In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhalert Chemical Testing

Summary

Denne protokollen er utformet for å demonstrere fremgangsmåten eksponering av cellekulturer til inhalerte giftige kjemikalier. Eksponering av differensiert luft-væske-grensesnittet (ALI) kulturer av luftveis epitelceller gir en unik modell av luftveis eksponering for giftige gasser som klor. I dette manuskriptet beskriver vi effekten av klor eksponering på luft-væske-grensesnittet kulturer av epitelceller og neddykket kultur kardiomyocytter. In vitro eksponering systemer tillater viktige mekanistiske studier for å evaluere trasé som dermed kan brukes til å utvikle nye terapeutiske midler.

Abstract

Cellekulturer er uunnværlig for å utvikle og å studere effekten av terapeutiske midler, før deres bruk i dyremodeller. Vi har en unik evne til å modellere godt differensiert menneskelige luftveier epitel og hjertemuskelceller. Dette kan være et uvurderlig verktøy for å studere de skadelige virkninger av giftige inhalerte kjemikalier, slik som klor, som normalt kan samhandle med celleoverflatene og danner en rekke biprodukter ved reaksjon med vann, og som begrenser deres virkninger i neddykkede kulturer. Vår modell med godt differensiert menneskelige airway epithelial cellekulturer på luft-liqiuid grensesnitt omgår denne begrensningen, samt gir en mulighet til å vurdere kritiske mekanismer for toksisitet av potensielle giftige inhalerte kjemikalier. Vi beskriver forbedret tap av membranintegritet, caspase frigjøring og død ved inhalert toksisk kjemikalie slik som klor-eksponering. I denne artikkelen foreslår metoder for å modellere klor eksponering i pattedyr hjerte og luftveier epitel calen i kultur og enkle tester for å evaluere effekten på disse celletypene.

Introduction

Eksponering for giftige kjemikalier inhalerte (tics) / gasser som klor (Cl ₂₎ gjenstår en kontinuerlig helseproblem i utilsiktet eksponering så vel som i deres potensielle anvendelse som et kjemisk middel trussel. Selv om lungene er det primære målet, er organer som hjerte og hjerne også påvirket ^1-3. In vivo modeller er vanligvis brukt til testing toksisitet fra tics, men in vitro analyser for toksisitet vurdering er enklere, raskere og mer kostnadseffektivt. I vitro modeller også gi rom for omfattende etterforskning av middel-celle interaksjoner som kan være vanskelig å vurdere in vivo. Slike in vitro eksponering systemer er sjeldne, og dessuten i noen konvensjonelle modeller hvor giftstoffer tilsettes til kulturmediet hvori cellene er neddykket, kan egenskapene til de midler endres på grunn av interaksjoner og binding til komponentene i mediet. I slike scenarier cellekultursystemer som luft-væske-grensesnittet (ALI) kulturer av primære menneskelige luftveis epitelceller, som foreslås her, som kan være direkte utsatt for gass agenter kan være lovende.

Epitelceller luftveiene er de første linjene av forsvaret mot inhalert giftige kjemikalier. Den menneskelige airway epithelium danner en fysisk barriere mellom hulrommet og de underliggende celler i lungen og deltar i responsen av lungen. Den produserer en rekke cytokiner og andre pro-og anti-inflammatoriske midler, så vel som utskiller slim / luftveisoverflate væske (ASL) som dekker epitel. En av begrensningene i konvensjonell neddykket in vitro kultursystemer er også at ASL og slim som dekker den epiteliale overflate er fjernet eller fortynnet. Dette gjenspeiler ikke den fysiologiske tilstand av lunge epitelceller som er utsatt for luft. Dermed bør en ideell in vitro system for TIC toksisitetstesting gjenskape denne arkitekturen. Det er stor interesse for å utvikle rask screening methods som forut in vivo toksisitet. Epitel-celler dyrket ved ALI differensiere og har godt differensierte strukturer og funksjoner, sammenlignet med celler dyrket under vann og utføre en overlegen modell av luftrom.

I denne studien, beskriver vi bruk av luft-væske-grensesnittet kultur for menneskelig luftveier (tracheobronchial) epitelceller for testing giftig inhalert gass giftighet og sammenligne det med en neddykket cellekultur av cardiomyocyte, derav studere et annet viktig mål for toksisitet.

