Summary
Ratiometric beacon bimolecolari (RBMBs) possono essere utilizzati per immagini singole trascritti di RNA ingegnerizzati in cellule viventi. Qui, descriviamo la preparazione e purificazione di RBMBs, consegna delle RBMBs in cellule di microporation e l'imaging fluorescente di trascritti di RNA singoli in tempo reale.
Abstract
La crescente consapevolezza che sia la regolazione temporale e spaziale dell'espressione genica può avere conseguenze importanti sulla funzione cellulare ha portato allo sviluppo di tecniche diverse per visualizzare i singoli trascritti di RNA in cellule viventi singoli. Una tecnica promettente che è stato recentemente descritto utilizza una sonda basata oligonucleotide-ottica, raziometrico faro biomolecolare (RBMB), per rilevare trascritti di RNA che sono stati progettati per contenere almeno quattro ripetizioni in tandem della sequenza bersaglio RBMB nella regione 3'-non tradotta. RBMBs sono specificamente progettati per emettere un segnale fluorescente su ibridazione di RNA complementare, ma per il resto rimangono spente. L'uso di una sonda sintetica in questo approccio consente fotostabile, rossa spostata, e coloranti organici altamente emissive da utilizzare per l'imaging. Il legame di più RBMBs ai ingegnerizzati RNA trascrizioni risultati in macchie di fluorescenza discreti se visto sotto un microscopio a fluorescenza a livello di campo. Di conseguenza, il movimento dei singoli trascritti di RNA può essere facilmente visualizzato in tempo reale prendendo una serie temporale di immagini fluorescenti. Qui si descrive la preparazione e purificazione di RBMBs, consegna in cellule da microporation e live-cell imaging trascrizioni singoli di RNA.
Introduction
L'espressione e la regolazione dei trascritti di RNA è un processo complesso e dinamico che è in gran parte responsabile del controllo del comportamento delle cellule e del destino. Anche se l'importanza di RNA in funzione delle cellule dettare è noto da qualche tempo, è spesso difficile tracciare chiare connessioni tra le due, in quanto la maggior parte degli strumenti di analisi di RNA non hanno la risoluzione spaziale e temporale necessaria per acquisire importanti eventi normativi quali la trascrizione scoppio, RNA traffico, e l'elaborazione di RNA localizzata. Questo ha portato l'avvento di diverse tecniche che consentono singoli trascritti di RNA per essere visualizzati in cellule viventi in tempo reale 1. Forse, il più importante di queste tecniche utilizza una proteina di fusione GFP-MS2 di RNA che è stato progettato per contenere ripetizioni in tandem del sito di legame MS2 nel 3'-UTR 2,3 bersaglio. Portando più molecole di GFP in stretta vicinanza, le singole trascritti di RNA appaiono macchie fluorescenti luminositramite microscopia a fluorescenza. Il sistema di GFP-MS2 ha fornito una visibilità senza precedenti sul comportamento RNA, inclusi visualizzazione diretta e misure di trascrizione scoppio 4,5, il rilevamento di localizzazione sub-cellulare unico e lavorazione 6-9, e in tempo reale l'imaging del trasporto dell'RNA 10. Tuttavia, nonostante l'enorme potenziale del sistema GFP-MS2, proteine di fusione GFP-MS2 non legate possono creare un segnale di alta sfondo fluorescente che limita la versatilità e la gamma dinamica di questa tecnica. Diversi approcci sono stati sviluppati per limitare questo segnale di fondo, tra cui compartimentazione subcellulare di non legato GFP-MS2 10, proteina frammento complementazione 11, e proteine leganti RNA alternativi e obiettivi 12. Tuttavia, tutti questi approcci rimangono sensibili alla espressione relativa e totale del bersaglio RNA e proteina di fusione GFP-MS2.
