Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

Published: August 6, 2014 doi: 10.3791/51544
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2Integrated DNA Technologies, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Логометрический бимолекулярные маяки (RBMBs) могут быть использованы для изображения отдельных инженерных РНК-транскриптов в живых клетках. Здесь мы опишем приготовление и очистку RBMBs, доставка RBMBs в клетки microporation и флуоресцентных изображений одиночных транскриптов РНК в режиме реального времени.

Abstract

Растущее осознание того, что как временной и пространственной регуляции экспрессии генов может иметь серьезные последствия на функции клеток привело к разработке различных методов визуализации отдельных транскриптов РНК в отдельных живых клеток. Одним из перспективных методов, который недавно был описан использует олигонуклеотидную основе оптического зонда, пропорциональный бимолекулярная маяк (RBMB), для обнаружения РНК-транскриптов, которые были инженерии, чтобы содержать по меньшей мере четыре тандемных повторов RBMB последовательности-мишени в 3'-нетранслируемой области. RBMBs специально разработаны для излучают яркий флуоресцентный сигнал при гибридизации к комплементарной РНК, но в остальном остаются угасает. Использование синтетического зонда в Такой подход позволяет фотостабилен, красное смещение, и очень эмиссионные органические красители, которые будут использоваться для работы с изображениями. Связывание нескольких RBMBs в инженерных РНК-транскриптов результатов в дискретных точках флуоресценции, если смотреть под широким полем флуоресцентного микроскопа. Следовательно, движение отдельных транскриптов РНК могут быть легко визуализированы в реальном времени с помощью принятия временной ряд флуоресцентных изображений. Здесь мы опишем приготовление и очистку RBMBs, доставка в клетки по microporation и жить-ячейки изображения отдельных транскриптов РНК.

Introduction

Выражение и регулирование РНК-транскриптов является сложным и динамичным процессом, в значительной степени отвечает за контроль на поведение клеток и судьбу. Хотя важность РНК в диктующей функции клеток была известна в течение некоторого времени, часто бывает трудно провести четкую связь между двумя, так как большинство инструментов анализа РНК хватает пространственное и временное разрешение, необходимое для захвата важных нормативных мероприятий, таких как транскрипции лопнул, РНК торговля, и локализованная обработка РНК. Это привело к появлению нескольких методов, которые позволяют отдельные транскрипты РНК, чтобы быть визуализированы в живых клетках в реальном времени 1. Пожалуй, самый известный из этих методов использует GFP-MS2 слитый белок, чтобы РНК-мишени, которая была разработана специально для содержат тандемные повторы сайта связывания MS2 в 3'-UTR 2,3. Собрав несколько молекул GFP в непосредственной близости, отдельные стенограммы РНК отображаться в виде ярких флуоресцентных пятенчерез флуоресцентной микроскопии. Система GFP-MS2 предоставил беспрецедентную понимание поведения РНК, в том числе прямой визуализации и измерения транскрипции разрыва 4,5, обнаружения уникальной субклеточном локализации и обработки 6-9 и в режиме реального времени визуализации РНК транспорта 10. Однако, несмотря на огромный потенциал системы GFP-MS2, несвязанные белки слияния GFP-MS2 может создать высокий фоновый флуоресцентный сигнал, который ограничивает универсальность и динамический диапазон этой техники. Несколько подходов были разработаны для ограничения этого фонового сигнала, в том числе субклеточной компартментализации несвязанного GFP-MS2 10, дополнения фрагмента белка 11 и альтернативных РНК связывающих белков и цели 12. Тем не менее, все эти подходы остаются чувствительными к относительной и общей экспрессии РНК-мишени и GFP-MS2 слитого белка.

