Summary
Bu protokol, inhale zehirli kimyasal maddelere maruz kalma, hücre kültürlerinin bir yöntem göstermek için tasarlanmıştır. Farklı hava-sıvı arayüzü hava yolu epitel hücreleri (ALI) kültürler maruz kalmak, klor gibi zehirli gazlar hava yolu maruz eşsiz bir model sağlar. Bu yazıda; klor epitel hücrelerinin hava-sıvı arayüz kültürleri üzerinde maruz kalma ve kardiyomiyositlerde daldınlarak kültür etkisini tarif eder. In vitro maruz sistemleri önemli mekanik çalışmalar, daha sonra yeni terapötik maddelerin geliştirilmesi için yararlanılabilir yollarını belirlemek için izin verir.
Abstract
Hücre kültürleri önce hayvan modellerinde kullanımı için terapötik maddeler, etkinliğini geliştirmek ve çalışma için vazgeçilmezdir. Biz de farklılaştırılmış insan solunum yolu epitel ve kalp kası hücrelerini modellemek için benzersiz bir yeteneğe sahiptir. Bu, normal olarak hücre yüzeyleri ile etkileşim ve su ile reaksiyona sokulması, ve daldırılmış kültürde etkilerini sınırlayarak üzerine çeşitli yan ürünler oluşturabilir, örneğin klor gibi toksik kimyasallar inhale, zararlı etkilerini incelemek için değerli bir araç olabilir. Hava-liqiuid arayüzü de farklılaştırılmış insan solunum yolu epitel hücre kültürleri kullanarak Bizim modelimiz bu sınırlama circumvents yanı sıra potansiyel zehirli solunan kimyasalların toksisite kritik mekanizmalarını değerlendirmek için bir fırsat sağlar. Biz membran bütünlüğünün kaybı gelişmiş, örneğin klor maruz kalma gibi toksik solunan kimyasal, kaspaz salınımı ve ölümü tarif. Bu yazıda, memeli kalp ve solunum yolu epitel c klor pozlama modellemek için yöntemler önermekkültür ve bu hücre tipleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için basit testler arşın.
Introduction
Toksik inhale kimyasal (TIC) maruz / klorin (Cl 2) gibi gazlar kazara maruz kalma, hem de kimyasal bir tehdit madde olarak potansiyel kullanımı devam eden bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Akciğerler birincil hedef olmasına rağmen, bu tür, kalp ve beyin gibi organlar da in vivo modeller genellikle tikler ikinci test toksisite için kullanılır. 1-3 etkilenmez, ancak toksisite değerlendirmesi için in vitro deneylerde maliyet etkin, daha basit, daha hızlı ve daha vardır. In in vitro modeller de in vivo değerlendirmek için zor olabilir aracı-hücre etkileşimlerinin kapsamlı araştırma için izin verir. Bu tür in vitro maruz sistemleri nadirdir ve bundan başka, toksik maddeler, hücrelerin batık edildiği kültür ortamına ilave bazı geleneksel modeller ile, maddelerin özellikleri nedeniyle etkileşimleri ve ortam içinde bileşenlerine bağlanma değiştirebilir. Gibi bu tür senaryolar hücre kültür sistemlerinde hava-sıvı arayüzü (ALI, Gazlı maddeler maruz olabilir burada önerilen birincil insan solunum yolu epitel hücreleri, of) kültürleri umut verici olabilir.
Hava yolunu döşeyen epitel hücreleri solunan toksik kimyasallara karşı ilk savunma hatları. Insan solunum yolu epitel akciğerde lümen ve temel hücreler arasında, fiziksel bir bariyer oluşturur ve akciğerin yanıt olarak katılır. Bu sitokinler ve diğer pro-ve anti-enflamatuar maddelerin sayısı hem de epitel mukus kaplama / hava yolu yüzey sıvısı (ASL) salgılar üretir. In vitro kültür sistemleri batık geleneksel olarak sınırlamalar biri epitel yüzeyini kaplayan ASL ve mukus kaldırıldı veya seyreltilmiş olması aynı zamanda. Bu havaya maruz kalan akciğer epitel hücrelerin fizyolojik durumunu yansıtmaz. Böylece, EFT toksisite testleri için vitro sistemde ideal Bu mimariye çoğaltmak gerekir. Hızlı tarama m yönelik büyük ilgi varvivo toksisitesi tahmin ethods. ALI yetiştirilen epitel hücreleri ayırt var ve iyi farklılaşmış yapıları ve işlevleri batık yetiştirilen hücreler ile karşılaştırıldığında ve hava yollarının üstün bir model işlevi.