Come unlternative ai sistemi GFP-MS2, fari molecolari sono stati utilizzati anche per rilevare trascritti di RNA ingegnerizzati con ripetizioni in tandem del sito di legame complementare nel 3'-UTR 13,14. Beacon molecolari sono sonde oligonucleotidiche-hairpin formando contrassegnate ad una estremità con un quencher e all'altra estremità con un reporter fluorescente. Quando non è vincolata a bersaglio RNA reporter fluorescente e quencher rimanere nelle immediate vicinanze, con un conseguente stato di bassa fluorescente. Dopo l'ibridazione, il reporter fluorescente e quencher sono costrette a parte e fluorescenza viene ripristinato. Simile al sistema GFP-MS2, il legame di molteplici fari molecolari su un singolo risultato di RNA trascritto in un punto luminoso fluorescente che può essere identificato mediante microscopia a fluorescenza; tuttavia, la fluorescenza di fondo dovrebbe essere molto inferiore, a causa della configurazione spento di fari molecolari legati. Sfortunatamente, nonostante il meccanismo di attivazione intelligente che è integrata mdisegno faro olecular, ora vi è una crescente evidenza che non ibridizzate fari molecolari non rimangono nella conformazione tornante quando introdotto in cellule viventi. Di conseguenza, generano un segnale falso-positivo che riduce significativamente il rapporto segnale-bassa. Per ovviare a questo inconveniente, abbiamo recentemente sviluppato una nuova sonda sintetica per l'imaging RNA nelle cellule viventi, raziometriche fari bimolecolari (RBMBs; Figura 1A) 15,16. RBMBs sono composti da due filamenti di oligonucleotidi 2'-O-metil che formano una struttura ibrida con le caratteristiche di entrambe breve hairpin RNA (shRNA) e fari molecolari. Il meccanismo di loop e l'attivazione di fluorescenza è simile al segnale molecolare, mentre il lungo dominio a doppio filamento con una sporgenza 3'-UU è più caratteristico di shRNA. Le caratteristiche shRNA sono progettate per guidare l'esportazione nucleare, che abbiamo trovato aumenti di vita intracellulare per> 24 ore, con il minimo degrado osservabile, eimpedisce non specifico apertura del loop. Come risultato RBMBs presentano uno sfondo segnale-significativamente superiore beacon molecolari.
Va notato che RBMBs non possono essere preparati utilizzando oligonucleotidi di DNA, dal momento che le sonde basate sul DNA non possiedono le stesse capacità di esportazione nucleare come sonde di RNA. Strutturalmente, il ciclo RBMB è in genere progettato per essere tra 15 e 21 basi lungo, per creare un equilibrio tra specificità e selettività su RNA ibridazione. Il gambo corto che si forma dai due domini di auto-complementare di solito è progettato per essere 4 basi. Se si seleziona uno stelo più lungo, il tasso di ibridazione tra loop RBMB e RNA bersaglio è rallentato in modo significativo 17,18. Viceversa, quando è selezionata una sequenza più corta radice la temperatura di fusione è spesso troppo bassa per sostenere la struttura stem-loop a 37 ° C, portando ad un elevato segnale di fondo. La specificità del RBMB è anche rossouced come la lunghezza dello stelo si accorcia. Poiché la sequenza del RBMB stem-loop possono anche influenzare le prestazioni RBMB, deve essere attentamente selezionati 19. In particolare, le sequenze di loop ideale dovrebbe avere il minimo struttura secondaria, ibridare a sequenze di RNA con una minima struttura secondaria, evitare siti di legame della proteina, ed evitare fuori-obiettivo vincolante. Le previsioni di entrambi RBMB e struttura secondaria dell'RNA possono essere ottenuti utilizzando software come mfold 20. Complementari siti off-target possono identificato utilizzando un nucleotide base locale Assegnazione Search Tool (BLAST). Tuttavia, a causa delle incongruenze nei previsioni del modello e la difficoltà di identificare i siti di proteine di aspettare, la specificità di tutte le RBMBs deve infine essere convalidato sperimentalmente.
Se auspicabile, un colorante di riferimento unquenched insensibile allo stato ibridazione può essere aggiunto al RBMB 15. L'aggiunta di un colorante di riferimento può prOvide un marcatore per la consegna della sonda e possono essere usate per l'imaging raziometrico, se sono necessarie misure più accurate di fluorescenza cellulare totale. I coloranti di riferimento permette misurazioni da regolare per le differenze di fondo a causa di cell-to-cell variazioni nella consegna. Tuttavia, quando l'imaging RNA individuo trascrizioni il colorante di riferimento non è necessaria. In particolare, alcuni coloranti di riferimento possono interferire con l'esportazione di RBMBs dal nucleo, portando ad un segnale di fondo leggermente superiore nel nucleo.