В качестве аlternative к системам GFP-MS2, молекулярные маяки были также использованы для обнаружения инженерии РНК-транскрипты с тандемных повторов дополнительного сайта связывания в 3'-UTR 13,14. Молекулярные маяки шпильки формирования олигонуклеотидные зонды, которые помечены на одном конце с гасителем и на другом конце с флуоресцентным репортером. Когда не связан с РНК-мишени флуоресцентного репортера и гасителем оставаться в непосредственной близости, что приводит к низкой флуоресцентного состояния. После гибридизации, флуоресцентный репортер и утоления вынуждены друг от друга и флуоресценции восстанавливается. Как и в GFP-MS2 системы, связывание нескольких молекулярных маяков на одном результаты РНК-транскрипта в светлом месте флуоресцентного который может быть идентифицирован с помощью флуоресцентной микроскопии; Тем не менее, фон флуоресценции как ожидается, будет значительно ниже, за счет закаленного конфигурации несвязанных молекул маяков. К сожалению, несмотря на умной механизма активизации, который включен в мolecular дизайн маяк, в настоящее время все больше доказательств, что негибридизированным молекулярные маячки не остаются в шпильки конформации при введении в живые клетки. Следовательно, они создают ложное-положительных сигнал, что значительно снижает отношение сигнал-фон. Чтобы преодолеть этот недостаток, мы недавно разработали новый синтетический зонд для визуализации РНК в живых клетках, логометрических бимолекулярные маяки (RBMBs; Рисунок 1A) 15,16. RBMBs состоят из двух 2'-О-метил олигонуклеотидных цепей, которые образуют гибридную структуру с признаками как короткий шпильки РНК (ShRNA) и молекулярных маяков. Механизм петли и активация флуоресценции похожа на молекулярном маяка, в то время как длинные двухцепочечную область с выступом 3'-UU более характерно ShRNA. Особенности ShRNA предназначены для привода ядерный экспорт, который мы нашли, повышает внутренние жизнь, чтобы> 24 ч, с минимальным поддавалось разрушению, ипредотвращает неспецифическую открытие цикла. В результате RBMBs демонстрируют значительно более высокий сигнал-фон, чем молекулярных маяков.

Следует отметить, что RBMBs не может быть получена с использованием ДНК-олигонуклеотидов, так как ДНК-зондов на основе не обладают теми же ядерный потенциал Экспорт в РНК-зондов на основе. Конструктивно RBMB цикл, как правило, предназначены для между 15 и 21 баз длительного, чтобы создать баланс между специфичности и селективности при РНК гибридизации. Короткий стержень, который формирует из двух самодополнительных доменов обычно предназначен для 4 основания. Если выбран больший стебель, скорость гибридизации между RBMB петли и РНК-мишени значительно замедлился 17,18. С другой стороны, когда выбран более короткий стержень последовательность температура плавления часто слишком низким, чтобы поддерживать структуру стволовых петли при 37 ° С, что приводит к высокой фонового сигнала. Специфика RBMB также красныйuced как длина штока сокращается. Поскольку последовательности RBMB стволовых петли также может влиять производительность RBMB, она должна быть тщательно отобраны 19. В частности, последовательности идеальные петли должны иметь минимальную вторичную структуру, гибридизации с РНК последовательностей с минимальным вторичной структуры, избежать белковые сайты связывания, и избежать мимо цели связывания. Предсказания как RBMB и вторичной структуры РНК могут быть получены с помощью программного обеспечения, таких как mfold 20. Дополнительные мимо ворот сайты могут идентифицировать с помощью нуклеотидной Basic Local Назначение Search Tool (BLAST). Однако из-за несоответствия в модельных предсказаний и трудности в выявлении белка-выжидать сайтов, специфика всех RBMBs должны в конечном счете быть подтверждено экспериментально.

Если желательно, незамороженный ссылки краситель, который нечувствителен к состоянию гибридизации могут быть добавлены к RBMB 15. Добавление эталонного красителя может прOvide маркер для доставки зонда и использовать для радиометрического изображения, если требуются более точные измерения общего клеточного флуоресценции. Опорные красители позволяет выполнять измерения с поправкой на разницу в фоновом режиме благодаря клетки к клетке вариаций в комплект поставки. Тем не менее, при визуализации индивидуальный РНК-транскриптов ссылка на красителе не является необходимым. Примечательно, некоторые ссылки красители могут помешать экспорту RBMBs от ядра, что приводит к несколько более высоким фонового сигнала в ядре.

Когда разработана должным образом, RBMBs могут быть использованы для изображения индивидуальных РНК-транскриптов в отдельных живых клеток, если целевой РНК сконструирован так, чтобы содержать, по меньшей мере, четыре RBMB сайты связывания (рисунок 1b) 16. RBMBs может быть эффективно доставлен в широком диапазоне клеток типов через microporation, с практически не влияет на жизнеспособность 21 клеток, и количественные измерения экспрессии генов может бытьприобрела в течение 30 мин. Кроме того, методология довольно нечувствительна к концентрации RBMB и целевой РНК уровнях, так как флуоресценции от несвязанных RBMBs эффективно гасят. Здесь мы предлагаем подробное описание методологии, используемой для подготовки и очистки RBMBs, а также общий порядок на поставку RBMBs в живых клеток через microporation и визуализацию отдельных транскриптов РНК в режиме реального времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

В этом протоколе, один олигонуклеотид (RBMB1) метили на его 5'-конце с репортерным красителем CF640R и имеет последовательность: 5'-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC мЕд mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Муму-3 '. Самодополнительных домены, которые движут формирование структуры шпильки, выделены жирным шрифтом. Второй олигонуклеотид (RBMB2) был назван в 3'-конце с гасителем Айова Черный RQ-Sp и имеет последовательность: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 '.