Bu çalışmada, insan solunum yolu hava-sıvı arayüzü kültür zehirli Solunum toksisite için test (trakeo) epitel hücreleri kullanılmasını tarif eder ve bu nedenle toksiklik önemli bir hedef eğitim, kardiyomiyosit bir batık hücre kültürü ile karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Rat kardiyomiyosit Kültürler
- Tüm deneyler kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi, IACUC tarafından onaylanan protokoller altında yapıldı.
- Daha önce tarif edilen yöntemler kullanılarak 4 erkek sıçan kalplerinde (ventriküller) (240-260 g), sıçan kardiyomiyositlerde elde edilir. (100 mg / kg; ayak tutam yöntem ile anestezi teyit) Kısaca, pentobarbital intraperitonal enjeksiyonu ile hayvanlara anestezi ve daha sonra 10.0 ml, Krebs Ringer tamponu, pH 7.4 ihtiva eden 1 mM Ca2 + içine kalpleri çıkarın.
- Kan kaldırmak ve daha sonra% 0.02 proteaz ve% 0.06 kollajenaz A (5.0 ml / kalp) içeren bir Ca 2 + ücretsiz Krebs Ringer tamponu geçmek için kalplerini 5-6x durulayın. Ara sıra çalkalanmak suretiyle, 37 ° C'de 10-15 dakika boyunca bu çözelti içinde kalpleri inkübe edin.
- 10-15 dakika sonra, ilave bir 5 dakika boyunca Ca 2 + Krebs Ringer tamponu ile enzimatik çözüm yıkayın. Sarkık doku bize gelen hücreleri bırakınyukarı ve aşağı birkaç kez süspansiyon pipetleme 25 ml pipet ing.
- 70 mikron naylon elek içinden süzme ile doku hücreleri ayırın ve bunları 0.1 mM Ca2 + içeren Krebs Ringer tamponu içinde yerleşmeye izin verir. 0.2 mM Ca2 + 'yı içeren 1.0 ml Krebs Ringer tamponu içerisinde hücre pelletini askıya alınması.
- Dikkatlice nonmyocytes ikinci kardiyomiyositlerde ayrı ve bunları 30 dakika boyunca yerleşmek için izin vermek için 15 ml santrifüj tüplerine üzerine 5.0 ml 60 ug / ml bovin serum albümini, BSA, tabaka. Kardiyomiyositlerde ağırdır ve tüpün altına hareket eder. Süpernatan dikkatlice hücreler ve ortam çıkarın. Ayrıca hücreleri arındırmak için bir kez bu adımı tekrarlayın.
- Yavaş yavaş ventriküler myocytes / kardiyomiyositlerde 1.0 mM Ca2 + içeren tampon (0.25 mM, 0.5 mM, 0.75 mM ve 1.0 mM Ca2 + içeren tampon kullanılarak adımlarla) yıkanması ve Dulbecco Modified Eagle Medium oluşan ACCT ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ile geçiş , DMEM containing 2 mg / ml BSA, 2 mM L-karnitin, 5 mM kreatin, 5 mM taurin, 100 IU / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin.
- 100 mm ya da 35 mm laminin üzerinde 100-150 hücre / mm 2 'lik bir yoğunlukta ACCT ortam içinde kardiyomiyositlerde Plaka laminin (1 ug / cm 2) ile önceden kaplanmış plastik kültür kaplarına ya da 40 x 22 mm cam lamelleri ile kaplı olacaktır. 1 saat sonra, bağlı olmayan hücreleri çıkarmak için 2.0 ml ACCT ile bulaşıkları yıkama. Taze ortam içinde 10.0 ml ilave edilir ve hücreleri inkübe edin.
