम मॉडल करने के तरीकों का प्रस्तावसंस्कृति और इन प्रकार की कोशिकाओं पर इसके प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए सरल परीक्षण में एल्स.
Introduction
विषाक्त साँस रसायन (tics) के लिए जोखिम / क्लोरीन (सीएल 2) के रूप में गैसों आकस्मिक जोखिम में के रूप में अच्छी तरह से एक रासायनिक खतरा एजेंट के रूप में अपनी क्षमता के इस्तेमाल में चल रहे एक स्वास्थ्य चिंता का विषय बनी हुई है. फेफड़ों प्राथमिक लक्ष्य कर रहे हैं, जैसे हृदय और मस्तिष्क के रूप में अंगों को भी vivo मॉडल आम तौर पर tics से परीक्षण विषाक्तता के लिए उपयोग किया जाता है. 1-3 से प्रभावित हैं, लेकिन विषाक्तता मूल्यांकन के लिए इन विट्रो assays में प्रभावी लागत, सरल तेजी से और अधिक कर रहे हैं. में इन विट्रो मॉडल भी vivo में मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल हो सकता है कि एजेंट सेल बातचीत की व्यापक जांच के लिए अनुमति देते हैं. ऐसे में इन विट्रो जोखिम प्रणालियों दुर्लभ हैं और इसके अलावा, विषाक्त एजेंटों कोशिकाओं डूबे हुए हैं जिसमें संस्कृति के माध्यम से जोड़ रहे हैं, जहां कुछ पारंपरिक मॉडल में, एजेंट के गुणों के कारण बातचीत और मध्यम में घटकों के लिए बाध्य करने के लिए परिवर्तित कर सकते हैं. जैसे इस तरह के परिदृश्यों सेल संस्कृति प्रणालियों में हवा तरल इंटरफेस (अलीसीधे गैसीय एजेंटों को उजागर किया जा सकता है कि यहां प्रस्तावित प्राथमिक मानव airway उपकला कोशिकाओं, के) संस्कृतियों का वादा किया जा सकता है.
Airway अस्तर उपकला कोशिकाओं साँस जहरीले रसायनों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति रहे हैं. मानव airway उपकला फेफड़ों में लुमेन और अंतर्निहित कोशिकाओं के बीच एक शारीरिक बाधा रूपों और फेफड़ों की प्रतिक्रिया में भाग लेता है. यह एक साइटोकिन्स और अन्य समर्थक और विरोधी भड़काऊ एजेंटों की संख्या के साथ ही उपकला कवर बलगम / airway सतह तरल (एएसएल) स्रावित करता है पैदा करता है. इन विट्रो संस्कृति सिस्टम में डूबे हुए परम्परागत में सीमाओं में से एक उपकला सतह को कवर किया है कि एएसएल और बलगम हटा या पतला है कि भी है. यह हवा के संपर्क में हैं कि फेफड़ों की उपकला कोशिकाओं के शारीरिक हालत को प्रतिबिंबित नहीं करता. इस प्रकार, घरेलू विषाक्तता परीक्षण के लिए इन विट्रो प्रणाली में एक आदर्श इस संरचना को दोहराने चाहिए. तेजी से जांच एम के विकास में बहुत रुचि हैविवो विषाक्तता में अनुमान है कि ethods. अली से बढ़ी उपकला कोशिकाओं को अलग और अच्छी तरह से विभेदित संरचना और कार्य जलमग्न विकसित कोशिकाओं की तुलना में और वायुमार्ग की एक बेहतर मॉडल की सेवा.
इस अध्ययन में, हम मानव airway की हवा तरल इंटरफेस संस्कृति जहरीला साँस गैस विषाक्तता परीक्षण के लिए (tracheobronchial) उपकला कोशिकाओं के उपयोग का वर्णन है और इसलिए विषाक्तता का एक और महत्वपूर्ण लक्ष्य का अध्ययन, cardiomyocyte की एक जलमग्न सेल संस्कृति के साथ तुलना करें.
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Protocol
1. चूहा cardiomyocyte संस्कृति
- सभी प्रयोगों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति, IACUC द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत प्रदर्शन किया गया.