1 Подготовка RBMBs

  1. Произвести быстрое вращение трубок, содержащих RBMB1 и RBMB2 олигонуклеотиды, чтобы обеспечить сушат олигонуклеотид в нижней части трубки, и ресуспендируют в ДНКазы и РНКазы свободной воды до конечной концентрации 100 мкМ. Например, 10 нмоль образец олигонуклеотида должна быть повторно суспендируют в 100 мкл воды.
  2. ИзмеренийЮр точная концентрация RBMB1 и RBMB2 фондовых образцов UV-VIS-спектроскопии.
    1. Смешайте 3 мкл RBMB образца с 117 мкл DPBS (без кальция и магния) в микроцентрифужных трубки.
    2. Бланк спектрофотометр с DPBS и измеряют поглощение от 200-800 нм. Примечание: Пик поглощения при 260 нм и 650 нм должен быть виден.
    3. Вычислить концентрацию запас образцов RBMB, основанных на оптической плотности при 260 нм (или 650 нм для RBMB1), используя уравнение:
      Со Концентрация (M) = A 260 * коэффициент разбавления / коэффициент поглощения, где 260 является поглощение при 260 нм и коэффициент разведения 40.
      Примечание: коэффициент ослабления для RBMB можно найти на спецификации, предоставленной производителем олигонуклеотидов. Коэффициент экстинкции CF640R при 650 нм является 103000.
  3. Смешать 20 мкл 100 мкМ RBMB1, 30 мкл 100 мкМ RBMB2, 6 мкл 10х; Фосфатный буфер (10x фосфатный буфер: 480 мМ K 2 HPO 4, 45 мМ KH 2 PO 4, 140 мМ NaH 2 PO 4, рН 7,2) и 4 мкл ДНКазы и РНКазы воды. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 30 мин. Примечание: Как правило, это достаточно в течение примерно 50 исследований.
  4. Подготовка колонки для жидкостной хроматографии с использованием 75 преп класса Superdex для удаления любых негибридизированные RBMB2 олигонуклеотидов. С помощью 8 мл (0,7 х 20 см) жидкости хроматографическую колонку с объемом в 4 мл ~ слоем для очистки небольшого объема смешанных зондов.
  5. Мытье и уравновесить Superdex с ~ 50 мл фосфатного буфера 1x использованием шприцевой насос работает при скорости потока при скорости потока 0,6 мл / мин. Прежде всего жидкости входит в объем слоя, остановить шприцевой насос, снимите его, и пусть оставшаяся жидкость идти через колонку под действием силы тяжести.
  6. Загрузить RBMB смесь (60 мкл) на хроматографическую колонку.
    1. После того как образец RBMB имеет полностьювошел в кровать, медленно добавить еще 250 мкл фосфатного буфера 1х в верхней части слоя, чтобы гарантировать, что весь образец полностью вошел в колонку.
    2. Заполните колонку до краев 1x фосфатного буфера. Закройте верхнюю и начать шприцевой насос - шприц должен быть заполнен ~ 50 мл 1X PBS, и работать со скоростью потока 0,6 мл / мин.
    3. После того, как RBMB приближается к нижней части колонны - образец RBMB как правило, может быть легко визуализированы в связи с цветом краски, включенного в зонде - собрать проточный по 2 капли в микроцентрифужных трубки (1,5 мл). Стоп сбором образца, как только цвет внутри микропробирок становится ясно.
  7. Объедините пробирки, содержащие цветной образец RBMB - типично 5-6 трубок - и загрузить в центробежной фильтрующего устройства (10000 МВт среза). Центрифуга образца при 10000 RCF в течение 20 мин или до требуемого объема. Примечание: Эти скорости и раз, как правило,получая конечный объем ~ 30 мкл.
  8. Измерить точную концентрацию очищенного RBMB образца UV-VIS-спектроскопии.
    1. Возьмите 3 мкл концентрированного образца RBMB и смешать с 117 мкл DPBS в микроцентрифужных трубки.
    2. Бланк спектрофотометр с DPBS и измеряют поглощение от 200-800 нм. Примечание: Пик поглощения при 260 нм и 650 нм должен быть виден.
    3. Вычислить концентрацию запас гибридизованного RBMB на основе оптической плотности при 650 нм, используя уравнение:
      Со Концентрация (M) = A 650 * коэффициент разбавления / потухший коэффициент, где 650 является поглощение при 650 нм, коэффициент разведения 40.
      Примечание: коэффициент ослабления для CF640R при 650 нм является 103000 и коэффициент ослабления для Айова Черного RQ составляет ~ 20000. Коэффициенты экстинкции аддитивны и не чувствительны к гибридизации. Таким образом, образец складе RBMB имеет комбинированный коэффициент экстинкции approximatelу 123000 при 650 нм.
  9. Этикетка трубку соответствующим с именем и концентрации и хранить при температуре -20 ° C для дальнейшего использования.