Protocol

En. Rat cardiomyocyte kulturer

1. Alle forsøkene ble utført under protokoller godkjent av institusjonelle dyr omsorg og bruk komité, IACUC.
2. Skaff rotte cardiomyocytes fra hjertene (ventriklene) av hannrotter (240-260 g) ved hjelp av metoder som er beskrevet tidligere ^fire. Kort, anesthetize dyr ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (100 mg / kg; bekrefte anestesi ved tåen klemme-metode), og deretter fjerne hjerter i 10,0 ml, 1 mM Ca ^{2 +-inneholdende} Krebs-Ringer-buffer, pH 7,4.
3. Skyll hjertene 5-6x for å fjerne blod og deretter bytte til en Ca ^{2 +} gratis Krebs Ringer buffer som inneholder 0,02% protease og 0,06% collage A (5,0 ml / hjerte). Inkuber hjertene i denne løsningen i 10-15 minutter ved 37 ° C med leilighetsvis risting.
4. Etter 10-15 min, vaske ut den enzymatiske løsning med Ca ^{2 +} gratis Krebs Ringer buffer for ytterligere 5 min. Slipp celler fra slapp vev ossing en 25 ml pipette ved å pipettere suspensjonen opp og ned flere ganger.
5. Separer celler fra vev ved filtrering gjennom en 70 mikrometer nylon mesh og tillate dem å bosette seg i Krebs Ringer buffer som inneholder 0,1 mM Ca ^{2 +.} Suspender cellepelleten i 1,0 ml Krebs Ringer-buffer inneholdende 0,2 mM Ca ^{2 +.}
6. Lag forsiktig over 5,0 ml 60 pg / ml bovint serumalbumin, BSA, i 15 ml sentrifugerør, for å skille kardiomyocytter fra nonmyocytes og tillate dem å sedimentere i 30 min. De cardiomyocytes er tyngre og flytte til bunnen av røret. Fjern forsiktig supernatanten celler og media. Gjenta dette en gang for ytterligere å rense cellene.
7. Gradvis overgang ved vasking (i fremgangsmåten ovenfor med 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM og 1,0 mM Ca ^{2 +-holdig} buffer) ventrikulære myocytter / cardiomyocytes til 1,0 mM Ca ^{2 +-holdig} buffer og resuspendert i ACCT medium bestående av Dulbeccos Modified Eagle Medium , DMEM containing 2 mg / ml BSA, 2 mM L-karnitin, 5 mM kreatin, 5 mM taurin, 100 IU / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin.
8. Plate de cardiomyocytes i ACCT medium ved en tetthet på 100 til 150 celler / mm ² på 100 mm eller 35 mm laminin belagt plastkultur retter eller 40 x 22 mm glass-coverslips-belagt med laminin (1 mikrogram / ​​cm ^2). Etter en time, ta oppvasken med 2,0 ml ACCT å fjerne celler som ikke er festet. Til 10,0 ml av friske medier og inkuberes cellene.

2. Differensiert Air-væske Interface (ALI) Kultur of Human Airway Epiteliale basal celler

1. Anskaffe menneskelige tracheobronchial vev fra National Disease Research Interchange henhold Institutional Review Board godkjent protokoller. Cell innhøsting og utføre kultur ved hjelp av en publisert prosedyre ^5,6. Denne fremgangsmåten bruker cellekulturer som de er en presis modell for menneskelig Innånding av tics, men om nødvendig kan man isolere seg og vokse på ALI mobruk og / eller rotte luftveis epitelceller ^7,8.
2. Kort, lage små biter (~ ¼ tommers) av vev etter å ha fjernet alle bindevev og lymfeknuter. Vask vev flere ganger i Ringerlaktat løsning. Legg vev til en 50 ml konisk rør og legge protease løsning (1% Protease/0.01% DNase i minimal viktig media, MEM, vev til væske ratio (01:10)).
3. Skjer vevet ved 4 ° C for over natten. Ende dissosiasjon av vev ved å tilsette 10% føtalt bovint serum. Skrap epiteliale overflate med en kirurgisk skalpell og samle cellene ved sentrifugering (2000 rpm i 10 min).
4. Plate celler ved passering en på kollagen-belagt snapwells i spesiell ALI medium tilberedt som beskrevet i detalj av Fulcher et al ^ni. Kultur for fem dager før du skifter til luft-væske-grensesnittet (ALI) ved å fjerne apikale medier.
5. Strøm cellene ved hjelp av ALI media hver alternative dag og la cellene å differensiere for ytterligere 2-3 uker (observere mange juling cilia og slim sekresjon) før du utfører eksponeringer. Vask den apikale overflaten med varmt PBS sammen med medie endringer.

