Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Real-time Imaging af Single Engineered RNA-transkripter i levende celler Brug Ratiometrisk bimolekylær Beacons

Published: August 6, 2014 doi: 10.3791/51544
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2Integrated DNA Technologies, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Ratiometrisk bimolekylære beacons (RBMBs) kan anvendes til at afbilde enkelt manipuleret RNA-transkripter i levende celler. Her beskriver vi forberedelse og rensning af RBMBs, levering af RBMBs i celler ved mikroporering og fluorescerende billeddannelse af enkelt RNA-transkripter i real-tid.

Abstract

Den voksende erkendelse af, at både den tidsmæssige og rumlige regulering af genekspression kan have betydelige konsekvenser for cellefunktion har ført til udviklingen af ​​forskellige teknikker til at visualisere de enkelte RNA-transkripter i enkelte levende celler. En lovende teknik, der for nylig blevet beskrevet benytter en oligonucleotid-baseret optisk sonde, ratiometrisk bimolekylær beacon (RBMB), til påvisning af RNA-transkripter, der var manipuleret til at indeholde mindst fire tandemgentagelser af RBMB målsekvensen i 3'-utranslaterede region. RBMBs er specielt konstrueret til at udsende en lys fluorescerende signal ved hybridisering til komplementært RNA, men ellers forbliver standset. Anvendelsen af ​​en syntetisk probe i denne fremgangsmåde giver fotostabile, rød-skiftede og stærkt emitterende organiske farvestoffer, der skal anvendes til billeddannelse. Binding af flere RBMBs til de konstruerede RNA-transkripter resulterer i diskrete fluorescenspletter når de ses under et bredt felt fluorescerende mikroskop. Derfor kan bevægelsen af ​​individuelle RNA-transkripter let visualiseres i realtid ved at tage en serie af fluorescerende billeder tid. Her beskriver vi fremstilling og oprensning af RBMBs, levering i celler ved mikroporering og leve-cell imaging af enkelte RNA-transkripter.

Introduction

Udtrykket og regulering af RNA-transkripter er en kompleks og dynamisk proces, der er i høj grad ansvarlig for at kontrollere celle adfærd og skæbne. Selvom betydningen af ​​RNA i diktere cellefunktion har været kendt i nogen tid, er det ofte vanskeligt at drage klare forbindelser mellem de to, da de fleste RNA-analyseværktøjer mangler den rumlige og tidsmæssige opløsning kræves for at optage vigtige regulerende begivenheder såsom transskription brister, RNA menneskehandel, og lokaliserede RNA-behandling. Dette har ført til fremkomsten af flere teknikker, der tillader individuelle RNA-transkripter, der skal visualiseres i levende celler i realtid 1. Måske den mest fremtrædende af disse teknikker anvender et GFP-MS2-fusionsproteinet til at målrette RNA, der er blevet manipuleret til at indeholde tandemgentagelser af MS2-bindingssted i 3'-UTR 2,3. Ved at bringe flere GFP-molekyler i tæt nærhed, individuelle RNA-transkripter fremstå som lyse fluorescerende plettervia fluorescensmikroskopi. GFP-MS2-system har givet en hidtil uset indsigt i RNA adfærd, herunder direkte visualisering og målinger af transkriptionelle sprængfyldt 4,5, påvisning af unikke sub-cellulære lokalisering og behandling 6-9, og real-time scanning af RNA-transport 10. Trods det enorme potentiale af GFP-MS2 system kan ubundne GFP-MS2-fusionsproteiner skabe en høj baggrund fluorescerende signal, der begrænser alsidigheden og dynamikområde af denne teknik. Adskillige fremgangsmåder er blevet udviklet til at begrænse denne baggrund signal, herunder subcellulære opdeling af ubundet GFP-MS2 10 proteinfragment komplementation 11, og alternative RNA-bindende proteiner og mål 12. Men alle disse fremgangsmåder forbliver følsomme over for den relative og totale ekspression af RNA-mål og GFP-MS2 fusionsprotein.