Se progettato correttamente, RBMBs possono essere usati per immagine trascritti di RNA in cellule viventi individuo singolo, se l'RNA bersaglio è progettato per contenere almeno quattro siti di legame RBMB (Figura 1B) 16. RBMBs possono essere efficacemente forniti in una vasta gamma di tipi di cellule via microporation, con poco o nessun effetto sulla vitalità cellulare 21, e le misure quantitative di espressione genica possono essereacquisito entro 30 min. Inoltre, la metodologia è abbastanza insensibile a livelli di concentrazione RBMB e RNA bersaglio, dal momento che la fluorescenza da RBMBs non legato viene efficacemente spegne. Qui forniamo una descrizione dettagliata della metodologia utilizzata per preparare e purificare RBMBs, nonché una procedura generale per la fornitura di RBMBs in cellule vive tramite microporation e l'imaging di trascritti di RNA singoli in tempo reale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In questo protocollo, un oligonucleotide (RBMB1) è stato marcato a suo 5'-end con un colorante reporter CF640R e ha la sequenza: 5'-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC Mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3 '. Domini di auto-complementari, che guidano la formazione della struttura tornante, sono in grassetto. Il secondo oligonucleotide (RBMB2) è stato marcato a 3'-end con un quencher Iowa Nero RQ-Sp e ha la sequenza: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 '.
1 Preparazione di RBMBs
- Eseguire una rotazione rapida delle provette contenenti le RBMB1 e RBMB2 oligonucleotidi, per garantire l'oligonucleotide essiccato è al fondo della provetta e risospendere in DNasi e acqua RNase-free ad una concentrazione finale di 100 mM. Ad esempio, un campione di 10 nmole di oligonucleotide deve essere risospeso in 100 ml di acqua.
- Measure l'esatta concentrazione di campioni RBMB1 e RBMB2 azionari mediante spettroscopia UV-vis.
- Mescolare 3 ml di campione RBMB con 117 microlitri DPBS (senza calcio e magnesio) in una provetta.
- Blank lo spettrofotometro con DPBS e misurare l'assorbanza 200-800 nm. Nota: picco di assorbanza a 260 nm e 650 nm dovrebbe essere visibile.
- Calcolare la concentrazione archivio dei campioni RBMB basato su l'assorbanza a 260 nm (o 650 nm per RBMB1), usando l'equazione:
Archivio Concentrazione (M) = A 260 * fattore di diluizione coefficiente / di estinzione dove A 260 è l'assorbanza a 260 nm e il fattore di diluizione è 40.
Nota: Il coefficiente di estinzione per la RBMB può essere trovato sul foglio delle specifiche fornite dal costruttore oligonucleotide. Il coefficiente di estinzione di CF640R a 650 nm è 103.000.
- Mescolare 20 ml di 100 mM RBMB1, 30 ml di 100 mM RBMB2, 6 ml 10x; Tampone fosfato (10x tampone fosfato: 480 mM K 2 HPO 4, 45 mm KH 2 PO 4, 140 mm NaH 2 PO 4, pH 7,2) e 4 microlitri DNasi e acqua RNase-free. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min. Nota: Questo è in genere sufficiente per circa 50 studi.
- Preparare una colonna cromatografia liquida con 75 prep grado Superdex di togliere qualunque oligonucleotidi RBMB2 non ibridizzate. Utilizzare un 8 ml (0,7 x 20 cm) colonna di cromatografia liquida con un volume ~ 4 ml letto per purificare il piccolo volume di sonde misti.
- Lavare ed equilibrare il Superdex con ~ 50 ml di tampone fosfato 1x utilizzando una pompa a siringa in esecuzione in un flusso a una portata di 0,6 ml / min. Prima di tutto il liquido entra letto il volume, fermare la pompa a siringa, staccarlo, e lasciare che il liquido restante passare attraverso la colonna per gravità.
- Caricare la miscela RBMB (60 microlitri) sulla colonna cromatografica.
- Dopo che il campione RBMB ha completamenteentrato nel letto, aggiungere lentamente altri 250 ml di tampone fosfato 1x all'inizio del letto per assicurare che tutto il campione è completamente inserito sulla colonna.
- Riempire la colonna al bordo con tampone fosfato 1x. Chiudere la parte superiore, e avviare la pompa a siringa - siringa deve essere riempito con ~ 50 ml di PBS 1x e correre ad una velocità di flusso di 0,6 ml / min.
- Una volta che il RBMB avvicina al fondo della colonna - campione RBMB in genere può essere facilmente visualizzato per il colore del colorante incorporato nella sonda - raccogliere il deflusso a 2 gocce per provetta da microcentrifuga (1,5 ml). Smettere di raccolta del campione di una volta che il colore all'interno dei tubi microcentrifuga diventa chiaro.