- पहले 4 वर्णित तरीकों का उपयोग नर चूहों के दिलों (निलय) (240-260 ग्राम) से चूहे cardiomyocytes प्राप्त करते हैं. (100 मिलीग्राम / किग्रा, पैर के अंगूठे चुटकी विधि द्वारा संज्ञाहरण की पुष्टि) संक्षेप में, pentobarbital की intraperitoneal इंजेक्शन का उपयोग जानवरों anesthetize और फिर 10.0 मिलीलीटर, क्रेब्स घंटी बफर, पीएच 7.4 से युक्त 1 मिमी सीए 2 + में दिलों को हटा दें.
- रक्त को निकालने और फिर 0.02% प्रोटीज और 0.06% collagenase ए (5.0 मिलीग्राम / दिल) युक्त एक सीए 2 + मुक्त क्रेब्स घंटी बफर करने के लिए स्विच करने के लिए दिल 5-6X कुल्ला. कभी कभी झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए इस समाधान में दिलों को सेते हैं.
- 10-15 मिनट के बाद, एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए सीए 2 + मुक्त क्रेब्स घंटी बफर के साथ एंजाइमी समाधान बाहर धोने. झूलता हुआ ऊतक हम से कोशिकाओं को रिलीजऊपर और नीचे कई बार निलंबन pipetting द्वारा एक 25 एमएल पिपेट आईएनजी.
- एक 70 माइक्रोन नायलॉन जाल के माध्यम से छान कर ऊतक से कोशिकाओं को अलग और उन्हें 0.1 मिमी सीए 2 + युक्त क्रेब्स घंटी बफर में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. 0.2 मिमी सीए 2 + युक्त 1.0 एमएल क्रेब्स घंटी बफर में सेल गोली निलंबित.
- ध्यान nonmyocytes से cardiomyocytes अलग है और उन्हें 30 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए, 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में से अधिक 5.0 मिलीलीटर 60 माइक्रोग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin, बीएसए, परत. cardiomyocytes भारी होते हैं और ट्यूब के नीचे करने के लिए कदम. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला कोशिकाओं और मीडिया निकालें. आगे कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए एक बार इस चरण को दोहराएँ.
- धीरे - धीरे निलय myocytes / cardiomyocytes 1.0 मिमी सीए 2 + युक्त बफर करने के लिए (0.25 मिमी, 0.5 मिमी, 0.75 मिमी, और 1.0 मिमी सीए 2 + युक्त बफर का उपयोग चरणों में) धोने और Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम से मिलकर ACCT मध्यम में resuspended संक्रमण , DMEM containiएनजी 2 मिलीग्राम / एमएल BSA, 2 मिमी एल carnitine, 5 मिमी creatine, 5 मिमी बैल की तरह, 100 आइयू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन.
- 100 मिमी या 35 मिमी laminin पर 100 से 150 कोशिकाओं / 2 मिमी के घनत्व पर ACCT माध्यम में cardiomyocytes प्लेट laminin (1 ग्राम / 2 सेमी) के साथ precoated प्लास्टिक संस्कृति व्यंजन या 40 x 22 मिमी कांच coverslips लेपित. 1 घंटा बाद, संलग्न नहीं कर रहे हैं कि कोशिकाओं को दूर करने के लिए 2.0 मिलीलीटर ACCT के साथ बर्तन धोने. ताजा मीडिया के 10.0 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को सेते हैं.
मानव airway उपकला बेसल कोशिकाओं के 2. विभेदित हवा तरल इंटरफेस (अली) संस्कृति
- संस्थागत समीक्षा बोर्ड के तहत राष्ट्रीय रोग अनुसंधान इंटरचेंज से मानव tracheobronchial ऊतकों की खरीद प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी. सेल फसल और एक प्रकाशित प्रक्रिया 5,6 का उपयोग संस्कृति प्रदर्शन करते हैं. यदि आवश्यक हो तो वे tics को मानव साँस लेना जोखिम के लिए एक सटीक मॉडल के रूप में यह प्रक्रिया सेल संस्कृतियों का उपयोग करता है, तथापि, एक अलग और अली मो पर विकसित कर सकते हैंऔर / या चूहे airway उपकला कोशिकाओं 7,8 का उपयोग करें.