Som etlternative til GFP-MS2-systemer, har molekylære beacons også blevet anvendt til at påvise manipuleret RNA-transkripter med tandemgentagelser af den komplementære bindingssted i 3'-UTR 13,14. Molecular beacons er hårnåle-dannende oligonukleotidprober, der er mærket i den ene ende med en quencher og ved den anden ende med et fluorescerende reporter. Når den ikke er forpligtet til at målrette RNA den fluorescerende reporter og quencher forblive i umiddelbar nærhed, hvilket resulterer i en lav-fluorescerende tilstand. Efter hybridisering den fluorescerende reporter og quencheren tvunget fra hinanden og fluorescens er genoprettet. Svarende til GFP-MS2-system, binding af flere molekylære beacons på en enkelt RNA-transkript resulterer i en stærkt fluorescerende plet, der kan identificeres ved hjælp af fluorescens mikroskopi; imidlertid er baggrundsfluorescens forventes at være meget lavere på grund af den bratkølede konfigurationen af ​​ubundne molekylære beacons. Til trods den smarte aktiveringsmekanisme, der er indeholdt i deolecular beacon design, er der nu voksende beviser for, at ikke-hybridiseret molekylære beacons ikke forbliver i hårnål kropsbygning når det indføres i levende celler. Derfor er de genererer et falsk positivt signal, der reducerer signal-til-baggrund. For at overvinde denne mangel, vi for nylig udviklet et nyt syntetisk sonde til billeddannelse RNA i levende celler Ratiometrisk bimolekylære beacons (RBMBs; figur 1a) 15,16. RBMBs er sammensat af to 2'-O-methyl-oligonukleotid strenge, der danner en hybrid struktur med egenskaber fra både korte hårnål RNA (shRNA) og molekylære beacons. Sløjfen og fluorescensaktivering mekanisme svarer til den molekylære beacon, mens den lange dobbeltstrenget domæne med en 3'-UU overhæng er mere karakteristisk for shRNA. De shRNA funktioner er designet til at køre nuklear eksport, som vi har fundet stigninger intracellulær levetid til> 24 timer, med minimal observerbare nedbrydning, oghindrer uspecifik åbning af sløjfen. Som et resultat RBMBs udviser en signifikant højere signal-baggrund end molekylære beacons.

Det skal bemærkes, at RBMBs ikke kan fremstilles ved hjælp af DNA-oligonukleotider, da DNA-baserede prober ikke besidder de samme kernevåbenkapacitet eksport som RNA-baserede prober. Strukturelt er RBMB løkke typisk designet til at være mellem 15 og 21 baser lange, for at skabe en balance mellem specificitet og selektivitet ved RNA hybridisering. Den korte stilk, der udgør de to selvstændige komplementære domæner er normalt designet til at være 4 baser. Hvis der vælges en længere stilk, er hastigheden af hybridisering mellem RBMB loop og mål-RNA betydeligt langsommere 17,18. Omvendt, når en kortere stamceller sekvens er valgt smeltetemperaturen ofte er for lav til at opretholde stilk-loop-struktur ved 37 ° C, hvilket fører til en høj baggrund signal. Specificiteten af ​​RBMB er også røduced som stilken længde forkortes. Da sekvensen af RBMB stilk-sløjfe kan også påvirke RBMB præstationer, skal udvælges omhyggeligt 19. Især bør ideelle loop sekvenser har minimal sekundær struktur, hybridisere til RNA-sekvenser med minimal sekundær struktur, undgå proteinbindingssteder og undgå off-target-bindende. Forudsigelser af både RBMB og RNA sekundær struktur kan opnås ved hjælp af software som f.eks mfold 20. Supplerende off-target sites kan identificeres ved hjælp af et nukleotid Basic Local Assignment søgeværktøj (BLAST). Men på grund af uoverensstemmelser i modellens forudsigelser og det er vanskeligt at identificere protein-biding websteder, specificitet alle RBMBs sidste ende skal valideres eksperimentelt.

Om ønsket kan en uquenchet henvisning farvestof, der er ufølsom over for hybridisering tilstand sættes til RBMB 15. Tilføjelsen af ​​en reference farvestof kan PRovide en markør for sonde levering og bruges til ratiometrisk billeddannelse, hvis der kræves mere nøjagtige målinger af totale cellulære fluorescens. Referenceværdierne farvestoffer tillader målinger, der skal justeres for forskelle i baggrunden på grund af celle-til-celle variation i leveringen. Men når billeddannelse individuelle RNA-transkripter, reference farvestof er ikke nødvendig. Især kan nogle reference farvestoffer interferere med eksport af RBMBs fra kernen, hvilket fører til en lidt højere baggrund signal i kernen.