2 Получение поли-D-лизина покрытием 8-а Chambered покровного стекла

  1. Приготовьте 0,2 мг / мл раствора поли-D-лизина путем растворения 5 мг поли-D-лизином (лиофилизированного порошка, г-облученный) в 25 мл стерилизованной воды в стерильной среде.
  2. Добавить 200 мкл 0,2 мг / поли-D-лизина мл раствора в каждую лунку 8-а патрон покровного стекла, в стерильной среде.
  3. Выдержите при комнатной температуре в течение 16-18 часов в капот культуре клеток.
  4. Аспирируйте поли-D-лизина и промыть скважину 3 раз стерильной дистиллированной водой. Примечание: Покрытые камерные слайды можно хранить при температуре 4 ° С.

3 Probe Доставка

Примечание: Система клеток используется должно содержать интегрированную генную конструкцию, которая выражает РНК, по крайней мере 4-последовательного связываниячисле площадок для RBMB в 3'-нетранслируемой области (UTR). Целевые последовательности должны дополнять друг друга в петле RBMB. Он сообщил, что в качестве отрицательного контроля, то же самое клеточной линии быть сконструирован, чтобы выразить один и тот же генную конструкцию, но без тандемных повторов. В этом протоколе человеческой линии клеток фибросаркомы, HT1080, был разработан, чтобы выразить GFP РНК с 96-тандемных повторов в RBMB последовательности-мишени в 3'-UTR. Контроль клеточная линия была спроектирована, чтобы выразить дикого типа GFP РНК.