- संक्षेप में, सभी संयोजी ऊतक और लिम्फ नोड्स को हटाने के बाद ऊतक के छोटे टुकड़े (~ ¼ इंच) बनाते हैं. Lactated घंटी समाधान में ऊतक कई बार धोएं. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ऊतकों जोड़ें और (न्यूनतम आवश्यक मीडिया, सदस्य, द्रव अनुपात (1:10) करने के लिए ऊतक में 1% Protease/0.01% DNase) प्रोटीज समाधान जोड़ने.
- रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक रॉक. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़कर ऊतक की हदबंदी समाप्त करें. एक शल्य चिकित्सा स्केलपेल के साथ उपकला सतह परिमार्जन और centrifugation (10 मिनट के लिए 2000 rpm) द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा.
- Fulcher एट अल 9 से विस्तार में वर्णित के रूप में तैयार विशेष अली मध्यम में कोलेजन में लिपटे snapwells पर पारित होने से एक पर प्लेट कोशिकाओं. शिखर मीडिया को निकाल कर हवा तरल इंटरफेस (अली) को बदलने से पहले 5 दिनों के लिए संस्कृति.
- हर दूसरे दिन अली मीडिया का उपयोग कोशिकाओं फ़ीड और कोशिकाओं को अतिरिक्त 2-3 सप्ताह (के लिए अंतर करने की अनुमतिजोखिम के प्रदर्शन से पहले कई पिटाई सिलिया और बलगम स्राव) निरीक्षण करते हैं. मीडिया में परिवर्तन के साथ गर्म पीबीएस के साथ शिखर सतह धो लें.
3. क्लोरीन एक्सपोजर
- आकस्मिक क्लोरीन लीक होने की स्थिति में कर्मियों के प्रदर्शन को रोकने के लिए आवश्यक माध्यमिक रोकथाम प्रदान करता है कि 100 एफ पी एम की एक संचालन अंकित वेग के साथ एक योग्य रासायनिक हुड के अंदर क्लोरीन जोखिम प्रणाली (CES) होते हैं.
- मामूली सकारात्मक दबाव (पानी की 0.5 इंच) के तहत इस प्रणाली का संचालन. सूखी हवा 15 एल / मिनट और क्लोरीन वांछित अंतिम क्लोरीन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए तंग आ गया है की एक उचित स्तर पर खिलाया जाता है. कक्षों 4 छोटा BCU ताले और दबाव मुहर प्रदान करने के लिए एक कम durometer सिलिकॉन गैसकेट के साथ एक बंद ढक्कन है.
- एक जन प्रवाह नियंत्रक के माध्यम से सीएल 2 मिश्रण उद्धार. CES शुष्क नाइट्रोजन में सीएल 2 1.0% से युक्त एक संकुचित गैस सिलेंडर का उपयोग करता है.
- का उपयोग कमजोर पड़ने airflow विनियमितकस्टम नियंत्रण कक्ष बनाया गया है और इसी जोखिम कक्षों के लिए दिया सीएल 2 एकाग्रता को विनियमित. एक कम मात्रा नमूना पंप फिर विश्लेषक से जुड़ा एक डेटा लकड़हारा पर दर्ज कर रहे हैं कि सांद्रता पर नजर रखने के लिए एक क्लोरीन विश्लेषक में कक्षों से निकास खींचती है.
- पहले प्रदर्शन के बराबर वितरण और निकास दरों आश्वस्त करने के लिए एक फ्लो मीटर का उपयोग कर कक्षों के भीतर प्रवाह दर को मापने.
- सतह पर तैरनेवाला मीडिया को दूर करने और नए सिरे से मीडिया (अली संस्कृतियों में basolateral मीडिया) जोड़कर निवेश के लिए सेल संस्कृतियों तैयार करें. एजेंटों के साथ कोई pretreatments इस समय में किया जा सकता है.