İnsan Havayolu Epitelyal Bazal Hücre 2. Farklılaştırılmış hava-sıvı arayüzü (ALI) Kültür
- Kurumsal Değerlendirme Kurulu bünyesinde Ulusal Hastalık Araştırma Kavşağı insan trakeabronşial dokuları ittihaz protokolleri onayladı. Hücre hasat ve yayınlanan bir prosedür 5,6 kullanarak kültürünü gerçekleştirmek. Gerekirse onlar tikler insan soluma için kesin bir örnek olarak bu işlemi cep kültürleri kullanır, ancak, bir izole ve ALI mo büyüyebilirve / veya sıçan solunum yolu epitel hücreleri 7,8 kullanın.
- Kısaca, bütün bağ dokusu ve lenf düğümleri çıkardıktan sonra küçük doku parçaları (~ ¼ inç) yapmak. Ringer çözeltisi içinde dokuya birkaç kez yıkayın. 50 ml konik tüp doku ekleme ve (minimum temel ortam, MEM, sıvı oranında (1:10) bir doku içinde% 1 Protease/0.01% DNase) proteaz çözeltisi ekleyin.
- Gece boyunca 4 ° C'de doku sallayın. ,% 10 fetal inek serumu ilave ederek doku ayrışma sona erdirir. Cerrahi bir neşter ile epitel yüzey kazıyın ve santrifüj (10 dakika boyunca 2000 rpm) ile hücreleri toplamak.
- Fulcher ve ark 9 ile detaylı bir şekilde tarif edildiği gibi hazırlanmıştır özel ALI ortam içinde kollajen kaplı snapwells üzerine aktarılarak bir Levha hücreleri. Apikal medya kaldırarak hava-sıvı arayüzü (ALI) değiştirmeden önce 5 gün boyunca kültür.
- Her günaşırı ALI medyayı kullanarak hücreleri beslemek ve hücreler ilave 2-3 hafta için (ayırt etmek için izinmaruz gerçekleştirmeden önce çok sayıda dayak kirpikler ve mukus salgılanmasını) gözlemlemek. Ortam değişiklikleri ile birlikte sıcak PBS ile apikal yüzey yıkayın.
3.. Klor Pozlama
- Kazara klor kaçağı durumunda personelin maruz kalmasını önlemek için gerekli ikincil çevreleme sağlayan 100 fpm operasyonel bir yüzü hızı ile nitelikli bir kimyasal kaput içinde klor pozlama sistemi (CES) içerirler.
- Hafif bir pozitif basıncı su (0.5 inç) altında sistemi çalıştırın. Kuru hava 15 L / dakika ve klor istenen son klor konsantrasyonunu elde etmek için beslenen uygun bir seviyede verilir. Hazneler 4 mini BCU kilitler ve basınç sızdırmazlık sağlamak için düşük bir durometre silikon conta ile bir kilitleme kapağı vardır.
- Bir Kütle Akış Kontrolörü ile Cl 2 karışımı sunun. CES kuru azot Cl 2% 1,0 ihtiva eden bir basınçlı gaz silindiri kullanır.
- Ile seyreltme hava akışını düzenlerözel kontrol paneli tasarlanmış ve benzer poz odalarına teslim Cl 2 konsantrasyonunu düzenler. Düşük hacimli bir örnekleme pompası ardından analizörü bağlı bir veri kayıt cihazı üzerinde kaydedilir konsantrasyonlarını izlemek için bir klor analizörü içine odalarından egzoz çeker.
- Maruz kalmadan önce eşit dağıtım ve egzoz oranlarını sağlamak için bir akış ölçer kullanılarak odaları içindeki akış hızları ölçer.
- Süpernatan ortamı kaldırılması ve taze ortam (ALI kültürlerde bazolateral media) eklenmesi ile etkileşimi için hücre kültürlerinin hazırlanması. Ajanlar ile herhangi önişlemlerinde bu zamanda yapılabilir.
- İki sızdırmaz polisülfon biyolojik tecrit odalarına Cl 2 gazının (50, 100 ya da 30 dakika boyunca 300 ppm) kadar hava yolu epitel hücrelerinin kültürleri ALI Açığa. Kardiyomiyositlerde (batık veya zarda kültürleri ortak akışlı) 15 dakika için 50 veya 100 ppm Cl 2 maruz kalmaktadır.
- Maruz kaldıktan sonra ° C'ye kadar hava odacıkları yıkayınl 2 seviyesi 1 ppm altına ve güvenli bir şekilde (5 dakika içinde) hücreleri çıkarmak için açılabilir.