  1. Пластина клеток в Т25 колбу на 40-50% слияния в один прекрасный день перед поставкой зонда. Культуры клеток с DMEM среде с 1% пера / стрептококкового и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и инкубируют при 37 ° С в 5% СО 2.
  2. На следующий день, включите microporator и настроить параметры microporation до 950 V, 2 импульсов, 25 мсек. Примечание: Эти параметры были оптимизированы для HT1080 клеток, но они типа клеток зависит и может быть adjusТед для других типов клеток, как описано в инструкции изготовителя.
  3. Заполните microporation трубку с 4 мл электролитического буфера и поместите его на microporation станции.
  4. Выньте фондовый образец очищенного RBMB и размораживать его. Развести несколько микролитров до конечной концентрации 12 мкМ с 1x фосфатным буфером. 1 мкл необходима для каждого microporation.
  5. Внесите 1 мл культуральной среды с FBS но без антибиотиков в микроцентрифужную пробирку. Примечание: Эта информация будет использоваться приостановить клетки сразу после microporation и может быть отменено, рядом с microporation устройства, до поры до времени. Включение антибиотиков в культуральной среде уменьшает жизнеспособность клеток после microporation.
  6. Извлеките культуры клеток из инженерных HT1080 клеток (60-80% сливной), промыть клетки с 1 мл Са 2 + и Mg 2 + -свободных DPBS один раз, и инкубируют с 1 мл трипсина в течение 1-2 мин.
  7. Остановите trypsinizatioN добавлением 1 мл DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, без антибиотиков и фенолового красного, и передавать клетки на две 1,5 мл микроцентрифужных пробирках.
  8. Спин вниз клетки в микроцентрифужных трубки при 200 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант, ресуспендируют и объединить ячейки гранул в конечном объеме 1 мл DPBS.
  9. Возьмем 10 мкл из хорошо перемешанной суспензии клеток и подсчета клеток.
  10. Внесите клетки вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что они хорошо разошлись и передать 300 тысяч клеток с DPBS в новый 1,5 мл микроцентрифужных трубки и спином вниз при 200 мкг в течение 5 мин.
  11. Удалить супернатант, стараясь не потревожить осадок клеток. Ресуспендируют гранул в 11 мкл буфера ресуспендирующего и пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что клетки также разошлись. Будьте уверены, чтобы не генерировать пузырьки воздуха. Примечание: Пузырьки воздуха вызовет искру во microporation и привести к ухудшению доставки RBMB и гибели клеток.
  12. Добавить 1 мкл разбавленного RBMB (12 мкм) и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Опять быть осторожны, чтобы не генерировать пузырьки воздуха.
  13. Аспирируйте 10 мкл смеси RBMB-клеток, используя microporation пипетку, и вставьте пипетку в microporation трубки. Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать microporation. Примечание: Там не должно быть никаких видимых пузырьков воздуха в кончике.
  14. Когда экран microporator показывает завершение, удалить пипетку от станции, изгнать 10 мкл смеси в пробирку микроцентрифуги, который был подготовлен ранее, с 1 мл культуральной среды с FBS но без антибиотиков. Осторожно перемешать покачиванием трубных из стороны в сторону несколько раз.
  15. Спин клетки при 200 мкг в течение 5 мин и промыть клетки еще два раза, в 1 мл фенолового красного культуральной среде с FBS, но без антибиотиков, чтобы удалить любые RBMBs, которые не были доставлены в клетки. Ресуспендируют с 400 мкл фенола красного культуральной среде с FBS, но безантибиотики.
  16. Пластина microporated клеток в поли-D-лизина, покрытой 8-а патрон покровного стекла при 200 мкл на лунку или на нужную слияния.
  17. Необязательно: Если желательно, чтобы изображение ядро, добавить Hoescht 33342 с клетками при конечной концентрации 0,01 мг / мл.
  18. Поместите патрон покровного стекла в культуры клеток инкубатора. Инкубируйте клетки в течение 1-2 ч до обработки изображений, так что клетки имеют достаточно времени, чтобы осесть на поверхности покровного стекла. Примечание: процедура может быть проведена, как только 30 мин после microporation.

4 Image Acquisition

  1. Включите живой клеточной стадии системы лучших инкубации и уравновешивают его, пока он не достигнет 37 ° C, 5% CO 2 и 75% влажности.
  2. Включите микроскопа и флуоресцентного источника света и откройте программу Metamorph. Примечание: Другие аналогичные программные пакеты для управления микроскопом и получения изображения также может быть использован.
  3. Применить Immersol нефть вЦель.
  4. Перенести патрон покровного стекла с microporated клеток в живой клеточной стадии системы лучших инкубации. не Выдержите этап верхнюю систему до температуры и уровень СО2 стабилизируются.
  5. Откройте вкладку приобретать, в программном обеспечении Metamorph. Нажмите кнопку Показать Живая найти поле, настроить фокус при дневном свете и нажмите кнопку Stop Live.
  6. На вкладке приобретать, нажмите и откройте всплывающую кнопку приобретения поток, и настроить желаемые параметры измерения фильм. Приобретать 150 кадров с помощью фильтра Cy5 / CF640R а также сохранять изображения на жесткий диск.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Вскоре после microporation из HT1080 клеток в присутствии RBMBs, индивидуальные РНК-транскрипты, которые были сконструированы, чтобы содержать несколько RBMB сайты связывания в их 3'-UTR появляются в виде белых пятен, когда флуоресцентные изображается с широким полем флуоресцентной микроскопии (рисунок 2). Хотя отдельные транскрипты РНК с всего лишь четыре RBMB сайтов связывания могут быть отображены в живых клеток, тем больше RBMB сайты связывания в 3'-UTR, тем сильнее флуоресцентный сигнал. Более того, чем больше RBMBs, которые связаны с каждой стенограммы больше РНК могут быть визуализированы до сигнал теряется вследствие фотообесцвечиванию. В этом протоколе, РНК была разработана, чтобы содержать 96-тандемных повторов в RBMB последовательности-мишени в 3'-UTR. Приобретение потокового изображений позволяет отдельным стенограммы РНК для включения в образ в режиме реального времени (Movie 1). Индивидуальные стенограммы РНК Легко видеть, двигаться в цитоплазме и ядре OF клеток. В то время как большинство пятен появляются пройти броуновские или суб-диффузионные движения, в редких случаях РНК претерпевает направленную транспорт будет наблюдаться (Видео 2). Диссертации РНК-транскрипты обычно быстро двигаться по прямой траектории (рисунок 3); Однако, некоторые РНК идут вслед изогнутые пути или делать резкие изменения в направлении. Эти движения в резком контрасте с броуновским движениям, которые случайный характер и демонстрируют небольшие габаритные перемещения в пределах коротких сроков приобретенных здесь (т.е. <1 мин). Направленные движения РНК согласуются с транспортом РНК вдоль микротрубочек и микрофиламентов. Эти эксперименты показывают, что RBMBs обеспечить универсальный и надежный инструмент для визуализации отдельных транскриптов РНК в живых клетках.