- Unire le provette contenenti il campione RBMB colorata - tipicamente 5-6 tubi - e caricare in un dispositivo di filtro centrifugo (10.000 MW cutoff). Centrifugare il campione a 10.000 RCF per 20 minuti o fino a quando il volume desiderato. Nota: Queste velocità e tempi in genereprodurre un volume finale di ~ 30 microlitri.
- Misurare la concentrazione esatta del campione RBMB purificato mediante spettroscopia UV-Vis.
- Prendere 3 ml di campione RBMB concentrata e mescolare con 117 microlitri DPBS in una provetta.
- Blank lo spettrofotometro con DPBS e misurare l'assorbanza 200-800 nm. Nota: picco di assorbanza a 260 nm e 650 nm dovrebbe essere visibile.
- Calcolare la concentrazione magazzino del RBMB ibridato in base l'assorbanza a 650 nm, usando l'equazione:
Archivio Concentrazione (M) = A 650 * fattore di diluizione / coefficiente di estinzione dove A 650 è l'assorbanza a 650 nm, il fattore di diluizione è 40.
Nota: Il coefficiente di estinzione per CF640R a 650nm è 103.000 e il coefficiente di estinzione per Iowa nero RQ è ~ 20.000. I coefficienti di estinzione sono additivi e non sono sensibili alla ibridazione. Pertanto, l'esempio stock RBMB ha un coefficiente di estinzione combinata di ufficio intornoy 123.000 a 650 nm.
- Etichettare la provetta in modo appropriato con il nome e la concentrazione e conservare a -20 ° C per un uso futuro.
2 Preparazione di Poly-D-lisina rivestito 8-ben Chambered coprioggetti
- Preparare una soluzione di 0,2 mg / ml di poli-D-lisina sciogliendo 5 mg di poli-D-lisina (polvere liofilizzata, g irradiati) in 25 ml di acqua sterile in un ambiente sterile.
- Aggiungere 200 microlitri della / ml di soluzione di poli-D-lisina 0,2 mg a ciascun pozzetto di una coprioggetti 8 pozzetti a camera, in un ambiente sterile.
- Incubare a temperatura ambiente per 16-18 ore nel cofano coltura cellulare.
- Aspirare il poli-D-lisina e lavare la ben 3 volte con acqua distillata sterile. Nota: Le diapositive camera rivestiti possono essere conservati a 4 ° C.
3 Sonda di consegna
Nota: Il sistema cellulare utilizzato deve contenere un costrutto gene integrato che esprime l'RNA con almeno 4 sequenziale binding siti per il RBMB nella regione 3'-non tradotta (UTR). Le sequenze bersaglio dovrebbero essere complementari al loop del RBMB. E 'consigliabile che come controllo negativo, la stessa linea cellulare è progettato per esprimere lo stesso costrutto genico, ma senza le ripetizioni in tandem. In questo protocollo, una linea cellulare di fibrosarcoma umano HT1080, è stato progettato per esprimere la GFP RNA con ripetizioni 96-tandem della sequenza bersaglio RBMB nel 3'-UTR. La linea cellulare di controllo è stato progettato per esprimere la GFP wild-type RNA.
- Cellule piastra in un pallone T25 al 40-50% di confluenza un giorno prima della consegna della sonda. Coltivare le cellule con i media DMEM supplementato con 1% pen / strep e siero fetale bovino al 10% (FBS) e incubare a 37 ° C con il 5% di CO 2.
- Il giorno seguente, accendere la microporator e impostare i parametri microporation a 950 V, 2 impulsi, 25 msec. Nota: Questi parametri sono stati ottimizzati per le cellule HT1080, ma sono cellule di tipo dipendente e possono essere adjusted per altri tipi di cellule, come descritto nelle istruzioni del produttore.
- Riempire il tubo microporation con 4 ml di tampone elettrolitica e posizionarlo sulla stazione microporation.
- Estrarre il campione magazzino di RBMB purificato e sbrinarlo. Diluire diversi microlitri di una concentrazione finale di 12 mM con 1x tampone fosfato. 1 ml è necessario per ogni microporation.
- Pipettare 1 ml di terreno di coltura con FBS ma senza antibiotici in una provetta. Nota: Questo sarà utilizzato per sospendere le cellule immediatamente dopo microporation e può essere annullata, in prossimità del dispositivo microporation, per il momento. L'inclusione degli antibiotici nella cultura dei media diminuirà la vitalità cellulare dopo microporation.