Tre. Klor Eksponering

1. Inneholde klor eksponeringssystem (CES) i en kvalifisert kjemisk hette med en operativ fronthastighet 100 fpm som gir nødvendig sekundær oppdemming for å hindre eksponering av personell i tilfelle av utilsiktede klorlekkasjer.
2. Betjene systemet under svakt overtrykk (0,5 inches vann). Tørr luft mates til 15 L / min og et passende nivå av klor føres for å oppnå den ønskede sluttklorinnhold. Kamrene har et låsbart lokk med 4 mini bcu låser og en lav durometer silikonpakning for å gi trykkpakningen.
3. Lever Cl ₂ blandingen gjennom en Mass Flow Controller. Den CES benytter en komprimert gass-sylinder inneholdende 1,0% Cl ₂ i tørr nitrogen.
4. Reguler fortynning luftstrøm brukertilpasset designet kontrollpanel og tilsvar regulere Cl ₂ konsentrasjonen levert til kamrene eksponering. En lav volumprøvetakingspumpe trekker avgassene fra kamrene til et klor analysator for å overvåke konsentrasjoner som deretter tatt opp på en datalogger forbundet med analysatoren.
5. Mål strømningshastigheter innenfor kamrene før eksponeringen ved hjelp av en strømningsmåler for å sikre like store leverings-og eksos priser.
6. Forbered cellekulturer for eksponering ved å fjerne supernatantprøvene media og legge nytt media (basolateral media i ALI kulturer). Eventuelle forbehandlinger med agenter kunne bli utført på dette tidspunktet.
7. Eksponer Ali kulturer av luftveis epitelceller til Cl _2-gass (50, 100 eller 300 ppm i 30 min) i de to forseglede polysulfon Biocontainment kamre. De cardiomyocytes (neddykkede eller sammenflytende kulturer på membraner) er utsatt for 50 eller 100 ppm Cl ₂ i 15 min.
8. Etter eksponering skylle kamrene med luft til Cl _to-nivå faller under 1 ppm, og kan trygt åpnet for å fjerne celler (innen 5 minutter).

4. Transepithelial Elektrisk motstand (TER) Måling

1. Mål TER av luft-væske-grensesnittet, ALI, kulturer ved hjelp av en epitelial voltohmmeter med et par av sølvklorid "chopstick" elektroder.
2. Stabilisere spisepinnen elektroden i ALI media 15 minutter før bruk.
3. Legg varme medier til den apikale (1,0 ml) og basolateral (2,0 ml) overflate og måle TER hjelp av chopstick elektrodene på voltohmmeter.
4. Dypp kortere arm av elektroden i apikale media og den lengste armen i basolateral media. Klikk på "mål"-knappen på voltohmmeter å evaluere den elektriske motstanden.
5. Den voltohmmeter har muligheten til å måle ohm eller k ohm. Subtraher den motstand over en cellefri kultur støtte fra motstanden målt tvers av hver cellelaget for å gi det transepithelial motstand (TER).

5. Caspase Måling

1. Legg frisk ALI media (2,0 ml) til den basolateral overflaten ettereksponering og inkuber i cellen ved romtemperatur. Samle supernatantprøvene media på 4 og 24 timer.
2. Mål caspase 3/7 aktivitet i medie supernatantene ved hjelp av et kommersielt caspase 3/7 assay kit.