4. Transepitelyal Elektrik Direnci (TER) Ölçüm
- Hava-sıvı-arayüzü TER ölçün, ALI, gümüş klorür "çubuk" elektrot çifti ile bir epitel voltohmmeter kullanarak kültürler.
- Kullanmadan önce ALI ortam 15 dakika içinde, çubuk elektrot dengelenmesi.
- Yüzey (2.0 mi) (1.0 mi) apikal ve bazolateral sıcak ortam ekleyin ve voltohmmeter ve çubuk elektrotları kullanarak TER ölçer.
- Apikal medyadaki elektrot kısa kol ve bazolateral medyada uzun kolu batırın. Elektrik direncini değerlendirmek için voltohmmeter üzerindeki 'tedbir' düğmesine tıklayın.
- Voltohmmeter ohm veya k ohm seçeneği vardır. Trans elde etmek için her bir hücre tabakası boyunca ölçülen direnci bir hücresiz kültür destek karşısında direnci çıkarmaepitel direnci (TER).
5.. Kaspaz Ölçme
- Basolateral yüzey sonrası maruz taze ALI medya (2.0 ml) ekleyin ve oda sıcaklığında hücreyi kuluçkaya yatmaktadır. 4 ve 24 saat sonra süpernatan ortamı toplayın.
- Ticari bir kaspaz 3/7 deney kiti kullanılarak ortam yüzer kaspaz 3/7 aktivitesi ölçün.
6.. Western Blot ve İmmünositokimya
- Daha önce tarif edildiği gibi, 10, hücre lizatları kullanılarak western blot yapın. 5x örnek tampon maddesi içinde indirgenmiş lizat proteini (20 ug) askıya alma ve 5 dakika kaynatılır. SDS-PAGE (% 4-15) için, protein lizat Konu ve elektroforetik blotting ile bir nitroselüloz membrana ayrılan proteinler aktarın.
- Yıkama tamponu içinde% 5 süt (PBS +% 0.1 deterjan) ile membran inkübe edilerek spesifik olmayan bağlanma bloke edin ve gece boyunca 4 ° C 'de, 1:1000 seyreltmede SERCA2 veya sarkomerik aktine karşı primer antikorlar ile zarlarının ölçülmesi. Daha sonra, yıkama ve inkübe membranlar ilgili peroksidaz-konjuge sekonder antikor ve peroksidaz algılaması ticari bir kit kullanılarak, 10 daha önce anlatıldığı gibi tespiti için geliştirmek.
- Immunositokimya için PBS ile durulandıktan sonra 20 dakika boyunca 10 mM sodyum sitrat tampon maddesi içinde% 0.4 Triton-X-100 ile 6 oyuklu plakalar içinde uçlar ya da cam lameller üzerinde büyümüş canlı hücreleri tedavi.
- Block spesifik olmayan 20 dakika boyunca% 5 eşek serumu ile hücrelerin işlenmesi ve daha sonra sarkomerik aktin ya da Ki-67 spesifik olmayan spesifik IgG veya bireysel primer antikorlar ile inkübe hücreleri ile bağlama.
- Hücrelerin PBS ile yıkayın ve birincil antikor ve bir nükleer boya (1 ug / ml DAPI) tespit etmek için floresan-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.
- PBS ile yıkayın ve ticari montaj medyayı kullanarak lamelleri montaj.
- Bir floresan mikroskop kullanılarak lekelenme gözünüzde canlandırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlköğretim çubuk şekilli kardiyomiyositler laminin matrisler üzerine takmak ve (Şekil 1A ve inset) yaymak ve birleşen kültürlerin içine ayırt. Bu hücreler, bundan başka sarkomerik aktin ve SERCA2 ekspresyonu (Şekil 1B ve 1C) olarak karakterize edilmiştir. Sıçan kardiyomiyositler laminin kaplı membranların (Şekil 1D) üzerinde yetiştirilen hücreler üzerinde batık kültürler ve birleşen tabakalarının bozulmasına geniş hücre yuvarlama ve ölümüne neden 100 ppm klor 15 dakika maruz kalma gibi klor toksisitesi son derece hassastır. Kaspaz ile ara parçaları (Şekil 1 E) üzerinde büyümüş kardiyomiyositlerde 3/7 serbest gösterildiği gibi var apoptotik hücre ölümünü geliştirilmiştir.