- दो मुहरबंद polysulfone biocontainment कक्षों में सीएल 2 गैस (50, 100, या 30 मिनट के लिए 300 पीपीएम) के लिए airway उपकला कोशिकाओं के अली संस्कृतियों का खुलासा. cardiomyocytes (जलमग्न या झिल्ली पर संस्कृतियों मिला हुआ) 15 मिनट के लिए 50 या 100 पीपीएम क्लोरीन 2 के संपर्क में हैं.
- प्रदर्शन के बाद सी जब तक हवा के साथ कक्षों फ्लशएल 2 स्तर 1 पीपीएम से नीचे गिर जाता है और सुरक्षित रूप से (5 मिनट के भीतर) कोशिकाओं को हटाने के लिए खोला जा सकता है.
4. Transepithelial विद्युत प्रतिरोध (आतंकवाद) मापन
- हवा तरल इंटरफेस के आतंकवाद उपाय, अली, चांदी क्लोराइड "chopstick" इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी के साथ एक उपकला voltohmmeter का उपयोग संस्कृतियों.
- उपयोग से पहले अली मीडिया 15 मिनट में chopstick इलेक्ट्रोड संतुलित करना.
- सतह (2.0 मिलीग्राम) (1.0 मिलीलीटर) शिखर और basolateral को गर्म मीडिया जोड़ें और voltohmmeter की chopstick इलेक्ट्रोड का उपयोग आतंकवाद के लिए उपाय.
- शिखर मीडिया में इलेक्ट्रोड का कम हाथ और basolateral मीडिया में लंबे समय तक हाथ डुबकी. विद्युत प्रतिरोध का मूल्यांकन करने के voltohmmeter पर 'उपाय' बटन पर क्लिक करें.
- voltohmmeter ओम या कश्मीर ओम उपाय करने का विकल्प है. ट्रांस उपज के लिए प्रत्येक कोशिका परत भर में मापा प्रतिरोध से एक सेल मुक्त संस्कृति समर्थन भर में विरोध घटाएँउपकला प्रतिरोध (आतंकवाद).
5. कस्पासे मापन
- Basolateral सतह पोस्ट प्रदर्शन करने के लिए ताजा अली मीडिया (2.0 मिलीलीटर) जोड़ें और कमरे के तापमान पर सेल सेते हैं. 4 और 24 घंटे में सतह पर तैरनेवाला मीडिया लीजिए.
- एक वाणिज्यिक कस्पासे 3/7 परख किट का उपयोग करके मीडिया supernatants में कस्पासे 3/7 की गतिविधि को मापने.
6. वेस्टर्न ब्लाट और Immunocytochemistry
- पहले से वर्णित के रूप में 10 सेल lysates का उपयोग पश्चिमी blots प्रदर्शन करना. 5x कम नमूना बफर में प्रोटीन lysate (20 ग्राम) सस्पेंड और 5 मिनट के लिए उबाल. एसडीएस पृष्ठ (4-15%) करने के लिए प्रोटीन lysate विषय और electrophoretic सोख्ता द्वारा एक nitrocellulose झिल्ली अलग प्रोटीन हस्तांतरण.
- धोने बफर में 5% दूध (पीबीएस + 0.1% डिटर्जेंट) के साथ झिल्ली incubating द्वारा गैर विशिष्ट बंधन ब्लॉक और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर, 1:1,000 कमजोर पड़ने पर SERCA2 या sarcomeric actin के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की जांच. इसके बाद, धोने और सेते झिल्ली संबंधित peroxidase संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ और वाणिज्यिक peroxidase जांच किट का उपयोग कर 10 से पहले के रूप में वर्णित का पता लगाने के लिए विकसित करना.
- Immunocytochemistry के लिए पीबीएस के साथ rinsing के बाद 20 मिनट के लिए 10 मिमी सोडियम साइट्रेट बफर में 0.4% ट्राइटन-X-100 के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटें में सम्मिलित करता है या कांच coverslips पर हो जीवित कोशिकाओं का इलाज.