Рисунок 1
Рисунок1 Схема RBMBs и методологии, используемой изображений индивидуальный транскриптов РНК в живых клетках. A) RBMBs в присутствии и в отсутствие дополнительного РНК-мишени. При отсутствии или РНК-мишени, флуоресценция RBMB гасится. В присутствии РНК-мишени, флуоресценция RBMB восстанавливается. B) Несколько RBMBs связать каждый РНК, создавая яркий флуоресцентный пятно, которое может быть обнаружен широкого поля флуоресцентной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2 Представитель образ HT1080 клеток, стабильно экспрессирующих РНК с) 96-тандемных повторов или B) 4-тандемных повторов сайта связывания RBMB в3'-UTR, после внутриклеточной доставки RBMBs. Наличие 96-тандемных повторов позволяет отдельным стенограммы РНК появляться как яркие флуоресцирующих пятен. РНК-содержащий только 4-тандемных повторов также могут быть визуализированы, но интенсивность флуоресцентных пятен очень тусклый, и часто обнаруживаются только в областях исключительно низкой фоне. Небольшое число особо ярких пятен соответствует РНК, который не двигается. Шкала бар:. 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3 Монтаж транскрипта РНК, переживающих направлены транспорт. Траектория стенограммы показан на самой левой панели. Траектория накладывается по одному FРэйм временного ряда. Шкала бар:. 2,5 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Фильм 1 представитель фильм HT1080 клеток, стабильно экспрессирующих РНК с 96-тандемных повторов в RBMB сайта связывания в 3'-UTR, после внутриклеточной доставки RBMBs. Индивидуальные стенограммы РНК отображаться в виде ярких флуоресцентных пятен. Шкала бар:. 10 мкм Щелкните здесь для просмотра видео.

Фильм 2 Представитель фильм транскрипта РНК претерпевает направленную транспорт. Шкала бар:. 10 мкм Щелкните здесь для просмотра видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Возможность изображений отдельных инженерных РНК-транскриптов в живых клетках с помощью обычного широкого поле микроскопа требуется яркое и фотостабилен флуоресцентный сигнал, связанный с каждым РНК-транскрипта и низкой флуоресцентного фона, исходящего из несвязанных флуоресцентных зондов. В этом методе, яркий флуоресцентный сигнал достигается путем гибридизации несколько (до 96) на основе олигонуклеотидных флуоресцентных зондов, т.е. RBMBs, на каждой РНК-транскрипта. Тем не менее, всего лишь четыре привязки сайтов достаточно 16. Коллективные сигналов приводит к яркой флуоресцентной месте, которые могут отслеживать в реальном времени. Наличие множества зондов также позволяет более длительное время обработки изображений, так как существенная часть из флуоресцентных красителей должны быть photobleached до того, как общий сигнал теряется. Предполагается, что этот метод будет обеспечивать уникальную информацию в РНК биологии и позволяют для изучения широкого спектра РНК поведения в диапазоне от измерения-еэ ответ торговли РНК в различных внешних раздражителей, соблюдая уникальные субклеточные модели локализации РНК-мишени, обучающихся судьбы и жизни РНК, и обеспечивающих понимание регулирования РНК. Кроме того, он может быть возможно для отслеживания изменений (т.е. вверх и вниз регулирование) в экспрессии РНК. Хотя эта возможность еще не была подтверждена, мы ранее показано, что число копий РНК может быть довольно точно количественно до 24 часов в живых клетках 22. Кроме того, RBMBs, кажется, не влияет на уровень экспрессии генов. В совокупности эти результаты дают первоначальный доказательства, что изменения в экспрессии генов в этот период времени были точно отслеживается, на основе ячейка за ячейкой, и что RBMBs не привели к увеличению стабильности РНК или замедлило деградации РНК. Тем не менее, это не ясно, в какой степени экспрессии генов в действительности изменены в течение этого времени, если вообще.