Farklılaşmış insan solunum yolu epitel maruz kalması (hücre kültürünün bir kesitini gösteren paneline 1 vaziyettedir, Şekil 2, kolumnar ile ekler silli ve goblet hücreleri) klor dökülmesi ve lif neden oldu(100 ppm) ve yüksek (300 ppm) konsantrasyonları (Şekil 2 Panel A2 ve A3), düşük hem de hücre membranlarının ting. Düşük klor konsantrasyonları ile Hasar hızla (Şekil 2 Panel A5), ancak, yüksek klor konsantrasyonları maruz kalan hücreleri gecikmiş ya da hiç tamir yeteneği Ki-67 ile görsel muayene yanı sıra, hücre çoğalması değerlendirme tarafından gösterildiği gibi (Şekil 2 paneli A6) tersine dönmüş oldu (Şekil 2 paneli A9) boyama. Trans epitel elektrik direnci, TER ölçümleri ve kaspaz aktivitesi ayrıca bu sonuçları doğruladı ve klor maruz kalma üzerine membran bütünlüğü ve apoptotik hücre ölümünün kaybı (Şekil 2 Panel B ve C) için kanıt sağlar. Böylece bizim çalışmalar membran bütünlüğünün kaybı ve hava yolu epitel ve kardiyomiyositlerin ölümüne neden olan bir in vitro Cl 2 poz sisteminin gelişimini betimler. Bu etki olarak kardiyomiyositlerde olmayan fizyolojik pH değişiklikleri nedeniyle olmayabilirToplanan temas sonrası ortam içinde bir pH metre kullanılarak ölçülen klora karşı maruz kaldıktan sonra, ortamın pH değeri 7.4 'de muhafaza edilmiştir.
Protokolde tarif edilen ve laminin ile kaplanmış plastik kaplara (panel A, temsili bir ışık mikroskopik görüntü) veya laminin kaplanmış ekler üzerinde kaplama olarak Şekil 1,. Rat kardiyomiyosit izolasyon ve klor. Sıçan kardiyomiyositlerinde maruz izole edilmiştir. Panel A vaziyettedir bir çubuk şeklinde kardiyomyosit yayma ve ayırt gösterir. Kardiyomiyositlerde ve aynı zamanda bol SERCA2 ifade (panel C şerit b) (bağışıklık ile tespit edilir ve bir temsili bir Western blot tarama arası Panel C şerit temsili bir görüntüsünü gösteren panel B) sarkomerik aktin ekspresyonu göre karakterize edilmiştir. Klor maruz kalma (100 ppm 15 dakika) hücre ölümüne neden olan genişbatık kültürler de ekler (temsilci fotomikrografları gösteren panel D) üzerindeki hücre tek tabaka bozulması gibi. Metinde tarif edildiği gibi, 4 saat ve 24 saat sonrası klor maruz kalma da, ara parça üzerinde yetiştirilen kardiyomiyositlerin süpernatan ortam içinde kaspaz 3/7 serbest bırakma (Panel E) da ölçülmüştür. Değerler, ortalama ± SEM ve * 0 ppm kontrolden anlamlı (p <0.05) bir fark gösterir.