6. Western Blot og Immunocytochemistry

1. Utfør western blots ved hjelp av cellelysater som tidligere beskrevet ^10. Suspender protein lysatet (20 pg) i 5x redusert prøvebuffer og kok i 5 min. Emne protein lysatet for SDS-PAGE (4-15%), og overfører de separerte proteiner til en nitrocellulosemembran ved elektroblotting.
2. Blokk ikke-spesifikk binding ved inkubering av membranen med 5% melk i vaskebuffer (PBS + 0,1% vaskemiddel) og sonden membraner med primære antistoffer mot SERCA2 eller sarcomeric aktin på 1:1.000 fortynning, over natten ved 4 ° C. Deretter vaskes og inkuberes membraner med de respektive peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer og utvikle for deteksjon som beskrevet tidligere ved bruk av kommersielt ¹⁰ peroksidase deteksjonssett.
3. For immunocytokjemi behandling av levende celler dyrket på innsettinger eller glass dekkglass i 6-brønns plater med 0,4% Triton-X-100 i 10 mM natrium-citrat-buffer i 20 min etter skylling med PBS.
4. Blokk-spesifikk binding ved å behandle cellene med 5% esel serum i 20 min, og deretter inkubere cellene med ikke-spesifikk IgG-eller individuelle primære antistoffer spesifikke for sarcomeric aktin-eller Ki-67.
5. Vask cellene med PBS og inkuberes med fluorescerende-konjugerte sekundære antistoffer for å detektere det primære antistoff, og et atom flekk (1 pg / ml DAPI).
6. Vask med PBS og montere Dekk bruke kommersielle monterings media.
7. Visual flekker ved hjelp av et fluorescerende mikroskop.

Representative Results

Primær stang formet kardiomyocytter feste på Laminin matriser og spre seg og differensiere i konfluente kulturer (figur 1A og dens innfelt). Disse cellene ble videre karakterisert på basis av sarcomeric aktin og SERCA2 uttrykket (figurene 1B og 1C). Rotte cardiomyocytes er svært utsatt for klor toksisitet som 15 min eksponering for 100 ppm klor forårsaket omfattende celle avrunding og død i neddykket kulturer og forstyrrelse av konfluente lag på celler dyrket på Laminin belagt membraner (figur 1D). Det ble også forbedret apoptotisk celledød som indikert av caspase 3/7 utgivelse i cardiomyocytes dyrket på inserts (figur 1E).

Eksponering av differensiert menneskelige luftveis epitel (Figur 2, innfelt i panel 1 viser et tverrsnitt av cellekultur innsatser med columnar, ciliated og goblet celler) til klor forårsaket sloughing og LIFlingen av cellemembranene ved både lave (100 ppm) og høy (300 ppm) konsentrasjoner (Figur 2 panel A2 og A3). Skade av lave klorkonsentrasjoner ble raskt reversert (fig. 2 panel A5), imidlertid cellene eksponeres til høyere klorkonsentrasjoner hadde forsinket eller ingen reparasjon evne (figur 2 panel A6), som vist ved visuell inspeksjon, samt celleproliferasjon vurdering av Ki-67 farging (figur 2 panel A9). Trans epitelial elektrisk motstand, TER målinger og kaspase-aktivitet bekreftes videre disse resultatene og gir bevis for tap av membranintegritet og apoptotisk celledød ved klor-eksponering (figur 2, felt B og C). Således våre studier beskriver utviklingen av en in vitro-Cl _{2-eksponeringssystem} som fører til tap av membranintegritet og død av airway epithelium og kardiomyocytter. Denne effekten kan ikke være på grunn av ikke-fysiologiske pH-endringer i de cardiomyocytes sompH-verdien av mediet etter eksponering for klor ble holdt ved ~ 7,4 som målt ved hjelp av et pH-meter i det oppsamlede media etter eksponering.

Figur 1. Rotte cardiomyocyte isolering og eksponering for klor. Rotte cardiomyocytes ble isolert som beskrevet i protokollen og sådd ut på laminin-belagte plast-retter (panel A, en representativ lys mikroskopisk bilde) eller laminin belagte innsatser. Innfelt i panel A viser en stang formet cardiomyocyte spredning og differensiering. De cardiomyocytes ble også preget basert på sarcomeric aktin uttrykk (panel B viser et representativt bilde oppdaget av immunfluorescens og Lane et panel C viser et representativt western blot scan) og rikelig SERCA2 uttrykk (panel C felt b). Klor eksponering (100 ppm 15 min) forårsaket utstrakt celledød ineddykkede kulturer, så vel som forstyrrelser av cellemonolaget på innsatser (panel D viser de representative mikrofotografier). Caspase 3/7 frigivelse (panel E) i supernatanten materiale av kardiomyocytter dyrket på innsatsene, ved 4 timers og 24 timers etterklor eksponering ble også målt som beskrevet i teksten. Verdier som er angitt er gjennomsnitt ± SEM, og * angir signifikante (p <0,05) forskjell mellom 0 ppm kontroll.