В общем, этоПредполагается, что любое увеличение экспрессии гена бы быть легко идентифицированы; благодаря обилию несвязанного RBMB в клетке, свободной связывать вновь образованных стенограммы. Тем не менее, то, что менее ясно, как RBMBs отмежеваться от РНК в процессе трансляции и деградации, и если есть некоторое отставание между РНК выражения / деградации и визуализации этих транскриптов. Дополнительные исследования по-прежнему требуется, чтобы лучше понять производительность RBMB в этих сценариях.

Несколько альтернативных подходов к изображений одинокий стенограммы РНК были представлены ранее. Самые ранние исследования, связанные флуоресцентно маркировки изолированных РНК-транскриптов и повторно вводя эти стенограммы в клетки, как правило, путем микроинъекции 23,24. Отношение сигнал-фоне такого подхода очень высока, благодаря способности для удаления несвязанного флуоресцентные красители, но есть беспокойство по поводу того, точно представляет наблюдаемое поведение РНК Truэ РНК обработки. Наиболее распространенным решением этого недостатка привлек инженерных трансгенов с тандемных повторов в 3'-UTR, которые могут быть связаны с флуоресцентным репортером, аналогичная RBMB подход, представленный здесь. Предыдущие флуоресцентные репортеры включили малых молекул, которые только флуоресцируют при связывании РНК аптамеров, как правило, называют шпинатом 25 и GFP. Шпинат до сих пор не используется для визуализации одиночных транскрипты РНК, но был использован для изображения глобальной экспрессии. В отличие от этого, GFP, был использован успешно изображений одиночных транскриптов РНК. В этом подходе, GFP репортер слит с белком оболочки фага бактериальной MS2 (GFP-MS2), и связывается с РНК-инженерного построить с тандемных повторов сайта связывания MS2 в 3'-UTR 2,10. Хотя этот подход очень похож на подход, описанный здесь, RBMBs предлагают несколько преимуществ. Например, RBMBs позволяют органические флуорофоров, которые будут использоваться для работы с изображениями, который обеспечивает более широкий Diversity вариантов с повышенной фотостабильностью и превосходной яркостью по сравнению с флуоресцентными белками. Кроме того, существует много коммерчески доступных органических флуорофоров, которые излучают в дальнем к ближней ИК-области. Благо выбор красителей с красным смещением спектров излучения связано с низкой клеточной флуоресценции наблюдается на этих длинах волн. Поскольку высокие уровни флуоресценции можно легко заглушить любые флуоресцентные сигналы, связанные с РНК гибридизации, способность резко сократить аутофлюоресценция предоставляет важный импульс в сигнал-фон. Еще одним важным преимуществом использования RBMBs в том, что сигнал от несвязанных зондов, значительно гасили. Хотя, различные подходы были приняты для снижения фоновой флуоресценции несвязанного GFP в подходе GFP-мс2, например, использование сигналов ядерной локализации, контроля уровни экспрессии GFP, и раскол GFP комплементация 1,10,11,26,27, Наличие реальной закалки Moieти в дизайне RBMB предоставляет пользователям гораздо большей экспериментальной гибкости. Например, подход RBMB относительно нечувствительна к относительной и общий уровень экспрессии РНК и концентрации зонда. На самом деле, индивидуальные стенограммы могут быть отображены с концентрациями RBMB, которые охватывают на порядок. Объединенные преимущества высшего фотостабильностью, светлое сигнала, и более низкой фоне сделать в режиме реального времени эксперименты визуализации РНК с RBMBs гораздо более доступных для пользователей микроскопии с ограниченным опытом.

Пожалуй, наиболее заметным недостатком использования экзогенных зондов, таких как RBMBs, в отличие от молекулярной репортера, такого как GFP, является необходимость внутриклеточной доставки. К счастью, несколько вариантов существуют, например, микроинъекции 28, трансфекции агенты 29, сотовые проникая пептиды 30 и стрептолизин O (SLO) 31. Лично мы обнаружили, что microporation являетсяНаиболее удобным и универсальным вариантом, как правило, приводит к> 95% жизнеспособности и доставки эффективности 21. Это, вероятно, потому, что процесс электропорации мкл-объем проявляет снижение многих вредных событий, часто связанных с электропорации, в том числе тепловой генерации, ионов металлов растворения, изменения рН и образования оксида. Важно отметить, что microporation также поддаются высокой пропускной исследований, так как RBMBs могут быть доставлены в> 100000 клеток в одном эксперименте.