- Rimuovere il supporto di coltura cellulare dalle cellule HT1080 ingegnerizzate (60-80% confluenti), lavare le cellule con 1 ml di Ca 2 + e Mg 2 + DPBS -Free una volta, e incubare con 1 ml di tripsina per 1-2 min.
- Arrestare il trypsinization con l'aggiunta di 1 ml di mezzi DMEM supplementato con siero fetale bovino al 10%, senza antibiotici e rosso fenolo, e trasferire le cellule in due da 1,5 ml provette da microcentrifuga.
- Centrifugare le cellule in provetta a 200 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante, risospendere e combinare il pellet di cellule in un volume finale di 1 ml DPBS.
- Prendere 10 ml della sospensione cellulare ben miscelato e contare le cellule.
- Pipettare le cellule su e giù diverse volte per assicurarsi che siano ben distribuiti e trasferire 300.000 cellule con DPBS in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga e spin giù a 200 xg per 5 min.
- Rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 11 microlitri tampone di risospensione e pipettare su e giù diverse volte per garantire che le cellule sono ben disperse. Essere sicuri di non generare eventuali bolle d'aria. Nota: Le bolle d'aria provocano una scintilla durante microporation e compromettere consegna RBMB e la morte cellulare.
- Aggiungere 1 ml di RBMB diluito (12 mM) e mescolare bene pipettando su e giù parecchie volte. Anche in questo caso fare attenzione a non generare eventuali bolle d'aria.
- Aspirare 10 ml di miscela RBMB-cellule, utilizzando la pipetta microporation, e inserire la pipetta nella provetta microporation. Premere il pulsante di avvio per avviare il microporation. Nota: Non ci dovrebbero essere bolle d'aria visibili nella punta.
- Quando lo schermo del microporator mostra completamento, rimuovere la pipetta dalla stazione, espellere la miscela di 10 ml nella provetta che è stato preparato in precedenza, con 1 ml di terreno di coltura con FBS, ma senza antibiotici. Mescolare delicatamente oscillare il tubo da lato a lato diverse volte.
- Spin le cellule a 200 xg per 5 min e lavare le cellule altre due volte, in 1 ml di rosso fenolo terreno di coltura gratuito con FBS, ma senza antibiotici, per rimuovere eventuali RBMBs che non sono stati consegnati nelle cellule. Risospendere con 400 microlitri fenolo terreno di coltura rosso gratuito con FBS, ma senzaantibiotici.
- Piastra le cellule microporated nel poli-D-lisina rivestite coprioggetti 8-bene camerata a 200 ml per pozzetto o alla confluenza desiderata.
- Opzionale: Se è auspicabile immagine nucleo, aggiungere Hoescht 33342 alle cellule ad una concentrazione finale di 0,01 mg / ml.
- Posizionare i coprioggetti camerata in un incubatore di coltura cellulare. Incubare le cellule per 1-2 ore prima di imaging, in modo che le cellule hanno il tempo sufficiente per sistemarsi sulla superficie coprioggetti. Nota: Imaging può essere eseguita appena 30 minuti post-microporation.
4. Image Acquisition
- Accendere il sistema all'inizio dell'incubazione vivo fase cellula ed equilibrare esso fino a raggiungere 37 ° C, 5% di CO 2, e 75% di umidità.
- Accendere la sorgente luminosa a fluorescenza e microscopio e aprire il software Metamorph. Nota: altri software simili per il controllo del microscopio e acquisizione delle immagini può anche essere usato.
- Applicare olio Immersol alobiettivo.
- Trasferire il coprioggetti camerata con le cellule microporated al sistema top di incubazione dal vivo palco cellulare. Incubare il sistema superiore palco fino a quando la temperatura e CO 2 livelli sono stabilizzati.
- Aprire la scheda Acquisisci, nel software Metamorph. Fare clic sul pulsante Show Live per trovare il campo, regolare la messa a fuoco in luce bianca e fare clic sul pulsante Stop dal vivo.