Figur 2. Effekt av klor eksponering på differensiert menneskelige airway epithelial luft-væske-grensesnittet (ALI) kulturer. Menneske airway epithelial basal celler ble dyrket på kollagen belagt snapwells. Etter dag 5 den apikale medier ble fjernet. Differensierte kulturer (som består av basal, ciliated, columnar, og goblet celler som vist i den lille i toppen LSFt panel av panel A) ble eksponert for klor (100 eller 300 ppm) i 30 min. TER ble målt og media ble endret og celler inkubert i 24 timer. På 24 timers TER ble målt igjen og apikal media ble samlet inn for caspase utgivelsen måling og cellemembranene ble fikset for immunhistokjemi. Den åpne pil i panel A deler 2 og 3 viser sloughed av epitellaget og svarte pilene viser tomme plasser på innsatsen. Pilspissen i panelet En del 5 viser regenerert epitel. Deler 7, 8 og 9 viser celleproliferasjonstest som vurderes av Ki-67 farging. Verdier som er angitt er gjennomsnitt ± SEM, og * angir signifikante (p <0,05) forskjell mellom 0 ppm kontroll.

Discussion

Den vanligste typen akutt giftige eksponeringer oppstår når man puster en giftig kjemisk ned i lungene. Disse kjemikaliene kan også bli raskt tatt opp i blodet og kan påvirke andre organer som hjerne og hjerte. Inhalering toksisitet av forskjellige stoffer ved hjelp av dyremodeller er studert og rapportert vidt, men mekanismene er mindre godt forstått. Dette er et stort hinder i utviklingen av effektive behandlingsformer. Fravær av in vitro eksponering systemer er en primær årsak bak mangelen på mekanistisk innsikt. Her beskriver vi cellekultur modeller av hjertemuskelen og luftveiene for å studere virkningen av giftige inhalerte kjemikalier som klor eksponering. Klor reagerer raskt med vannholdige overflater for å danne saltsyre og hypoklorsyre ^3,11,12. Klor kan også kombinere med reaktive oksygenarter (ROS) for å produsere høy-reaktive forbindelser som kan føre til oksydasjon av kritiske proteiner og enzymer fra luftveiene flater ^13.. Studierved hjelp av neddykkede kulturer kan bare vise effekten av biprodukter slik som HOCl i tilfelle av klor i stedet for den gassen selv. Eksponering av differensierte ALI kulturer av humane luftveis epitelceller beskrevet her ville tillate studie av direkte interaksjoner av tics som klor med celleoverflater i fravær av vannholdige medier som ligner på hva som skjer in vivo.

Ved hjelp av primære rotte cardiomyocytes, vi beskriver også at klor eksponering fører til rask celledød i neddykket kulturer. Disse cellene er i stand til å vokse på ALI som de ikke polarisere og danne trange veikryss. Derfor har vi også benyttet konfluente kulturer av cardiomyocytes dyrket på innlegg med et tynt lag av media. Eksponering av disse celle monolayers til klor demonstrert membran avbrudd og forbedret caspase utgivelsen tyder apoptose kan spille en rolle.

Denne studien viser at luftveiene (det primære målet for innånding som kan bli kopiert av ALI kultureltES) samt organer som hjerte som ikke vokser på ALI kan studeres ved hjelp av in vitro eksponering systemer. Disse in vitro eksponering modeller kan lett tilpasses for å vurdere effekter av andre giftige inhalerte kjemikalier (tics). Ved hjelp av disse modellene vi forventer å gi detaljert mekanistisk forståelse av toksisitet og utvikle nye strategier for å redusere de giftige hendelser assosiert med TIC / klor og deretter evaluere dem ytterligere in vivo. Selv om disse eksponeringene er korte i varighet eksponeringen systemet må bedre replikere cellekulturforhold. Eksponering for gasser som klor begrenser bruken av fuktighet som det kan korrodere enheten. Ali kulturer kan bli vugget å simulere åndedrett som tidligere benyttet i vår ozon eksponeringssystem ^14,15. Vi jobber for tiden i disse retningene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode	World Precision Instruments	EVOM and STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon cell strainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment chambers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomeric actin antibody	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antibody	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antibody	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-conjugated secondary antibody	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer solution	Abott Laboratories	7953
Donkey serum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detection kit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497
Collagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