- ब्लॉक अविशिष्ट 20 मिनट के लिए 5% गधा सीरम के साथ कोशिकाओं के इलाज, और फिर sarcomeric actin या Ki-67 के लिए विशिष्ट गैर विशिष्ट आईजीजी या व्यक्तिगत प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते द्वारा बाइंडिंग.
- पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और प्राथमिक एंटीबॉडी और एक परमाणु दाग (1 ग्राम / एमएल DAPI) का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं.
- पीबीएस के साथ धोएं और वाणिज्यिक बढ़ते मीडिया का उपयोग coverslips माउंट.
- एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग धुंधला कल्पना.
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Representative Results
प्राथमिक छड़ के आकार cardiomyocytes laminin matrices पर देते हैं और (चित्रा 1 ए और उसके इनसेट) में फैला है और मिला हुआ संस्कृतियों में अंतर. इन कोशिकाओं को आगे sarcomeric actin और SERCA2 अभिव्यक्ति (आंकड़े 1 बी और 1 सी) के आधार पर होती थी. चूहा cardiomyocytes laminin लेपित झिल्ली (चित्रा -1) पर विकसित कोशिकाओं पर जलमग्न संस्कृतियों और मिला हुआ परतों के विघटन में व्यापक सेल गोलाई और मौत का कारण बना 100 पीपीएम क्लोरीन को 15 मिनट के लिए जोखिम के रूप में क्लोरीन विषाक्तता को अत्यधिक अतिसंवेदनशील होते हैं. कस्पासे द्वारा सम्मिलित करता है (चित्रा 1E) पर हो cardiomyocytes में 3/7 रिलीज संकेत के रूप में वहाँ भी apoptotic कोशिका मृत्यु को बढ़ाया गया था.
विभेदित मानव airway उपकला के एक्सपोजर (सेल संस्कृति के एक क्रॉस सेक्शन दिखा पैनल 1 के लिए इनसेट चित्रा 2, स्तंभ के साथ सम्मिलित करता रोमक और कोशिकाओं जाम) क्लोरीन के sloughing और lif कारण(100 पीपीएम) और उच्च (300 पीपीएम) सांद्रता (चित्रा 2 पैनल A2 और A3) कम दोनों में कोशिका झिल्ली की ting. कम क्लोरीन सांद्रता से नुकसान जल्दी से (चित्रा 2 पैनल A5), हालांकि, उच्च क्लोरीन सांद्रता के संपर्क में कोशिकाओं में देरी या कोई मरम्मत की क्षमता की 67 से दृश्य निरीक्षण के साथ ही सेल प्रसार आकलन से पता चला के रूप में (चित्रा 2 पैनल ए 6) था उलट था (चित्रा 2 पैनल ए 9) धुंधला हो जाना. ट्रांस उपकला विद्युत प्रतिरोध, आतंकवाद माप और कस्पासे गतिविधि आगे इन परिणामों की पुष्टि की और क्लोरीन जोखिम पर झिल्ली अखंडता और apoptotic कोशिका मृत्यु का नुकसान (चित्रा 2, पैनल बी और सी) के लिए सबूत प्रदान करते हैं. इस प्रकार हमारे अध्ययन झिल्ली अखंडता के नुकसान और airway उपकला और cardiomyocytes की मौत का कारण बनता है कि इन विट्रो में एक सीएल 2 जोखिम प्रणाली के विकास का वर्णन. इस आशय के रूप में cardiomyocytes में गैर शारीरिक पीएच परिवर्तन के कारण नहीं हो सकताएकत्र मीडिया postexposure में एक पीएच मीटर का उपयोग करके मापा के रूप में क्लोरीन के प्रदर्शन के बाद मीडिया के पीएच ~ 7.4 पर बनाए रखा गया था.