- Nella scheda Acquisisci, fare clic e aprire il pulsante di scelta rapida acquisizione ruscello, e impostare i parametri di acquisizione filmato desiderati. Acquisire 150 fotogrammi usando il filtro Cy5 / CF640R e salvare le immagini sul disco rigido.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Poco dopo la microporation delle cellule HT1080 in presenza di RBMBs, singoli trascritti di RNA che sono stati progettati per contenere più siti di legame RBMB nella loro 3'-UTR appaiono macchie fluorescenti luminosi quando ripreso dal grande campo microscopia a fluorescenza (Figura 2). Mentre i singoli trascritti di RNA con siti di legame da un minimo di quattro RBMB possono essere esposte nelle cellule vive, il più siti nel 3'-UTR vincolante RBMB, il più forte il segnale fluorescente. Inoltre, i più RBMBs che sono tenuti a ciascun trascritto più lungo è il RNA possono essere visualizzati prima che il segnale viene perso a causa di photobleaching. In questo protocollo, l'RNA è stato progettato per contenere ripetizioni 96-tandem della sequenza bersaglio RBMB nel 3'-UTR. L'acquisizione di immagini in streaming consente ai singoli trascritti di RNA per essere ripreso in tempo reale (Film 1). I singoli trascritti di RNA possono facilmente essere visto in movimento all'interno del citoplasma e nucleo of cellule. Mentre la maggior parte dei luoghi sembrano subire movimenti browniani o sub-diffusive, in rari casi si osserverà un RNA subito un trasporto diretto (Movie 2). Tesi trascritti di RNA in genere si muovono rapidamente lungo un percorso rettilineo (Figura 3); tuttavia, alcuni RNA seguo percorsi curvi o fare bruschi cambi di direzione. Questi movimenti sono in netto contrasto con i movimenti browniani, che sono casuali in natura e presentano piccoli spostamenti complessivi entro brevi scadenze acquisite qui (cioè <1 min). I movimenti di RNA diretti sono coerenti con il trasporto di RNA lungo i microtubuli e microfilamenti. Questi esperimenti indicano che RBMBs forniscono uno strumento versatile e robusto per l'imaging singoli trascritti di RNA in cellule viventi.
Figura1 Schema di RBMBs e la metodologia di immagine utilizzati trascritti di RNA individuo in cellule viventi. A) RBMBs in presenza e in assenza di RNA complementare bersaglio. In caso di assenza o di destinazione RNA, RBMB fluorescenza si spegne. In presenza di RNA bersaglio, RBMB fluorescenza viene ripristinato. B) più RBMBs legano ogni trascrizione di RNA creando una macchia fluorescente luminoso che può essere rilevato dal grande campo microscopia a fluorescenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Immagine rappresentativa di cellule HT1080 esprimono stabilmente RNA con A) ripetizioni in tandem o 96-B) ripetizioni 4-tandem del sito di legame RBMB in3'-UTR, dopo la consegna intracellulare di RBMBs. La presenza di ripetizioni 96-tandem consente ai singoli trascritti di RNA di apparire come macchie fluorescenti luminosi. RNA contenente solo 4 ripetizioni in tandem può anche essere visualizzato, ma l'intensità delle macchie fluorescenti è molto debole e spesso rilevabili solo in aree di eccezionalmente basso di sfondo. Il piccolo numero di punti particolarmente luminosi corrisponde a RNA che non si muove. Scala bar:. 10 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Montaggio di una trascrizione di RNA sottoposte a diretto trasporto. La traiettoria del trascritto è mostrato in più a sinistra del pannello. La traiettoria è sovrapposto sopra un singolo frame della serie storica. Scala bar:. 2.5 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Movie 1 film Rappresentante di cellule HT1080 esprimono stabilmente RNA con ripetizioni 96-tandem del sito di legame RBMB nel 3'-UTR, dopo la consegna intracellulare di RBMBs. I singoli trascritti di RNA appaiono macchie fluorescenti luminosi. Scala bar:. 10 micron Clicca qui per vedere il video.