Når konstrueret korrekt, kan RBMBs anvendes til at afbilde individuelle RNA-transkripter i enkelte levende celler, hvis målet RNA manipuleret til at indeholde mindst fire RBMB bindingssteder (figur 1B) 16. RBMBs effektivt kan leveres i en lang række af celletyper via mikroperforering, med lidt eller ingen virkning på cellelevedygtighed 21, og kvantitative målinger af genekspression kan væreerhvervet inden for 30 min. Desuden metode er forholdsvis ufølsom over for RBMB koncentration og mål-RNA-niveauer, eftersom fluorescens fra ubundne RBMBs effektivt er standset. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af den anvendte metode til at forberede og rense RBMBs, samt en generel procedure for levering af RBMBs ind i levende celler via mikroporering og billeddannelse af enkelt RNA-transkripter i real-tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I denne protokol blev en oligonucleotid (RBMB1) mærket på dets 5'-enden med en CF640R reporter farvestof og har sekvensen: 5'mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC MUMU-3 '. Selvstændige komplementære domæner, der driver dannelsen af ​​hårnålen struktur, er med fed skrift. Det andet oligonukleotid (RBMB2) blev mærket ved 3'-enden med en Iowa Sort RQ-Sp quencheren og har sekvensen: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 '.

1. Fremstilling af RBMBs

  1. Udfør en hurtig tur af rørene indeholdende RBMB1 og RBMB2 oligonukleotider, for at sikre den tørrede oligonukleotid er i bunden af ​​røret, og resuspender i DNase og RNase-frit vand til en endelig koncentration på 100 uM. For eksempel bør en 10 nmol prøve af oligonukleotid resuspenderet i 100 pi vand.
  2. MeasURE den nøjagtige koncentration af RBMB1 og RBMB2 stock prøver ved UV-vis-spektroskopi.
    1. Bland 3 ul af RBMB prøve med 117 ul DPBS (uden calcium og magnesium) i et mikrocentrifugerør.
    2. Blank spektrofotometret med DPBS og måle absorbansen 200-800 nm. Bemærk: Peak absorbanser ved 260 nm og 650 nm skal være synlig.
    3. Beregn stamkoncentration af RBMB prøver baseret på absorbans ved 260 nm (eller 650 nm for RBMB1) under anvendelse af ligningen:
      Stock Koncentration (M) = A 260 * fortyndingsfaktor / ekstinktionskoefficient hvor A 260 er absorbansen ved 260 nm og fortyndingsfaktoren 40.
      Bemærk: Ekstinktionskoefficienten for RBMB kan findes på specifikationen leveret af oligonukleotidet producenten. Ekstinktionskoefficienten af ​​CF640R ved 650 nm er 103.000.
  3. Bland 20 ul 100 uM RBMB1, 30 ul 100 uM RBMB2, 6 pi 10x; Phosphatpuffer (10x phosphatbuffer: 480 mM K 2 HPO 4, 45 mM KH 2PO 4, 140 mM NaH 2PO 4, pH 7,2) og 4 ul DNase og RNase-frit vand. Inkuberes blandingen ved stuetemperatur i 30 minutter. Bemærk: Dette er typisk tilstrækkelig til cirka 50 undersøgelser.
  4. Forbered en væskekromatografisøjle med 75 prep klasse Superdex at fjerne eventuelle uhybridiserede RBMB2 oligonukleotider. Brug en 8 ml (0,7 x 20 cm) væskekromatografi søjle med en lejevolumen ~ 4 ml at rense lille volumen af ​​blandede prober.
  5. Vask og ligevægt Superdex med ~ 50 ml 1x phosphatbuffer under anvendelse af en sprøjtepumpe kører ved en strømning ved en strømningshastighed på 0,6 ml / min. Før alle af væsken kommer søjlevoluminet, stop sprøjtepumpen, frigøre den, og lad den resterende væske gå gennem søjlen ved hjælp af tyngdekraften.
  6. Indlæse RBMB blandingen (60 ul) på kromatografisøjlen.
    1. Efter RBMB prøve har helttrådte sengen, tilsættes langsomt yderligere 250 pi 1x phosphatpuffer til toppen af ​​sengen at sikre, at hele prøven er helt ind i søjlen.
    2. Kolonnen til randen med 1x phosphatpuffer. Luk det øverste og start sprøjtepumpen - sprøjten skal fyldes med ~ 50 ml 1x PBS og kørt ved en strømningshastighed på 0,6 ml / min.
    3. Når RBMB nærmer sig bunden af ​​søjlen - den RBMB prøven kan typisk let visualiseres skyldes farven af ​​farvestoffet inkorporeret i sonden - indsamle gennemstrømning på 2 dråber pr mikrocentrifugerør (1,5 ml). Stop opsamling af prøven, når farven inden for de mikrocentrifugerør bliver klar.
  7. Kombiner rør, der indeholder den farvede RBMB prøve - typisk 5-6 slanger - og indlæse i en centrifugal filter enhed (10.000 MW afskæring). Centrifugeres prøven ved 10.000 RCF i 20 min, eller indtil den ønskede lydstyrke. Bemærk: Disse hastigheder og tider vil typiskopnåelse af et slutvolumen på ~ 30 ul.
  8. Mål den nøjagtige koncentration af det oprensede RBMB prøven ved UV-Vis-spektroskopi.
    1. Tag 3 pi af det koncentrerede RBMB prøve og blandes med 117 ul DPBS i et mikrocentrifugerør.
    2. Blank spektrofotometret med DPBS og måle absorbansen 200-800 nm. Bemærk: Peak absorbanser ved 260 nm og 650 nm skal være synlig.
    3. Beregn stamkoncentration på den hybridiserede RBMB baseret på absorbans ved 650 nm under anvendelse af ligningen:
      Stock Koncentration (M) = A 650 * fortyndingsfaktor / uddød koefficient hvor A 650 er absorbansen ved 650 nm, fortyndingsfaktoren er 40.
      Bemærk: Ekstinktionskoefficienten for CF640R ved 650 nm er 103.000 og ekstinktionskoefficienten for Iowa Sort RQ er ~ 20.000. Extinktionskoefficienterne er additiv og er ikke følsom over for hybridisering. Derfor bestanden RBMB prøven har en kombineret ekstinktionskoefficient approximatelå 123.000 ved 650 nm.
  9. Mærk røret hensigtsmæssigt med navn og koncentration og opbevares ved -20 ° C til senere brug.