Şekil 2,. Farklılaşmış insan solunum yolu epitel hava-sıvı arayüzü (ALI) kültürleri. Insan solunum yolu epitel hücrelerinin basal kollajen kaplı snapwells üzerinde kültürlenmiştir on klor maruz kalma etkisi. 5 gün sonra, apikal ortam uzaklaştırılmıştır. Farklılaşmış kirpikli bazal oluşan kültürleri (, sütunlu ve üst LEF olarak içerlek gösterildiği gibi goblet hücreleriPanel A t panel), 30 dakika boyunca klor (100 veya 300 ppm) maruz bırakıldı. TER ölçüldü ve ortam değiştirildi ve hücreler 24 saat boyunca kuluçkaya yatırılır. 24 saat TER tekrar ölçüldü ve apikal medya toplandı kaspaz bırakma ölçümü için ve hücre zarları imünohistokimya fikse edildi. Panel A parça 2 ve 3 gösterilerinde açık ok epitel tabakası dökülür ve siyah oklar uç üzerindeki boş alanları gösterir. Panelindeki ok ucu bir kısmı 5 rejenere epitel gösterir. Ki-67 immünoboyamayla değerlendirilen parça 7, 8, ve 9 hücre çoğalması. Değerler, ortalama ± SEM ve * 0 ppm kontrolden anlamlı (p <0.05) bir fark gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir ciğerlerine zehirli bir kimyasal nefes zaman akut toksik risklerin en yaygın türü oluşur. Bu kimyasallar da hızlı bir şekilde kan alınmış olabilir ve bu, beyin ve kalp gibi diğer organları etkileyebilir. Hayvan modelleri kullanarak çeşitli maddelerin solunması toksisitesi okudu ve yaygın bildirilen, ancak mekanizmaları daha az anlaşılmıştır. Bu etkili tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir engeldir. In vitro maruziyet sistemlerinin bulunmaması mekanistik anlayış eksikliği arkasında bir birincil nedenidir. Burada kalp kası ve solunum yolları gibi klor maruz kalma gibi zehirli solunan kimyasalların etkilerini incelemek için hücre kültürü modelleri açıklar. Klor, hidroklorik ve hipokloroz asit 3,11,12 oluşturmak için sulu yüzeyler ile hızlı bir şekilde reaksiyona girer. Klor da 13 yüzeyleri hava yolu kritik proteinler ve enzim oksidasyon yol açabilir yüksek reaktif bileşiklerini elde etmek için, reaktif oksijen türlerinin (ROS) ile bir araya gelebilmektedir. Çalışmalardaldırılmış kültürleri kullanılarak sadece klor durumunda yerine gazın kendisi gibi HOCl'ye gibi ürünlerin etkisini gösterebilir. Burada açıklanan insan solunum yolu epitel hücreleri farklılaşmış ALI kültürlerinin maruz sağlayacak Böyle bir in vivo meydana ne benzer sulu ortam yokluğunda hücre yüzeyleri ile klor gibi tikler doğrudan etkileşimleri çalışma.
Birincil sıçan kardiyomiyositlerde kullanarak, aynı zamanda klor maruz daldırılmış kültürde hızlı hücre ölümüne neden olduğunu tarif etmektedir. Bu hücreler sıkı kavşaklar Polarize ve formu yok gibi ALI'de büyümek mümkün değildir. Bu nedenle, aynı zamanda medya ince bir tabaka ile uçlar yetiştirilen kardiyomiyositlerin kültürlerini kullanılmıştır. Klora bu hücre mono tabakaları Pozlama membran bozulması gösterdi ve apoptosis düşündüren gelişmiş kaspaz serbest bir rol oynayabilir.
Bu çalışma gösteriyor ki ALI Kültür ile çoğaltılmış olabilir inhalasyon hava yolları (birincil hedefBu tür AAH de büyümez kalp gibi es) yanı sıra organ vitro maruz sistemleri kullanılarak incelenebilir. Bu in vitro maruz modelleri kolayca diğer toksik inhale kimyasal (TIC) etkilerini değerlendirmek için adapte edilebilir. Bu modelleri kullanarak biz toksisitelerin ayrıntılı mekanistik anlayış sağlamak ve EFT / klor ile bağlantılı toksik olayları azaltmak ve daha sonra in vivo daha değerlendirmek için yeni stratejiler geliştirmek için tahmin. Bu maruziyet süresi kısa olmasına karşın, pozlama sistemi daha iyi hücre kültürü şartlarını çoğaltmak gerekiyor. Klor gibi gazlara maruz kalmak bu cihaz zarar verebilir nem kullanımını sınırlar. ALI kültürleri daha önce bizim ozon pozlama sistemi 14,15 kullanıldığı gibi solunum simüle sarsan olabilir. Şu anda bu yönde çalışıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu araştırma karşı Programı, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), Müdürü Ofisi ve Çevre Sağlığı Bilimleri Ulusal Enstitüsü (NIEHS) Hibe sayısı U54 ES015678 (CWW) tarafından desteklenmektedir. SA da Çocuk hastanesinde Mines İşbirliği Pilot Ödülü # G0100394 ve Çocuk Hastanesi Colorado Araştırma Enstitüsü Pilot Ödülü # G0100471 Colorado / Colorado School tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
References
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
- Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
- Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
- Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
- Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
- Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
- Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10 (2011).
- Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
- Evans, R. B.
- Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
- Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
- Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).