Movie 2 movie rappresentante di una trascrizione di RNA in fase di trasporto diretto. Scala bar:. 10 micron Clicca qui per vedere il video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La capacità di immagini singole trascritti di RNA ingegnerizzati in cellule viventi utilizzando un microscopio a grande campo convenzionale richiede un segnale luminoso e fotostabile fluorescente per essere associate a ogni trascrizione di RNA e di uno sfondo fluorescente a basso proveniente da sonde fluorescenti non legati. In questo metodo, un segnale fluorescente è ottenuto ibridando multipla (fino a 96) sonde fluorescenti basato oligonucleotidi, cioè RBMBs, su ciascun trascritto di RNA. Tuttavia, solo quattro siti di binding sono sufficienti 16. I segnali collettivi determinano un punto luminoso fluorescente che può monitorati in tempo reale. La presenza di più sonde permette anche per tempi più lunghi di imaging, poiché una parte sostanziale dei coloranti fluorescenti deve essere fotodecolorate prima che il segnale collettivo viene perso. E 'previsto che questa tecnica fornirà una visione unica in RNA biologia e consentire lo studio di una vasta gamma di comportamenti di RNA che vanno dalla misura the la risposta della tratta RNA a vari stimoli esterni, osservando unici modelli localizzazione subcellulare di RNA bersaglio, studiando il destino e la vita di RNA, e permettono di approfondire regolamento RNA. Inoltre può essere possibile tenere traccia delle modifiche (cioè a monte e down-regulation) in espressione di RNA. Anche se questa funzionalità non è ancora stato convalidato, abbiamo precedentemente dimostrato che il numero di copie di RNA può essere quantificato in modo abbastanza preciso per un massimo di 24 ore in cellule vive 22. Inoltre, RBMBs non sembrano influenzare il livello di espressione genica. Insieme, questi risultati forniscono la prova iniziale che cambiamenti nell'espressione genica in questo periodo di tempo sono stati monitorati con precisione, su base cella per cella, e che RBMBs non ha portato ad un aumento della stabilità RNA o rallentato la degradazione dell'RNA. Tuttavia, non è chiaro in che misura l'espressione genica effettivamente cambiato durante questo tempo se non del tutto.
In generale, èprevede che qualsiasi aumento dell'espressione genica potrebbe essere facilmente individuabile; per l'abbondanza di RBMB non legato nella cella che è libero di legarsi trascrizioni di recente formazione. Tuttavia, ciò che è meno chiaro è come RBMBs dissociano da RNA durante la traduzione e la degradazione e se c'è qualche ritardo tra l'espressione di RNA / degrado e l'imaging di queste trascrizioni. Sono ancora necessari ulteriori studi per capire meglio le prestazioni RBMB in questi scenari.
Diversi approcci alternativi al di imaging trascrizioni singoli di RNA sono stati segnalati in precedenza. I primi studi hanno coinvolto l'etichettatura fluorescente isolati trascritti di RNA e di reintroduzione di tali trascritti nelle cellule, in genere microiniezione 23,24. Il segnale-fondo di questo approccio è molto alta, grazie alla capacità di rimuovere eventuali coloranti fluorescenti non legato, ma ci sono preoccupazioni per se il comportamento osservato RNA rappresenta accuratamente true processamento dell'RNA. La soluzione più comune a questa lacuna ha comportato transgeni ingegneria con ripetizioni in tandem nel 3'-UTR che possono essere vincolati da un reporter fluorescente, analoghi all'approccio RBMB presentato qui. Reporter fluorescenti precedenti hanno incluso piccole molecole fluorescenti che solo dopo il legame aptameri RNA, comunemente indicato come spinaci 25, e GFP. Spinaci non è stato ancora utilizzato per l'imaging trascrizioni singoli di RNA, ma è stato utilizzato per l'immagine globale di espressione. Al contrario, la GFP è stato usato con successo per immagine trascritti singoli RNA. In questo approccio, un reporter GFP è fusa alla proteina di rivestimento del fago MS2 batterica (GFP-MS2) e si lega ad un RNA progettato costruire con ripetizioni in tandem del sito di legame MS2 nel 3'-UTR 2,10. Mentre questo approccio è molto simile all'approccio descritto qui, RBMBs offrono diversi vantaggi. Ad esempio, RBMBs permettono fluorofori organici da utilizzare per l'imaging, che fornisce un div ampiaersità di scelte con fotostabilità e maggiore luminosità superiore rispetto a proteine fluorescenti. Inoltre, ci sono molti fluorofori organici disponibili in commercio che emettono nel lontano al vicino infrarosso. Il vantaggio di scegliere tinture con spettri di emissione rosso-spostato deriva dal autofluorescenza cellulare più bassa osservata a queste lunghezze d'onda. Poiché alti livelli di autofluorescenza possono facilmente soffocare eventuali segnali fluorescenti associati con l'RNA ibridazione, la capacità di ridurre drasticamente autofluorescenza fornisce una spinta importante segnale-fondo. Un altro importante vantaggio di usare RBMBs è che il segnale dalle sonde non legato è significativamente spegne. Anche se, diversi approcci sono stati adottati per ridurre la fluorescenza di fondo di GFP non legata nell'approccio GFP-MS2, ad esempio, l'uso di segnali di localizzazione nucleare, il controllo dei livelli di espressione GFP, e dividere GFP complementazione 1,10,11,26,27, il presenza di un Moie effettivo spegnimentoty all'interno del disegno RBMB fornisce agli utenti una maggiore flessibilità sperimentale. Ad esempio, l'approccio RBMB è relativamente insensibile sia al livello relativo e totale di espressione dell'RNA e la concentrazione della sonda. In realtà, le singole trascrizioni possono essere esposte a concentrazioni RBMB che abbracciano un ordine di grandezza. I vantaggi combinati di più alta fotostabilità, segnale luminoso, e lo sfondo in basso fanno in tempo reale esperimenti di imaging RNA con RBMBs molto più accessibili per gli utenti di microscopia con competenze limitate.