प्रोटोकॉल में वर्णित और laminin लेपित प्लास्टिक के बर्तन (एक पैनल, एक प्रतिनिधि प्रकाश सूक्ष्म छवि) या laminin लेपित आवेषण पर चढ़ाया रूप में चित्रा 1. चूहा cardiomyocyte अलगाव और क्लोरीन. चूहा cardiomyocytes के लिए जोखिम अलग थे. पैनल को बैठाना एक छड़ी के आकार का cardiomyocyte प्रसार और फर्क पता चलता है. cardiomyocytes भी और प्रचुर मात्रा में SERCA2 अभिव्यक्ति (पैनल सी गली ख) (immunofluorescence द्वारा पता लगाया है और एक एक प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा स्कैन दिखा पैनल सी लेन एक प्रतिनिधि छवि दिखा पैनल बी) sarcomeric actin अभिव्यक्ति पर आधारित होती थी. क्लोरीन जोखिम (100 पीपीएम 15 मिनट) में व्यापक कोशिका मृत्यु का कारण बनाजलमग्न संस्कृतियों के रूप में अच्छी तरह से सम्मिलित करता है (प्रतिनिधि photomicrographs दिखा पैनल डी) पर सेल monolayer के विघटन के रूप में. पाठ में वर्णित के रूप में 4 घंटे और 24 घंटे बाद क्लोरीन जोखिम में, आवेषण पर हो cardiomyocytes की सतह पर तैरनेवाला मीडिया में कस्पासे 3/7 रिलीज (पैनल ई) भी मापा गया था. पता चला मान मतलब ± SEM हैं और * 0 पीपीएम नियंत्रण से महत्वपूर्ण (पी <0.05) अंतर को दर्शाता है.
चित्रा 2. विभेदित मानव airway उपकला हवा तरल इंटरफेस (अली) संस्कृतियों. मानव airway उपकला बेसल कोशिकाओं कोलेजन लेपित snapwells पर सुसंस्कृत थे पर क्लोरीन जोखिम का प्रभाव. 5 दिन बाद शिखर मीडिया हटा दिया गया था. भेदभाव रोमक बेसल से मिलकर संस्कृतियों (,, स्तंभ, और शीर्ष LEF में इनसेट में दिखाया गया है कोशिकाओं जामपैनल की टी पैनल) 30 मिनट के लिए क्लोरीन (100 या 300 पीपीएम) के संपर्क में थे. आतंकवाद मापा गया था और मीडिया में बदल गया था और कोशिकाओं 24 घंटे के लिए incubated. 24 घंटा आतंकवाद पर फिर से मापा गया था और शिखर मीडिया एकत्र किया गया था कस्पासे रिलीज माप के लिए और कोशिका झिल्ली immunohistochemistry के लिए तय किया गया. पैनल एक भागों 2 और 3 शो में खुला तीर उपकला परत बंद sloughed और काला तीर डालने पर खाली स्थान को दिखाने के. पैनल में Arrowhead एक हिस्सा 5 पुनर्जीवित उपकला से पता चलता है. Ki-67 immunostaining द्वारा मूल्यांकन के रूप में भाग 7, 8, और 9 शो सेलुलर प्रसार. पता चला मान मतलब ± SEM हैं और * 0 पीपीएम नियंत्रण से महत्वपूर्ण (पी <0.05) अंतर को दर्शाता है.