Несмотря на многие преимущества использования RBMBs в РНК изображение локализации и движения в живых клетках, ряд ограничений и проблем все еще остаются. Возможно, самой большой проблемой является невозможность отслеживать РНК для более чем на несколько минут при непрерывном воздействии. Это является следствием как фотообесцвечивания и способности РНК двигаться из фокальной плоскости изображения. Более яркие и более фотостабильных красители могут помочь Альleviate обоих этих недостатков, за счет увеличения количества раз каждый краситель может быть возбужден и позволяет дискретные флуоресцентные пятна, которые будут отображены на больших расстояниях от фокальной плоскости. Одним из перспективных для увеличения фотостабильность предполагает использование самовосстановления красителей, которые используют Триплетная тушителями в непосредственной близости от органического флуорофором продлить их срок службы 32. Другой вариант может быть использование люминесцентных усилительных сопряженные полимеры, которые состоят из большого количества подключенных флуорофорами которые не собственного закалку. Эти полимеры могут быть во много раз ярче, чем одиночных органических флуорофоров и все же быть эффективно гасят с помощью одного фрагмента закалки 33,34; Однако, дополнительная работа в этой области по-прежнему необходима. Следует отметить, что прерывистое изображений, с частотой кадров> 1 кадра в секунду, не могут быть выполнены, чтобы изображение одну РНК-транскрипта в течение длительных периодов времени, потому что трудно обеспечить, чтобы она Тон же РНК-транскрипт отслеживается от кадра к кадру. Конечно, количественная оценка экспрессии гена в одном уровне клетки все еще ​​возможно в течение длительных сроков, с помощью подсчета отдельных флуоресцентных пятен на основе соты 16,35,36. В этом случае нет необходимости отслеживать индивидуальных транскриптов. В целом, считается, что RBMBs способны обеспечить важное понимание функции РНК и позволяет визуализацию отдельных инженерных РНК-транскриптов с обычной микроскопии оборудования и ограниченным опытом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Д-р Марк Behlke и доктор Линг Хуан являются сотрудниками IDT, который предлагает олигонуклеотидов для продажи аналогичной некоторые из соединений, описанных в рукописи. IDT, однако, не публичной компанией, и они лично не имеет акций / капитал в IDT.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом КАРЬЕРА премии (0953583) и Национального института здравоохранения NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nuclease-free water Life Technologies AM9932 no DEPC-treated
DPBS Life Technologies 14190-144 No Ca2+ and Mg2+
Cary 100 UV-Vis spectrophotometer Agilent Technologies
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P284-500
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific S381-500
Microcentrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 ml
Chromatography column Kimble Chase Life Science 420400-0720 0.7 x 20 cm
Superdex 75 prep grade GE healthcare 17-1044-01
Syringe pump Braintree Scientific BS-300
Syringe BD 301035 60 ml, Luer-lok tip
Centrifugal filter units Millipore UFC501096 MW 10,000 cutoff
Centrifuge 5418 Eppendorf
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P7280-5MG lyophilized powder, g-irradiated
8-well chambered coverglass Fisher Scientific 155409 Working volume 0.2-0.5 ml
HT1080 ATCC CCL-121 Human Fibrosarcoma cell line
Cell culture flask Corning 430639 25 cm2
DMEM Life Technologies 11965084 High glucose
DMEM without phenol red Life Technologies 21063029 High glucose
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500ML
Penecillin/streptomycin Life Technologies 15140122
Trypsin Life Technologies 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Neon transfection system Life Technologies MPK5000
Neon transfection system kit Life Technologies MPK1096
Hemacytometer Fisher Scientific 02-671-10
Hoescht 33342 Life Technologies H1399
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus
SOLA light engine Lumencor
Metamorph Molecular Devices Software controlling microscope
Immersol oil 518F Fisher Scientific 12-624-66B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  3. Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
  4. Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
  5. Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
  6. Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  7. Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
  8. Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
  9. Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
  10. Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
  11. Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
  12. Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
  13. Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
  14. Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).
  15. Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
  16. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
  17. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
  18. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
  19. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
  20. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  21. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
  22. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
  23. Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
  24. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
  25. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  26. Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
  27. Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
  28. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
  29. Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
  30. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
  31. Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
  32. Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
  33. Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
  34. Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
  35. Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
  36. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).

Tags

Генетика выпуск 90 РНК изображений одной молекулы флуоресценция живая клетка
В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Song, Y., Zhang, X., Huang, L.,… More

Song, Y., Zhang, X., Huang, L., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons. J. Vis. Exp. (90), e51544, doi:10.3791/51544 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter