Summary
비례 생체 분자 비콘 (RBMBs)는 살아있는 세포에서 이미지를 하나의 설계 RNA 전 사체로 사용할 수 있습니다. 여기서 우리는 RBMBs, microporation 실시간으로 단일 RNA 전 사체의 형광 이미징에 의해 세포로 RBMBs 전달의 준비 및 정제에 대해 설명합니다.
Abstract
두 유전자 발현의 시공간적 규제 세포 기능에 중요한 영향을 미칠 수 성장 실현 단일 살아있는 세포에서 개별 RNA 전 사체를 시각화하기 위해 다양한 기술이 개발되었다. 최근에 설명 된 한가지 유망한 기술은 3'-비 번역 영역 RBMB 표적 서열의 적어도 네 탠덤 반복을 포함하도록 설계되었다 RNA 전 사체를 검출 올리고 뉴클레오타이드 기반의 광학 탐침, 비율 적 이분자 비컨 (RBMB)를 이용한다. RBMBs 구체적으로 보완 RNA에 혼성화에 따라 밝은 형광 신호를 방출하도록 설계되어 있지만, 그렇지 않으면 침묵 상태로 유지됩니다. 이 방법에서는 프로브의 합성 사용 적색 편이, 광 안정성 허용하고, 높은 발광 유기 염료는 촬상을 위해 사용된다. 넓은 필드 형광 현미경으로 볼 때 개별 형광 명소의 설계 RNA 전 사체 결과에 여러 RBMBs의 결합. 결과적으로, 각각의 RNA 전 사체의 이동이 용이 형광 화상의 시계열을 촬영하여 실시간으로 시각화 될 수있다. 여기에서 우리는 microporation에 의해 세포로 제조 및 정제 RBMBs의 배달을 설명하고 살고 셀 단일 RNA 전 사체의 이미지를.
Introduction
RNA 전 사체의 발현 및 조절은 세포의 행동과 운명을 제어하기위한 주로 담당하는 복잡하고 역동적 인 과정이다. 지시 된 세포 기능의 RNA의 중요성이 얼마 동안 알려져 있지만,이 가장 RNA 분석 도구는 전사 붕괴 중요 규제 이벤트를 캡처하기 위해 필요한 공간 및 시간 해상도가 부족하기 때문에, RNA 들간의 연결을 그리는 힘들다 인신 매매 및 지역화 된 RNA 처리. 이것은 각각의 RNA 전 사체가 실시간 1에 살아있는 세포에 시각화 할 수 있도록 여러 기술의 출현하게되었다. 아마,이 기술의 가장 눈에 띄는는 3'-UTR 2,3에 MS2 결합 부위의 탠덤 반복을 포함하도록 설계되었습니다 RNA를 대상으로 GFP-MS2 융합 단백질을 이용한다. 가까운 거리에 여러 GFP 분자를 제공함으로써, 각각의 RNA 전 사체는 밝은 형광 점으로 나타나는형광 현미경을 통한. GFP-MS2 시스템은 직접 시각화 및 전사의 측정 4,5 분출 독특한 서브 셀룰러 지역화 및 처리 6-9의 검출, 및 RNA 수송층 (10)의 실시간 영상을 포함한 RNA 동작으로 전례 통찰력을 제공하고있다. 그러나, GFP-MS2 시스템의 엄청난 잠재력에도 불구하고, 언 바운드 GFP-MS2 융합 단백질이 기술의 다양성과 동적 범위를 제한하는 높은 배경 형광 신호를 생성 할 수 있습니다. 몇몇 접근법은 세포 내 비 결합 GFP-MS2 (10)의 구획화, 단백질 단편 상보성 (11), 및 대체 RNA 결합 단백질을 포함하여, 이러한 배경 신호를 제한하기 위해 개발 및 12을 표적으로되었다. 그러나 이러한 접근 방법은 모든 RNA 표적과 MS2-GFP 융합 단백질의 상대적 총 발현에 민감한 남아있다.
로GFP-MS2 시스템에 lternative, 분자 비콘은 3'-UTR 13,14에 상보적인 결합 부위의 탠덤 반복으로 조작 된 RNA 전 사체를 검출하기 위해 사용되어왔다. 분자 비콘은 소광 한 끝에 형광 리포터와 함께 타단 개는 헤어핀 - 형성 올리고 뉴클레오티드 프로브이다. 소광 RNA에게 형광 기자를 대상으로 바인딩하지 않을 경우 낮은 형광 상태의 결과로, 가까이에 남아있다. 하이브리드시, 형광 기자와 소광 떨어져 강제로 형광이 복원됩니다. GFP-MS2 시스템, 형광 현미경으로 식별 할 수있는 밝은 형광 반점의 단일 RNA 전 사체의 결과로 여러 분자 표지의 결합에 유사; 그러나, 배경 형광 인해 비 결합 분자 비컨 켄칭 구성으로, 훨씬 낮은 것으로 예상된다. 불행하게도, 영리 활성화 메커니즘에도 불구하고 그 m에 통합olecular 표지 디자인, 살아있는 세포에 도입 할 때 머리 핀의 자형 형태를 유지하지 않는 분자 비콘을 unhybridized 성장 증거가 지금있다. 결과적으로, 그들은 훨씬 신호대 배경을 감소 위양성 신호를 생성한다. 15, 16,이 단점을 극복하기 위해, 우리는 최근 살아있는 세포, 비율 계량 생체 분자 비콘 (그림 1A RBMBs)에 영상 RNA에 대한 새로운 합성 프로브를 개발했다. RBMBs 짧은 헤어핀 RNA (shRNA를) 및 분자 비콘 모두의 기능을 가진 복합 구조체를 형성하는 두 개의 2'-O-메틸 가닥 올리고 뉴클레오티드로 구성된다. 3'-오버행과 UU 긴 이중 가닥 도메인 shRNA를 더 특징 인 반면 루프 및 형광 활성화 메커니즘, 분자 비콘 유사하다. shRNA를 기능은 최소한의 관찰 저하 우리는> 24 시간으로 증가에게 세포 수명을 발견 핵 수출을 구동하도록 설계되어루프의 비 특정 개방을 방지 할 수 있습니다. 결과 RBMBs 분자 비콘보다 훨씬 높은 신호 대 배경을 나타내고있다.
RBMBs가 RNA 기반 프로브와 같은 핵 수출 기능을 소유하지 않은 DNA 프로브 기반하기 때문에, DNA 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 제조 할 수 없다는 것을 또한 주목해야한다. 구조적 RBMB 루프는 일반적으로 RNA 혼성화시 특이성 및 선택성 사이의 균형을 만들기 위해, 길이 (15) 및베이스 (21) 사이에있을 수 있도록 설계된다. 이 자체 보완 도메인에서 형성하는 짧은 줄기는 보통 4 기지가 될 수 있도록 설계되었습니다. 이상 줄기가 선택된 경우 RBMB 루프와 표적 RNA와 혼성화 속도는 상당히 17,18 둔화된다. 줄기 짧은 시퀀스가 선택되면 반대로, 용융 온도가 높은 백그라운드 신호 선도, 37 ° C에서 스템 - 루프 구조를 유지하기 위해 종종 너무 낮다. RBMB의 특이성은 빨간색입니다줄기 길이를 짧게 같이 uced. 또한 RBMB 성능에 영향을 미칠 수 RBMB 스템 - 루프의 서열 때문에, 조심스럽게 19을 선택한다. 특히, 이상적인 루프 서열은, 최소한의 이차 구조를 가져야 최소한 이차 구조와 RNA 서열에 혼성화, 단백질 결합 부위를 방지하고, 바인딩 표적 이탈 방지. RBMB 및 RNA 이차 구조 모두의 예측은 mfold (20)와 같은 소프트웨어를 사용하여 얻을 수있다. 보완 오프 대상 사이트는 염기 기본 지역 지정 검색 도구 (BLAST)를 사용하여 식별 할 수 있습니다. 그러나, 모델 예측과 단백질 기다리고 사이트를 식별하는 데 어려움 불일치의 모든 RBMBs의 특이도는 궁극적으로 실험적으로 검증되어야합니다.
바람직한 경우, 혼성화 상태에 민감하다 unquenched 기준 염료 RBMB (15)에 첨가 될 수있다. 기준 염료의 추가 홍보 할 수 있습니다프로브 배달 마커 ovide 총 형광 세포의보다 정확한 측정이 요구되는 경우, 비율 적 촬상에 사용될. 기준 염료 측정 배달 세포 간 차이로 인해 배경에서의 차이에 대해 조정될 수있다. 그러나, 개개의 RNA를 묘화 할 때 참조하면 염료가 필요하지 않다 사체. 특히, 일부 참조 염료는 핵에 약간 더 높은 배경 신호로 이어지는 핵에서 RBMBs의 수출을 방해 할 수 있습니다.
적절하게 설계하면 표적 RNA는 적어도 네 RBMB 결합 부위 (도 1b) (16)를 포함하도록 설계된다면, RBMBs는 단일 살아있는 세포에서 개별 이미지 RNA 전 사체에 사용될 수있다. RBMBs 효율적으로 세포 생존율 (21)에 아무런 영향이 거의, microporation 통해 세포 유형의 넓은 범위로 제공 될 수 있으며, 유전자 발현의 정량적 인 측정을 할 수있다30 분 이내에 취득했다. 바인드 RBMBs부터 형광을 효율적으로 급냉되기 때문에 더욱이, 방법은, RBMB 농도와 표적 RNA 수준에 비교적 둔감하다. 여기서 우리는 RBMBs을 제조하고 정제하는 데 사용되는 방법의 상세한 설명뿐만 아니라 microporation 통해 라이브 세포로 RBMBs의 전달을위한 일반 절차와 실시간 단일 RNA 전 사체의 화상을 제공한다.
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Protocol
이 프로토콜에서는 하나의 올리고 뉴클레오티드 (RBMB1)는 CF640R 기자 염료와의 5'-끝 부분에 표시하고, 순서를 가지고 : 5' mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC 뮤 mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC mUmU-3 '. 머리 핀의 자형 구조의 형성을 구동 자체 보완 도메인은 굵게 표시되어 있습니다. 둘째 올리고 뉴클레오티드 (RBMB2)는 아이오와 블랙 RQ-SP 거제와 '말단에 표지와 순서가되었다 : 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3'.
RBMBs의 1 준비
- RBMB1 및 RBMB2 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 튜브의 빠른 스핀을 수행 건조 올리고 뉴클레오티드는 100 μM의 최종 농도의 DNase와의 RNase가없는 물에 튜브의 바닥 및 재현 탁입니다 보장합니다. 예를 들어, 올리고 뉴클레오티드의 10 nmol을 샘플을 물 100 ㎕에 재현 탁한다.
- MEAS우레 UV-VIS 분광에 의해 RBMB1 및 RBMB2 재고 샘플의 정확한 농도.
- microcentrifuge 관에서 (칼슘과 마그네슘없이) 117 μL의 DPBS로 RBMB 샘플 3 μl를 섞는다.
- DPBS 빈 분광 광도계는 200 ~ 800 nm의에서 흡광도를 측정한다. 참고 : 피크가 260 nm에서 흡광도 650 nm의가 볼 수 있어야합니다.
- 식을 이용하여, 260 나노 미터 (또는 650 nm의 RBMB1)에서의 흡광도에 기초 RBMB 샘플 스톡 농도를 계산
스톡 농도 (M)는 260 (260) nm에서 흡광도 및 희석 배수가 40 인 260 * 희석 팩터 / 흡광 계수 =.
주 : RBMB 대한 흡광 계수는 올리고 뉴클레오티드 제조업체에서 제공 사양서에서 찾을 수있다. 650 nm에서 CF640R의 흡광 계수는 103000이다.
- 100 μM의 RBMB1의 20 μL, 100 μM의 RBMB2의 30 μl를, 혼합 6 ㎕의 10 배, 인산염 완충액 (10 배 인산염 완충액 : 480 밀리미터 K 2 HPO 4, 45 mM의 KH 2 PO 4, 140 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 산도 7.2) 4 μL의 DNase의와의 RNase없는 물입니다. 30 분 동안 실온에서 혼합물을 배양한다. 주 : 이것은 일반적으로 약 50 연구에 충분하다.
- 모든 unhybridized RBMB2 올리고 뉴클레오티드를 제거하기 위해 75 학년 준비하고, Superdex를 사용하여 액체 크로마토 그래피 컬럼을 준비합니다. 혼합 된 프로브의 작은 볼륨을 정화 ~ 4 ml의 침대 볼륨과 8 ㎖ (0.7 × 20cm) 액체 크로마토 그래피 컬럼을 사용합니다.
- 세척은 0.6 ㎖ / 분의 유속으로 유동 실행 주사기 펌프를 사용하여 ~ 1X 인산 완충액 50 ㎖를하고, Superdex을 평형화하고. 유체가 모두 베드 부피로 진입하기 전에, 주사기 펌프를 정지하여 분리하고 남은 액체는 중력에 의해 열을 가자.
- 크로마토 그래피 컬럼 상에 RBMB 혼합물 (60 μl를) 넣습니다.
- RBMB 샘플은 완전히이 후베드 입력 천천히 전체 샘플을 완전히 열 진입했음을 확인하기 위해 베드의 상부에 1X 인산 완충액 250 ㎕를 또 다른 추가.
- 1X 인산 버퍼 림에 열을 채 웁니다. 상단을 닫고, 주사기 펌프를 시작 - 주사기가 충전되어야 ~ 50 mL의 PBS 1X 및 0.6 ml / 분의 유속으로 실행.
- RBMB 컬럼의 하단에 가까워지면 - RBMB 시료 전형적 용이 프로브에 혼입 염료의 색으로 인해 가시화 될 수있다 - microcentrifuge 관 당 2 방울 (1.5 ㎖)에 흐름을 통해 수집한다. 마이크로 원심 튜브 내에서 색이 분명해진다 일단 샘플을 수집 중지합니다.
- 일반적으로 5 ~ 6 튜브 - - 컬러 RBMB 샘플이 들어있는 튜브를 결합하고 원심 필터 장치 (10,000 MW 컷오프)로로드합니다. 20 분 동안이나 원하는 볼륨까지 10,000 RCF에서 샘플을 원심 분리기. 주 :이 속도와 시간은 것입니다 일반적으로~ 30 μL의 최종 부피를 수득 하였다.
- UV-VIS 스펙트럼에 의해 정제 RBMB 샘플의 정확한 농도를 측정한다.
- 농축 RBMB 샘플 3 μl를 타고 microcentrifuge 관에 117 μL의 DPBS와 혼합.
- DPBS 빈 분광 광도계는 200 ~ 800 nm의에서 흡광도를 측정한다. 참고 : 피크가 260 nm에서 흡광도 650 nm의가 볼 수 있어야합니다.
- 식을 이용하여, 650 nm에서의 흡광도에 기초하여 혼성화 RBMB의 스톡 농도를 계산
스톡 농도 (M)는 650 (650) nm에서 흡광도가 650 * 희석 팩터 / 소멸 계수 = 희석 인자는 40이다.
주 :하는 650nm에서 CF640R 대한 흡광 계수가 103000이고 아이오와 블랙 RQ 대한 흡광 계수가 20,000 ~. 흡광 계수는 첨가제 아르와 하이브리드로 구분하지 않습니다. 따라서, 주식 RBMB 샘플 approximatel의 조합 흡광 계수가650 nm에서 Y 123000.
- 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 이름과 농도 및 저장 적절하게 튜브를 레이블을 지정합니다.
8 잘 챔버 커버 글라스 코팅 폴리-D-라이신의 2 준비
- 무균 환경에서 멸균 물 25 ㎖ 중의 폴리-D-라이신 (동결 건조 분말, g-조사) 5mg을 용해시켜 폴리-D-라이신의 0.2 ㎎ / ㎖ 용액을 준비한다.
- 무균 환경에서, 8 잘 챔버 커버 글라스의 각 웰에 0.2 ㎎ / ㎖ 폴리-D-라이신 용액 200 μl를 추가합니다.
- 세포 배양 후드에서 16 ~ 18 시간 동안 실온에서 품어.
- 폴리-D-라이신을 대기음 멸균 증류수로 잘 3 번 씻는다. 참고 : 코팅 챔버 슬라이드가 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
3 프로브 배달
주 : 적어도 4 연속 바인드 RNA를 발현 통합 유전자 구조를 포함해야 사용 전지 시스템3'-비 번역 영역 (UTR)의 RBMB에 대한 사이트를 보내고. 표적 서열은 RBMB의 루프 보완해야한다. 이는 음성 대조군으로서, 동일 세포주가 동일한 유전자 구조를 표현할 수 있도록 설계되는 것이 권고되지만 탠덤 반복하지 않고있다. 이 프로토콜에서, 인간 섬유 육종 세포주는 HT1080, 3'-UTR에서 RBMB 표적 서열의 96 탠덤 반복으로 GFP의 RNA를 발현하도록 설계 하였다. 제어 세포주가 야생형 GFP의 RNA를 발현하도록 설계 하였다.
- 일일 프로브 배달 전에 40~50%의 포화 상태에서 T25 플라스크에 플레이트 세포. 농경 1 % 펜 / 패 혈성 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 DMEM 매체와 세포 및 5 % CO 2에서 37 ° C에서 배양한다.
- 다음 날, microporator 켜고 950 V,이 펄스, 25 밀리 초에 microporation 매개 변수를 설정합니다. 이러한 매개 변수는 HT1080 세포에 최적화 된,하지만 그들은 의존 세포의 유형과 adjus가 될 수 있습니다테드는 다른 세포 유형에 대한 제조업체의 지침에 설명 된대로.
- 4 ML 전해 버퍼 microporation 튜브를 입력하고 microporation 역에 놓습니다.
- 정제 RBMB의 주식 샘플을 꺼내서 해동. 1X 인산 완충액 12 μM의 최종 농도로 몇 마이크로 리터를 희석. 1 ㎕를 각 microporation 필요합니다.
- 피펫 FBS와하지만 microcentrifuge 관으로 항생제가없는 배지 1 ㎖. 주 :이 당분간 microporation 장치 근처 microporation 직후 세포를 중단하는 데 사용되며, 별도로 설정 될 수있다. 배양 배지에서 항생제의 포함은 microporation 후 세포 생존율을 감소한다.
- 한 번 1 ㎖의 칼슘 및 마그네슘 2 + - 무료 DPBS로 세포를 씻어 설계 HT1080 세포 (60-80% 합류)에서 세포 배양 배지를 제거하고 1-2 분 동안 한 ML 트립신을 품다.
- trypsinizatio 중지항생제와 페놀 레드없이 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 DMEM 1 ㎖의 매체를 추가하고,이 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포를 전송함으로써 N.
- 5 분 동안 200 XG에서 마이크로 원심 튜브에 세포를 스핀 다운. 상층 액에 resuspend를 제거하고 1 ML의 DPBS의 최종 볼륨 세포 펠릿을 결합한다.
- 잘 혼합 된 세포 현탁액에서 10 μl를 가지고 세포를 계산합니다.
- 확실히 그들은 잘 분산하고 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 DPBS 30 만 셀을 전송하고 5 분 동안 200 XG에 스핀 다운 위아래로 여러 번 세포를 피펫.
- 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 상층 액을 제거합니다. 세포가 잘 분산되도록 11 μL의 재 부상 버퍼와 피펫 위아래로 여러 번에 펠렛을 재현 탁. 공기 방울을 생성하지 않도록해야합니다. 참고 : 공기 거품이 microporation 동안 스파크의 원인이 가난한 RBMB 전달 및 세포 사멸 발생합니다.
- 희석 RBMB (12 μM) 1 μl를 추가로 pipetting에 의해 여러 번 아래로 잘 섞는다. 다시 공기 방울을 생성하지 않도록주의하십시오.
- 기음 RBMB 세포 혼합물의 10 μL, microporation 피펫을 사용하고 microporation 튜브에 피펫을 삽입합니다. microporation을 시작하려면 시작 버튼을 누릅니다. 참고 : 끝에서 눈에 보이는 기포가 없어야합니다.
- microporator의 화면이 완료가 표시되면, FBS와하지만, 항생제없이 1 ml의 배지와 함께, 이전 제조 하였다 microcentrifuge 관에 10 ㎕의 혼합물을 배출, 역에서 피펫을 제거합니다. 튜브 좌우 수회 부드럽게 흔들어 섞는다.
- 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀과 세포로 전달되지 않은 모든 RBMBs을 제거하기 위해, FBS와 함께하지만, 항생제없이 1 ml의 페놀 레드 무료 배지에서 세포를 두 번 이상 세척. FBS은 있지만없이 400 ㎕의 페놀 레드 무료 문화 매체와 재현 탁항생제.
- 플레이트 잘 당하거나 원하는 자랄 200 μL에서 8 잘 챔버 커버 글라스 코팅 된 폴리-D-라이신에 microporated 세포.
- 선택적 : 그것이 핵이 화상에 바람직한 경우, 0.01 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 세포에 Hoescht 33,342 추가.
- 세포 배양 인큐베이터로 챔버 커버 글라스를 놓습니다. 세포를 커버 글라스의 표면 상에 정착 할 충분한 시간을 가질 수 있도록, 종래 촬상 1-2 시간 동안 세포를 배양한다. 주 : 이미징을 30 분 포스트 - microporation 자마자 수행 될 수있다.
4 이미지 인식
- 라이브 세포 단계 상위 배양 시스템을 켭하고 37 ° C, 5 % CO 2, 75 %의 습도에 도달 할 때까지 그것을 평형.
- 현미경과 형광 광원의 전원을 켜고 MetaMorph로부터 소프트웨어를 엽니 다. 주 : 현미경 제어 및 이미지 획득을위한 다른 유사한 소프트웨어 패키지가 또한 사용될 수있다.
- 에 Immersol 오일을 적용목적.
- 라이브 세포 단계 상위 배양 시스템에 microporated 세포와 챔버 커버 글라스를 전송합니다. 온도가 될 때까지 무대 위에 시스템을 품어 CO 2 농도는 안정된다.
- MetaMorph로부터 소프트웨어에서 획득 탭을 엽니 다. 필드를 찾기 위해, 라이브 버튼을 클릭하여 흰색 빛 아래 초점을 조정하고 중지 라이브 버튼을 클릭합니다.
- 획득 탭에서 클릭하고 스트림 인수 팝업 버튼을 열고 원하는 영화 인수 매개 변수를 설정합니다. Cy5에 / CF640R 필터를 사용하여 150 프레임을 획득하고 하드 드라이브에 이미지를 저장합니다.
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Representative Results
넓은 필드 형광 현미경 (도 2)에 의해 촬상 할 때 곧 RBMBs의 존재 HT1080 세포 microporation 따라, 조작 된 개별 RNA 전 사체들이 3'-UTR에서 여러 RBMB 결합 부위를 포함 할뿐만 밝은 형광 점으로 나타나는. 적은 네 RBMB 결합 부위 개별 RNA 전 사체는 라이브 세포 이미징 될 수 있지만, 3'-UTR에 결합 부위보다 RBMB, 강한 형광 신호. 신호 인해 photobleaching에 손실되기 전에 또한, 이상 각 증명서에 바인딩 더 RBMBs는 RNA가 가시화 될 수있다. 이 프로토콜에서, RNA는 3'-UTR에서 RBMB 표적 서열의 96 탠덤 반복을 포함 할 수 있도록 설계되었다. 스트리밍 영상의 획득은 개별 RNA 전 사체를 실시간 (동영상 1)에서 이미지를 만들 수 있습니다. 개인 RNA 전 사체는 쉽게 세포질과 핵 O 내에서 이동 볼 수 있습니다세포 바. 관광 명소의 대부분은 드문 경우에, 브라운 또는 하위 확산 움직임을 겪을 것으로 보인다 동안 직접 전송을 겪고 RNA는 (동영상 2)를 관찰한다. RNA 전 사체는 일반적으로 직선 경로 (그림 3)을 따라 빠르게 이동 논제; 그러나, 일부 RNA는 곡선 경로를 따르거나 방향의 급격한 변화를 만들 수 있죠. 이 운동은 자연에서 무작위 여기 취득한 짧은 시간 프레임 (즉, <1 분) 내에서 작은 전반적인 변위를 나타내는 브라운 운동, 대조적이다. 지시 RNA 운동은 미세 소관과 함께 미사 RNA의 전송과 일치한다. 이러한 실험 RBMBs는 살아있는 세포에서 개별 RNA 전 사체 이미징을위한 다양하고 강력한 도구를 제공 할 것을 나타냅니다.
그림1 RBMBs의 회로도 및 살아있는 세포.) 보완 대상 RNA의 유무에 RBMBs의 방법론을 사용하는 이미지 개별 RNA 전 사체. 부재 또는 표적 RNA에서 RBMB 형광은 켄칭된다. 표적 RNA의 존재에 RBMB 형광이 복원됩니다. B) 여러 RBMBs 넓은 필드 형광 현미경에 의해 검출 될 수있는 밝은 형광 자리를 만들어 각각의 RNA 전 사체를 바인딩합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
안정적으로 RNA를 발현 HT1080 세포) 96 - 탠덤 반복 또는 RBMB 결합 부위의 B) 4-탠덤 반복에서의 그림 2 대표 이미지3'-UTR은 RBMBs의 세포 내 전달을 다음. 96 탠덤 반복의 존재는 각각의 RNA 전 사체는 밝은 형광 점으로 표시 할 수 있습니다. 단지 4 탠덤 반복을 함유 RNA도 가시화 할 수 있지만, 형광 반점의 강도는 매우 희미하고 매우 낮은 배경 분야에서 종종 검출된다. 특히 밝은 반점의 소수 움직이지 RNA에 해당합니다. 스케일 바 :. 10 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
RNA 전 사체의 그림 3 몽타주 전송을 지시 받고. 성적 증명서의 궤적은 가장 왼쪽 패널에 표시됩니다. 궤도 단일 F 위에 겹쳐시계열 람. 스케일 바 :. 2.5 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
안정적으로 RBMBs의 세포 내 전달 다음, 3'-UTR의 RBMB 결합 부위의 96 탠덤 반복과 RNA를 발현 HT1080 세포의 영화 1 대표 영화. 개인 RNA 전 사체는 밝은 형광 반점이 나타납니다. 스케일 바 :. 10 μm의 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2 지시 전송을 겪고 RNA 전 사체의 대표적인 영화. 스케일 바 :. 10 μm의 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기존의 넓은 필드 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 이미지를 하나의 설계 RNA 전 사체 할 수있는 능력은 각 RNA 전 사체 언 바운드 형광 프로브로부터 나오는 낮은 형광 배경에 관련 지을 수있는 밝고 광 안정성 형광 신호를 필요로한다. 이 방법에서, 밝은 형광 신호는 각각의 RNA 전 사체 상에, (96까지) 다중 올리고 뉴클레오티드 계 형광 프로브, 즉 RBMBs 혼성화함으로써 달성된다. 그러나, 몇 네 바인딩 사이트는 16 충분하다. 집합 신호는 실시간으로 추적 할 수있는 밝은 스폿 형광 초래한다. 집단 신호가 손실되기 전에 형광 염료의 실질적인 분획 photobleached되어야하므로 여러 프로브의 존재는 또한, 이상 촬상 시간을 허용한다. 그것은이 기술은 RNA 생물학에 독특한 통찰을 제공 번째 측정에서 레인 징 동작 RNA의 광범위한 연구를 위해 허용되는 것으로 구상표적 RNA의 고유 한 세포 내 현지화 패턴을 관찰하는 다양한 외부 자극, RNA의 운명과 수명을 공부하고, RNA 규제에 대한 통찰력을 제공하는 RNA의 인신 매매의 전자 응답. 또한 그것은 RNA의 발현에 (즉, 위, 아래 규정) 변경 사항을 추적하는 것이 가능할 수있다. 이 기능은 아직 검증되지 않았지만, 우리는 이전에 RNA 사본 번호를 상당히 정확하게 살아있는 세포 22에서 최대 24 시간 동안 정량화 될 수 있음을 보여 주었다. 더욱이 RBMBs 유전자 발현 수준에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 결합하여, 이러한 결과는 셀별로, 정확하게 추적 된이 시간 기간 동안 유전자 발현의 변화와 RBMBs는 RNA 안정성의 증가로 이어질 또는 RNA의 분해를 느리게하지 않았다고 초기 증거를 제공한다. 그러나, 모든 경우에 어느 정도의 유전자 발현이 실제로이 시간 동안 변경된 것에 분명하지 않다.
일반적으로, 인유전자 발현의 증가를 쉽게 식별 할 것이라고 예상; 때문에 새로 형성된 성적 증명서를 결합 할 무료 셀에 결합되지 않은 RBMB의 풍부합니다. 그러나, 무엇을 덜 분명한 것은 RBMBs 번역 및 분해 동안 RNA에서 해리 방법과 RNA 발현 / 분해하고 이러한 성적의 영상 사이에 약간의 지연이있을 경우. 추가 연구가 여전히 더 나은 이러한 시나리오에서 RBMB 성능을 이해하는 것이 필요합니다.
단일 RNA 전 사체를 이미징 할 몇 가지 다른 방식의 접근은 이전에보고 된 바있다. 관련된 최초의 연구는 형광 고립 된 RNA 전 사체의 레이블을 일반적으로 미세 주입 (23, 24)에 의해 세포로 이러한 성적표를 다시 도입. 신호대 배경이 접근법으로 인해 어떤 결합되지 않은 형광 염료를 제거하는 능력이 매우 높지만, 관측 된 RNA 동작 정확하게 TRU를 나타내는 지 여부에 대한 우려가있다전자 RNA 처리. 이러한 단점에 대한 가장 일반적인 솔루션은 여기에 제시된 RBMB 접근 방식과 유사한 형광 기자을 준수 할 수있는 3'-UTR에서 탠덤 반복과 엔지니어링 유전자를 포함하고있다. 이전 형광 기자는 일반적으로 시금치 (25), 및 GFP라고 RNA의 앱 타머를 결합시 형광을 작은 분자를 포함했다. 시금치는 아직 하나의 RNA 전 사체를 영상화하는 데 사용되지 않았지만, 글로벌 이미지 표현에 사용되어왔다. 반면, GFP가 성공적으로 이미지를 하나의 RNA 전 사체를에 사용되어왔다. 3'-UTR 2,10에서 MS2 결합 부위의 탠덤 반복으로 구성이 방법에서는, GFP 기자 박테리아 파지 MS2 (GFP-MS2)의 외피 단백질에 융합하고, 설계 RNA에 결합한다. 이 방법은 여기에서 설명 된 방식과 매우 유사하지만, RBMBs은 여러 장점을 제공한다. 예를 들어, RBMBs는 넓은 DIV을 제공하는, 유기 형광 이미징을 위해 사용되는 것을 허용우수한 광 안정성과 형광 단백질에 비해 뛰어난 밝기와 선택의 ersity. 또한, 근적외선에 멀리에서 방출 많은 상업적으로 이용 가능한 유기 형광 물질이있다. 적색 편이 된 발광 스펙트럼과 염료를 선택하는 장점은 이들 파장에서 관찰 된 낮은 자기 형광 세포로부터 유래한다. 자기 형광 높은 수준 쉽게 RNA 혼성화와 관련된 형광 신호를 빠져 수 있기 때문에, 형광도를 극적으로 감소시키는 능력은 신호 대 백그라운드에서 중요한 향상을 제공한다. RBMBs를 사용하는 또 다른 중요한 장점은 결합되지 않은 프로브의 신호가 크게 켄칭된다는 것이다. 다양한 접근법 GFP 발현 수준을 제어 바운드 GFP-MS2 접근법에서 GFP 예, 핵 이행 시그널의 사용 배경 형광을 줄이기 위해 촬영되었으며, 분할 GFP의 보완 1,10,11,26,27, 비록 실제 담금질 moie의 존재RBMB 설계 내 타이는 훨씬 더 실험적인 유연성을 사용자에게 제공합니다. 예를 들어, RBMB 접근법은 RNA 발현 및 프로브 농도의 상대적 총 레벨 모두에 비교적 둔감하다. 사실, 개인의 성적 증명서는 크기의 순서에 걸쳐 RBMB 농도로 이미지화 할 수 있습니다. 높은 광 안정성, 밝은 신호 및 낮은 배경의 조합의 이점은 제한 전문성 현미경 누구나 훨씬 더 접근 RBMBs 실시간 RNA 촬상 실험을 확보.
아마도, 이러한 GFP와 같은 리포터 분자는 대조적으로, 이러한 RBMBs 같은 외인성 프로브를 사용하는 가장 두드러진 단점은, 세포 내 전달을 위해 필요하다. 다행히 여러 옵션이 존재, 예를 들면, 미세 주입 (28), 형질 전환 제 29, 세포 침투 펩타이드 (30) 및 streptolysin O (SLO) 31. 개인적으로, 우리는 microporation가 있음을 발견했다일반적으로> 95 % 생존율 및 전달 효율 (21)의 결과로 가장 사용자 친화적이고 다양한 옵션. 마이크로 리터 체적 전기 천공 과정은 발열, 금속 이온의 용출, 산도 변화 및 산화물 형성을 포함하여 흔히 일렉트로와 연관된 많은 유해 사건의 감소를 나타낸다는 것 때문이다. RBMBs 단일 실험> 100,000 세포로 전달 될 수 있기 때문에 중요한 microporation은 또한 높은 처리량 연구 의무가있다.
살아있는 세포 내에서 RNA 화상 지역화 및 운동 RBMBs 사용의 많은 장점에도 불구하고, 한계와 과제 번호는 여전히 남아있다. 아마도, 가장 큰 도전은 연속 노광 하에서 몇 분 이상 RNA를 추적 할 수 없다는 것이다. 이는 광표백 및 초점 촬상 평면 밖으로 이동하는 RNA의 능력 모두의 결과이다. 더 밝고 광 안정성 염료는 알 수 있습니다이러한 단점 leviate 모두 각 염료 여기 될 수있는 횟수를 증가시키고함으로써 이산 형광 스폿은 초점면에서 더 먼 거리에 묘화한다. 광 안정성을 증가시키는 한 가지 유망한 접근법은 그들의 수명 (32)을 연장하는 유기 형광 소광에 근접 삼중 항 상태를 이용하는자가 치유 염료의 사용을 포함한다. 또 다른 방법은 자기 급랭을 접속하지 않는 형광체의 다수로 구성된다 형광 증폭 공액 중합체의 사용 일 수있다. 이 고분자는 많은 시간이 하나의 유기 형광보다 밝은 아직 여전히 효율적으로 하나의 담금질 부분 (33, 34)에 의해 급냉 할 수있다; 그러나이 지역에서 추가 작업이 여전히 필요하다. 그것은 t가되도록하는 것이 곤란하므로 장시간에 걸쳐 화상을 단일 RNA 전 사체를 수행 할 수 없으며, 초 당 프레임 레이트> 1 프레임과, 그 간헐 촬상을 주목해야한다그는 같은 RNA 전 사체는 프레임 간에서 추적되고. 물론, 단일 세포 수준에서의 유전자 발현의 정량적 인 평가는 세포 기초 당 16,35,36 개별 형광 반점의 계산을 통해, 긴 시간 프레임에 걸쳐 여전히 가능하다. 이 경우, 개별 증명서를 추적 할 필요가 없다. 전반적으로, 그것은 RBMBs이 RNA의 기능에 중요한 통찰력을 제공 할 수 있다고 믿고 기존의 현미경 장비 및 제한된 전문 지식을 갖춘 단일 설계 RNA 전 사체의 영상을 가능하게한다.
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Disclosures
닥터 마크 Behlke 박사 링 황는 원고에 기술 된 화합물의 일부 유사한 판매 올리고 뉴클레오티드를 제공하는 IDT에 의해 사용된다. IDT는 그러나, 상장 회사, 그리고 그들은 개인적으로 IDT의 / 자기 지분을 보유하고 있지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 수상 (0953583) 및 건강 NCI / R21-CA116102의 국립 연구소, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 ml |
| Chromatography column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7 x 20 cm |
| Superdex 75 prep grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60 ml, Luer-lok tip |
| Centrifugal filter units | Millipore | UFC501096 | MW 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5 ml |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | 25 cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without phenol red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
References
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