Forse, il più notevole svantaggio di utilizzare sonde esogene quali RBMBs, a differenza di un reporter molecolare come GFP, è la necessità per la consegna intracellulare. Fortunatamente, una serie di opzioni esistono, ad esempio, la microiniezione 28, gli agenti di transfezione 29, cellulari penetrante peptidi 30, e streptolisina O (SLO) 31. Personalmente, abbiamo scoperto che è microporationl'opzione da usare e versatile la maggior parte degli utenti, in genere con conseguente> 95% vitalità e la consegna di efficienza 21. Questo è probabilmente perché il processo di elettroporazione microlitro volume presenta una riduzione degli eventi dannosi spesso associati elettroporazione, inclusa la generazione di calore, ioni metallo dissoluzione, variazione del pH e la formazione di ossido. È importante sottolineare che, microporation è anche suscettibile di studi high-throughput, poiché RBMBs possono essere consegnati in> 100.000 cellule in un singolo esperimento.
Nonostante i molti vantaggi di utilizzare RBMBs alla localizzazione dell'immagine RNA e il movimento nelle cellule viventi, una serie di limitazioni e sfide rimangono ancora. Forse, la sfida più grande è l'incapacità di tenere traccia di RNA per più di pochi minuti sotto esposizione continua. Questa è una conseguenza sia fotoscolorimento e la capacità di RNA di uscire dal piano di imaging focale. Coloranti più luminoso e più fotostabili può aiutare alleviate entrambe queste lacune, aumentando il numero di volte che ciascun colorante può essere eccitato e consentendo alle macchie fluorescenti discreti per essere ripreso a grandi distanze dal piano focale. Un approccio promettente per aumentare fotostabilità prevede l'utilizzo di coloranti di auto-guarigione, che utilizzano tripletto-stato quenchers in prossimità del fluoroforo organico di estendere la loro vita 32. Un'altra opzione potrebbe essere l'uso di amplificazione polimeri coniugati fluorescenti, che sono composti da un gran numero di fluorofori connessi che non fanno auto-quench. Questi polimeri possono essere molte volte più luminoso di fluorofori organici singoli e tuttavia ancora essere efficacemente bonificato da una singola molecola tempra 33,34; Tuttavia, è ancora necessario ulteriore lavoro in questo settore. Va notato che l'imaging intermittente, con un frame rate> 1 fotogramma al secondo, non può essere eseguita ad una singola immagine trascritto di RNA per periodi di tempo prolungati, perché è difficile garantire che sia tegli stesso trascritto RNA viene monitorata dal frame-to-frame. Naturalmente, la valutazione quantitativa di espressione genica a livello di singola cellula è ancora possibile per lunghi periodi di tempo, attraverso il conteggio delle macchie fluorescenti individuali su un 16,35,36 a base di cellule. In questo caso, non è necessario tenere traccia dei singoli trascritti. In generale, si ritiene che RBMBs sono in grado di fornire importanti informazioni in funzione di RNA e permette l'imaging di singoli trascritti di RNA artificiali, con attrezzature microscopia convenzionale e competenze limitate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Mark Behlke e il dottor Ling Huang sono impiegati da IDT che offre oligonucleotidi per la vendita simile ad alcuni dei composti descritti nel manoscritto. IDT è, tuttavia, non è una società quotata in borsa e che personalmente non possiede azioni / equity in IDT.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Science Foundation CARRIERA Award (0953583) e l'Istituto Nazionale di Salute NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 ml |
| Chromatography column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7 x 20 cm |
| Superdex 75 prep grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60 ml, Luer-lok tip |
| Centrifugal filter units | Millipore | UFC501096 | MW 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5 ml |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | 25 cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without phenol red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
References
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
- Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
- Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
- Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
- Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
- Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
- Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
- Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
- Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
- Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
- Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S.
- Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
- Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
- Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
- Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
- Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
- Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
- Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
- Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
- Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
