In vitro-cellekultur Model for Toxic Inhaleret Chemical Testing

Summary

Denne protokol er udviklet til at påvise eksponering metode cellekulturer til inhaleret giftige kemikalier. Eksponering af differentieret luft-væske grænsefladen (ALI) kulturer af luftvejs epitelceller giver en unik model af luftvejene eksponering for giftige gasser såsom klor. I dette manuskript beskriver vi effekten af klor eksponering på luft-væske grænsefladen kulturer af epitelceller og nedsænket kultur cardiomyocytes. In vitro eksponering systemer giver vigtige mekanistiske undersøgelser for at evaluere veje, der kunne så bruges til at udvikle nye terapeutiske midler.

Abstract

Cellekulturer er uundværlige til at udvikle og studere effekten af ​​terapeutiske midler, forud for deres anvendelse i dyremodeller. Vi har den unikke evne til at modellere godt differentierede humane luftveje epitel og hjertemuskelceller. Dette kunne være et uvurderligt værktøj til at studere de skadelige virkninger af giftige inhalerede kemikalier, såsom klor, der normalt kan interagere med celleoverflader, og danner forskellige biprodukter ved reaktion med vand, og begrænse deres virkninger i neddykkede kulturer. Vores model ved hjælp af godt differentierede humane luftveje epitelcellekulturer på air-liqiuid brugerflade omgår denne begrænsning samt giver mulighed for at evaluere kritiske mekanismer toksicitet af potentielle giftige inhalerede kemikalier. Vi beskriver øget tab af membran integritet, caspase frigivelse og død over giftige inhaleret kemikalie såsom klor eksponering. I denne artikel foreslår vi metoder til at modellere klor eksponering i pattedyr hjerte og luftveje epithelial calen i kultur og enkle test for at vurdere dens virkning på disse celletyper.

Introduction

Udsættelse for giftige inhalerede kemikalier (tics) / gasser såsom klor (Cl ₂₎ er fortsat en løbende sundhedsmæssig bekymring i utilsigtede eksponeringer såvel som i deres potentielle anvendelse som en kemisk trussel middel. Selv om lungerne er det primære mål, er organer, såsom hjerte og hjerne også påvirket ^1-3. In vivo modeller er generelt bruges til toksicitetstestning fra TIC, men in vitro-analyser til vurdering toksicitet er enklere, hurtigere og mere omkostningseffektiv. I vitro modeller giver også mulighed for en omfattende undersøgelse af agent-celle interaktioner, der kan være svære at vurdere in vivo. Sådanne in vitro-eksponering systemer er sjældne og desuden i nogle konventionelle modeller, hvor giftige stoffer der tilsættes til dyrkningsmediet, hvor cellerne er neddykket, kan egenskaberne af de midler ændres på grund af interaktioner og binde til komponenter i mediet. I sådanne scenarier cellekultursystemer såsom luft-væske grænsefladen (ALI) kulturer af primære humane luftveje epitelceller, der foreslås her, som direkte kan udsættes for gasformige agenter kunne være lovende.

Epitelceller, der beklæder luftvejene er de første linjer af forsvar mod inhaleret giftige kemikalier. Den humane luftvejsepitel danner en fysisk barriere mellem lumen og de underliggende celler i lunge og deltager i reaktionen af ​​lungen. Det producerer en række cytokiner og andre pro-og anti-inflammatoriske midler samt udskiller slim / luftvejsoverfladevæske (ASL), der dækker epitel. En af begrænsningerne i konventionelle neddykket in vitro dyrkningssystemer er også, at ASL og slim, der dækker epiteloverfladen fjernes eller fortyndes. Dette afspejler ikke den fysiologiske tilstand af lungeepitelceller, der udsættes for luft. Således bør en ideel in vitro system for afprøvning TIC toksicitet kopiere denne arkitektur. Der er stor interesse i at udvikle en hurtig screening metoder, der kan forudsige in vivo toksicitet. Epitelceller dyrket på ALI differentiere og har godt-opdelte strukturer og funktioner i forhold til celler dyrket neddykket og tjene en overlegen model af luftvejene.

I denne undersøgelse beskriver vi brugen af ​​air-væske-grænsefladen kultur humane luftveje (tracheobronchial) epitelceller for giftige inhalerede gas toksicitet teste og sammenligne det med en neddykket cellekultur af cardiomyocyte dermed studere et andet vigtigt mål for toksicitet.

Protocol

1.. Rotte cardiomyocyte Cultures

1. Alle forsøg blev udført under protokoller, der er godkendt af den institutionelle Dyrepleje og brug udvalg, IACUC.
2. Opnå rotte kardiomyocytter fra hjerter (ventrikler) af hanrotter (240-260 g) ved hjælp af metoder, der tidligere ⁴ beskrevne. Kort fortalt bedøve dyr ved hjælp af en intraperitoneal injektion af pentobarbital (100 mg / kg; bekræfte anæstesi ved tå knivspids metode) og derefter fjerne hjerter i 10,0 ml, 1 mM ^{Ca2 +} indeholdende Krebs Ringer puffer, pH 7,4.
3. Skyl hjerter 5-6x at fjerne blod og derefter skifte til en Ca ^{2 +} fri Krebs Ringer buffer indeholdende 0,02% protease og 0,06% collagenase A (5,0 ml / hjerte). Inkubér hjerter i denne opløsning i 10-15 minutter ved 37 ° C med lejlighedsvis omrystning.
4. Efter 10-15 min, vask det enzymatiske løsning med Ca ^{2 +} fri Krebs Ringer buffer for en yderligere 5 min. Slip cellerne fra slap væv osning en 25 ml pipette ved pipettering af suspensionen op og ned flere gange.
5. Adskil celler fra væv ved filtrering gennem en 70 um nylon mesh og give dem mulighed for at bosætte sig i Krebs Ringer buffer indeholdende 0,1 mM ^{Ca2 +.} Suspender cellepelleten i 1,0 ml Krebs Ringer puffer indeholdende 0,2 mM ^{Ca2 +.}
6. Lag forsigtigt over 5,0 ml 60 mg / ml bovint serumalbumin, BSA, i 15 ml centrifugerør, at adskille kardiomyocytter fra nonmyocytes og give dem mulighed for at bosætte sig i 30 min. Cardiomyocytter er tungere og flytte til bunden af ​​røret. Fjern omhyggeligt supernatanten celler og medier. Gentag dette trin en gang til yderligere oprensning cellerne.
7. Gradvis overgang ved vask (i trin ved hjælp af 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM og 1,0 mM ^{Ca2 +} buffer) de ventrikulære myocytter / cardiomyocytter til 1,0 mM ^{Ca2 +} indeholdende buffer og resuspenderet i ACCT medium bestående af Dulbeccos Modified Eagle Medium DMEM containing 2 mg / ml BSA, 2 mM L-carnitin, 5 mM kreatin, 5 mM taurin, 100 IE / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
8. Plate cardiomyocytter i ACCT medium ved en densitet på 100 til 150 celler / mm ² på 100 mm eller 35 mm laminin coated plast dyrkningsskåle eller 40 x 22 mm dækglas belagt med laminin (1 ug / cm ^2). Efter 1 time, vaske op med 2,0 ml ACCT at fjerne celler, der ikke er vedlagt. Tilføj 10,0 ml af friske medier og inkuberes cellerne.

2.. Differentieret Air-væske Interface (ALI) Kultur for Human Airway Epithelial basalcellerne

1. Skaffe menneskelige tracheobronchial væv fra National Disease Research Interchange under Institutional Review Board godkendte protokoller. Cellehøst og udføre kultur ved hjælp af en publiceret procedure ^5,6. Denne procedure bruger cellekulturer, som de er en præcis model for menneskelig indånding eksponeringer for tics, men hvis det er nødvendigt kan man isolere og vokse på ALI mobrug og / eller rotte luftveje epitelceller ^7,8.
2. Kort fortalt gør små stykker (~ ¼ tommer) i vævet efter at fjerne alle bindevæv og lymfeknuder. Vask væv flere gange i Ringers laktat. Tilføj væv til en 50 ml konisk rør, og der tilsættes protease-opløsning (1% Protease/0.01% DNase i minimalt essentielt medie, MEM, væv til væske-forhold (1:10)).
3. Rock vævet ved 4 ° C natten over. Afslut dissociation af vævet ved tilsætning af 10% føtalt bovint serum. Skrabe epitheloverfladen med en kirurgisk skalpel og indsamle cellerne ved centrifugering (2.000 rpm i 10 min.)
4. Plate celler ved passage én på collagenovertrukne snapwells i særlig ALI medium fremstillet som beskrevet i detaljer af Fulcher et al ^9. Kultur i 5 dage før der skiftes til luft-væske grænsefladen (ALI) ved at fjerne apikale medier.
5. Feed cellerne under anvendelse af ALI medier hver anden dag og tillade cellerne at differentiere yderligere 2-3 uger (observere talrige bankende cilier og slim sekretion), før du udfører engagementer. Vask den apikale overflade med varm PBS sammen med medieændringer.

3.. Klor Exposure

1. Indeholder klor eksponering systemet (CES) i en kvalificeret kemisk hætte med en operationel fladehastighed på 100 fpm, der giver den nødvendige sekundære inddæmning for at forhindre eksponering af personale i tilfælde af utilsigtede klor utætheder.
2. Betjene systemet under svagt positivt tryk (0,5 inches af vand). Tør luft tilføres ved 15 L / min, og et passende niveau af klor tilføres for at opnå den ønskede koncentration endelige chlor. Kamrene har en låsning låg med 4 mini BCU låse og en lav durometer silikone pakning for at give trykket tætning.
3. Levere Cl ₂ blandingen gennem en Masseflowcontroller. CES anvender en komprimeret gas cylinder, der indeholder 1,0% _Cl2 i tørt nitrogen.
4. Reguler fortynding luftstrømmen ved hjælp afspecialdesignet kontrolpanel og tilsvarende regulere Cl _{2-koncentrationen} leveret til eksponering kamre. En lav volumen prøvetagningspumpe trækker udstødning fra kamrene i en klor analysator til overvågning af koncentrationer, der derefter optaget på en datalogger er forbundet til analysatoren.
5. Mål strømningshastighederne inden kamrene før eksponering ved hjælp af en flowmåler for at sikre ensartet levering og udstødning satser.
6. Forbered cellekulturer for eksponering ved fjernelse af supernatanten medier og tilføje frisk medier (basolaterale medier i ALI kulturer). Alle forbehandlinger med agenter kan udføres på dette tidspunkt.
7. Expose Ali kulturer af luftvejs epitelceller til Cl ₂ gas (50, 100 eller 300 ppm i 30 min) i de to forseglede polysulfon biologisk indeslutning kamre. Cardiomyocytter (vandoverfladen eller sammenflydende kulturer på membraner) udsættes for 50 eller 100 ppm Cl ₂ i 15 min.
8. Efter eksponering skylles kamrene med luft, indtil Cl ₂ falder til under 1 ppm, og kan sikkert åbnes for at fjerne celler (inden for 5 min.)

4.. Transepithelial elektrisk modstand (TER) Måling

1. Mål TER af luft-væske-grænsefladen, ALI, kulturer ved hjælp af en epitelial voltohmmeter med et par af sølvchlorid "spisepind" elektroder.
2. Ækvilibrer spisepind elektrode i ALI medier 15 minutter før brug.
3. Læg varme medier til den apikale (1,0 ml) og basolaterale (2,0 ml) overflade og måle TER hjælp af spisepinde elektroder voltohmmeter.
4. Dyp kortere arm af elektroden i apikale medier og jo længere arm i basolaterale medier. Klik på knappen "foranstaltning" på voltohmmeter at evaluere den elektriske modstand.
5. Det voltohmmeter har mulighed for at måle ohm eller k ohm. Fratræk modstanden på en cellefri kultur støtte fra den målte modstand tværs over hver celle lag til opnåelse af transepitel resistens (TER).

5.. Caspase Måling

1. Læg frisk ALI medier (2,0 ml) til den basolaterale overflade efter eksponering og inkuber cellen ved stuetemperatur. Samle bundfald medier ved 4 og 24 timer.
2. Måle caspase 3/7 aktivitet i medierne supernatanter ved anvendelse af et kommercielt caspase 3/7 assay kit.

6.. Western Blot og Immunocytokemi

1. Udfør western blots under anvendelse af cellelysater som tidligere beskrevet ^10. Hæng proteinlysat (20 ug) i 5x reducerede prøve buffer og koges i 5 min. Underkaste proteinlysat SDS-PAGE (4-15%) og overføres de adskilte proteiner til en nitrocellulosemembran ved elektroforetisk blotting.
2. Blokere ikke-specifik binding ved at inkubere membranen med 5% mælk i vaskebuffer (PBS + 0,1% detergent), og probe membranerne med primære antistoffer mod SERCA2 eller sarcomerisk actin ved 1:1000 fortynding, natten over ved 4 ° C. Dernæst vaskes og inkuberes membraner med de respektive peroxidase-konjugerede sekundære antistoffer, og udvikle til detektion som tidligere beskrevet ¹⁰ ved anvendelse af kommercielt peroxidase påvisningskit.
3. Til immuncytokemi behandle levende celler dyrket på indsætter eller dækglas i 6-brønds plader med 0,4% Triton-X-100 i 10 mM natriumcitrat-puffer i 20 min efter skylning med PBS.
4. Blok-specifik binding ved behandling af cellerne med 5% donkey serum i 20 min, og derefter inkubere cellerne med ikke-specifikke IgG eller individuelle primære antistoffer specifikke for sarcomerisk actin eller Ki-67.
5. Vask cellerne med PBS og inkuberes med fluorescerende-konjugerede sekundære antistoffer til påvisning af det primære antistof og en nuklear farvning (1 ug / ml DAPI).
6. Vask med PBS og montere dækglas hjælp af kommercielle monteringsmedie.
7. Visualisere farvning under anvendelse af et fluorescensmikroskop.

Representative Results

Primær stavformede cardiomyocytter vedhæfte på laminin matricer og sprede sig og differentiere i sammenflydende kulturer (figur 1A og indsat). Disse celler blev yderligere karakteriseret på grundlag af sarcomerisk actin og SERCA2 ekspression (figur 1B og 1C). Rotte cardiomyocytter er meget modtagelige for klor toksicitet som 15 min eksponering til 100 ppm chlor forårsaget omfattende celle afrunding og død i nedsænkede kulturer og afbrydelse af sammenflydende lag på celler dyrket på coatet med laminin membraner (figur 1D). Der blev også forbedret apoptotisk celledød som indikeret af caspase 3/7 udgivelse i cardiomyocytes dyrkes på skær (Figur 1E).

Eksponering differentierede humane luftvejsepitel (figur 2, indsat til panel 1, der viser et tværsnit af cellekultur indsatser med søjleformede, cilierede og bægerceller) til klor forårsaget hamskifte og lifling af cellemembraner ved både lav (100 ppm) og høje (300 ppm) koncentrationer (figur 2 panel A2 og A3). Skader ved lave koncentrationer klor blev hurtigt vendt (figur 2 panel A5), men celler udsat for højere koncentrationer klor havde forsinket eller ingen reparation evne (figur 2 panel A6) som vist ved visuel inspektion samt celledeling vurdering af Ki-67 farvning (Figur 2 panel A9). Trans epitelial elektrisk modstand, TER målinger og caspaseaktivitet yderligere bekræftet disse resultater og fremlægge dokumentation for tab af membran integritet og apoptotisk celledød ved klor eksponering (figur 2, panel B og C). Således vores studier beskrive udviklingen af en in vitro-Cl ₂ eksponering, der medfører tab af membran integritet og død luftvejsepitel og cardiomyocytes. Denne effekt kan være på grund af ikke-fysiologiske pH-ændringer i cardiomyocytter sompH af mediet efter udsættelse for chlor blev fastholdt på ~ 7,4, som målt ved anvendelse af et pH-meter i de indsamlede medier post-.

Figur 1.. Rotte cardiomyocyte isolation og eksponering for klor. Rotte cardiomyocytes blev isoleret som beskrevet i protokollen og belagt på laminin-belagt plastik retter (panel A, et repræsentativt lys mikroskopisk billede) eller laminin coatede skær. Inset til panel A viser en stang formet cardiomyocyte sprede og differentiere. Cardiomyocytter blev også karakteriseret baseret på sarcomerisk actinekspression (panel B viser et repræsentativt billede detekteres ved immunofluorescens og lane et panel C viser et repræsentativt Western blot scanning) og rigelig SERCA2 ekspression (panel C lane b). Klor eksponering (100 ppm 15 min) forårsagede omfattende celledød ineddykkede kulturer samt forstyrrelse af cellemonolaget på skær (panel D viser de repræsentative mikrofotografier). Caspase 3/7 frigivelse (panel E) i supernatanten medier cardiomyocytes dyrkes på skær, på 4 timer og 24 klor eksponering timer efter blev også målt som beskrevet i teksten. De viste værdier er middelværdi ± SEM og * angiver signifikant (p <0,05) forskel fra 0 ppm kontrol.

Figur 2. Effekt af klor eksponering på differentierede humane luftvejs epithelial luft-væske-grænsefladen (ALI) kulturer. Humane luftveje epitelceller basale celler blev dyrket på collagen-coatede snapwells. Efter dag 5 apikale medium blev fjernet. Differentierede kulturer (bestående af basal, cilierede, søjleformede, og slimceller som vist i indsatte i top left panel af pladen A) blev udsat for chlor (100 eller 300 ppm) i 30 min. TER blev målt, og medierne blev ændret, og cellerne blev inkuberet i 24 timer. Ved 24 timers TER blev målt igen, og apikale medier blev opsamlet til måling caspase frigivelse og cellemembranerne er blevet fastsat for immunhistokemi. Den åbne pil i panel A del 2 og 3 viser afkastet epitel lag og sorte pile viser tomme rum på indsatsen. Pilespidsen i panel A del 5 viser regenereret epitel. Dele 7, 8 og 9 viser celleproliferation som vurderet af Ki-67 immunfarvning. De viste værdier er middelværdi ± SEM og * angiver signifikant (p <0,05) forskel fra 0 ppm kontrol.

Discussion

Den mest almindelige type af akut toksiske eksponeringer opstår, når man trækker vejret en giftig kemisk i lungerne. Disse kemikalier kan også hurtigt taget op i blodbanen og kan påvirke andre organer såsom hjerne og hjerte. Giftighed ved indånding af forskellige stoffer med anvendelse af dyremodeller undersøges og rapporteres bredt, men mekanismerne er mindre godt forstået. Dette er en stor forhindring i at udvikle effektive behandlinger. Fravær af in vitro eksponeringssystemer er en primær årsag bag den manglende mekanistisk indsigt. Her beskriver vi cellekultur modeller af hjertemusklen og luftvejene til at studere virkningen af ​​giftige inhalerede kemikalier såsom klor eksponering. Klor reagerer hurtigt med vandige overflader til dannelse af saltsyre og hypochlorsyrling ^3,11,12. Klor kan også kombinere med reaktive oxygenarter (ROS) til at producere meget reaktive forbindelser, som kan føre til oxidation af kritiske proteiner og enzymer i luftvejene overflader ^13. Undersøgelserved hjælp af neddykkede kulturer kan kun påvise virkninger af produkter såsom HOCI i tilfælde af klor snarere end selve gassen. Eksponering af differentierede ALI kulturer af humane luftvejs-epitelceller, der beskrives her ville tillade undersøgelse af direkte interaktioner af TIC såsom chlor med celleoverflader i fravær af vandige medier svarende til, hvad der sker in vivo.

Brug primære rotte kardiomyocytter, beskriver vi også, at klor eksponering forårsager hurtig celledød i neddykkede kulturer. Disse celler er i stand til at vokse med ALI, da de ikke polarisere og danne tight junctions. Derfor har vi også anvendt konfluerende kulturer af cardiomyocytter dyrket på skær med et tyndt lag af medier. Eksponering af disse cellemonolagene til klor viste membran forstyrrelser og forbedret caspase frigivelse tyder apoptose kan spille en rolle.

Denne undersøgelse viser, at luftvejene (det primære mål for indånding, som kan replikeres af ALI kultuES) samt organer såsom hjerte, der ikke vokser på ALI kan studeres ved hjælp i eksponeringssystemer vitro. Disse in vitro-modeller eksponering kan let tilpasses for at vurdere virkningerne af andre giftige inhalerede kemikalier (tics). Ved hjælp af disse modeller forventer vi at give detaljerede mekanistisk forståelse af toksiciteter og udvikle nye strategier for at afbøde de toksiske hændelser forbundet med TIC / klor og derefter vurdere dem yderligere in vivo. Selvom disse eksponeringer er korte i varighed eksponeringen systemet skal bedre kopiere celle dyrkningsbetingelser. Udsættelse for gasser, såsom chlor begrænser anvendelsen af ​​fugt, som det kan korrodere enheden. Ali kulturer kunne rystet at simulere respiration som tidligere udnyttet i vores ozon eksponering systemet ^14,15. Vi arbejder i øjeblikket i disse retninger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode	World Precision Instruments	EVOM and STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon cell strainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment chambers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomeric actin antibody	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antibody	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antibody	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-conjugated secondary antibody	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer solution	Abott Laboratories	7953
Donkey serum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detection kit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497
Collagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