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Discussion
एक फेफड़ों में एक जहरीला रसायन साँस लेता है जब तीव्र विषाक्त जोखिम का सबसे आम प्रकार से होता है. इन रसायनों भी जल्दी खून में लिया जा सकता है और इस तरह के मस्तिष्क और दिल के रूप में अन्य अंगों को प्रभावित कर सकता है. पशु मॉडल का उपयोग कर विभिन्न एजेंटों की साँस लेना विषाक्तता का अध्ययन किया और व्यापक रूप से सूचित कर रहे हैं, लेकिन तंत्र कम अच्छी तरह से समझ रहे हैं. यह प्रभावी उपचारों के विकास में एक बड़ी बाधा है. इन विट्रो जोखिम प्रणालियों की अनुपस्थिति यंत्रवत अंतर्दृष्टि की कमी के पीछे एक मुख्य कारण है. यहाँ हम हृदय की मांसपेशी और वायुमार्ग ऐसे क्लोरीन जोखिम के रूप में विषाक्त साँस रसायनों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सेल संस्कृति मॉडल का वर्णन. क्लोरीन हाइड्रोक्लोरिक और हाइपोक्लोरस एसिड 3,11,12 के लिए फार्म जलीय सतहों के साथ तेजी से प्रतिक्रिया करते हैं. क्लोरीन भी 13 सतहों airway के महत्वपूर्ण प्रोटीन और एंजाइमों के ऑक्सीकरण को जन्म दे सकती है कि उच्च प्रतिक्रियाशील यौगिकों का उत्पादन करने के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के साथ गठबंधन कर सकते हैं. पढ़ाईजलमग्न संस्कृतियों का उपयोग केवल क्लोरीन के मामले के बजाय गैस ही में इस तरह के HOCL के रूप में उत्पादों द्वारा के प्रभाव को प्रदर्शित कर सकते हैं. यहाँ वर्णित मानव airway उपकला कोशिकाओं के भेदभाव अली संस्कृतियों का एक्सपोजर की अनुमति होगी ऐसी vivo में होता है क्या करने के लिए इसी तरह के जलीय मीडिया की अनुपस्थिति में सेल सतहों के साथ क्लोरीन के रूप में tics का प्रत्यक्ष बातचीत का अध्ययन.
प्राथमिक चूहे cardiomyocytes उपयोग करना, हम भी क्लोरीन जोखिम जलमग्न संस्कृतियों में तेजी से कोशिका मृत्यु का कारण बनता है कि वर्णन. इन कोशिकाओं को वे तंग जंक्शनों फूट डालना और फार्म नहीं है के रूप में अली को विकसित करने में असमर्थ हैं. इसलिए, हम भी मीडिया की एक पतली परत के साथ सम्मिलित करता है पर हो cardiomyocytes के मिला हुआ संस्कृतियों का उपयोग किया. क्लोरीन के लिए इन सेल monolayers का एक्सपोजर झिल्ली विघटन का प्रदर्शन किया और apoptosis सुझाव बढ़ाया कस्पासे रिहाई एक भूमिका निभा सकते हैं.
यह अध्ययन यह दर्शाता है कि अली संस्कृतियों से दोहराया जा सकता है कि साँस लेना के वायुमार्ग (प्राथमिक लक्ष्यऐसे अली पर हो जाना नहीं है कि दिल के रूप में ते) के साथ ही अंगों विट्रो जोखिम प्रणालियों में उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है. ये इन विट्रो जोखिम मॉडल आसानी से अन्य विषाक्त साँस रसायन (tics) के प्रभाव का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इन मॉडलों का प्रयोग हम toxicities की विस्तृत यंत्रवत समझ प्रदान करने और टिक / क्लोरीन के साथ जुड़े विषाक्त घटनाओं को कम करने और फिर विवो में उन्हें आगे का मूल्यांकन करने के उपन्यास रणनीति विकसित करने की आशा है. इन निवेशों अवधि में कम कर रहे हैं, हालांकि जोखिम प्रणाली बेहतर सेल संस्कृति शर्तों को दोहराने की जरूरत है. क्लोरीन जैसे गैसों के संपर्क में यह डिवाइस खुरचना कर सकते हैं के रूप में नमी के उपयोग की सीमा. अली संस्कृतियों पहले हमारी ओजोन जोखिम प्रणाली 14,15 में उपयोग के रूप में श्वसन अनुकरण करने को हिलाकर रख जा सकता है. वर्तमान में हम इन दिशाओं में काम कर रहे हैं.
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Acknowledgments
इस शोध प्रतिक्रिया कार्यक्रम, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच), निदेशक के कार्यालय, और पर्यावरणीय स्वास्थ्य विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थान (NIEHS) अनुदान संख्या U54 ES015678 (CWW) द्वारा समर्थित है. एसए भी बच्चों के अस्पताल खान सहयोग पायलट पुरस्कार # G0100394 और बच्चों के अस्पताल के कोलोराडो अनुसंधान संस्थान पायलट पुरस्कार # G0100471 के कोलोराडो / कोलोराडो स्कूल द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
References
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