2. Fremstilling af poly-D-lysin Coated 8 brønde Chambered dækglas

  1. Der fremstilles en opløsning af poly-D-lysin 0,2 mg / ml ved at opløse 5 mg poly-D-lysin (frysetørret pulver, g-bestrålede) i 25 ml steriliseret vand i et sterilt miljø.
  2. Tilsæt 200 pi af 0,2 mg / ml poly-D-lysin-opløsning til hver brønd af en 8-brønds kamre dækglas, i et sterilt miljø.
  3. Inkuber ved stuetemperatur i 16-18 timer i cellekultur hætte.
  4. Aspirer poly-D-lysin og vaskes godt 3 gange med sterilt destilleret vand. Bemærk: De overtrukne kammerobjektglas kan opbevares ved 4 ° C.

3. Probe Levering

Note: Den celle, der anvendes, bør indeholde et integreret gen konstruktion, der udtrykker RNA med mindst 4-sekventiel bindeing steder for RBMB i 3'-ikke-translaterede region (UTR). Målsekvenserne bør supplere løkke RBMB. Det anbefales, at som en negativ kontrol, skal den samme cellelinie manipuleret til at udtrykke den samme genkonstruktion, men uden tandemgentagelserne. I denne protokol, en human fibrosarcom cellelinje, HT 1080, blev manipuleret til at udtrykke GFP RNA med 96-tandem-gentagelser af RBMB målsekvensen i 3'-UTR. Styringen cellelinien blev manipuleret til at udtrykke vildtype-GFP RNA.

  1. Plate celler i en T25-kolbe ved 40-50% sammenflydning dagen før sonde levering. Kultur cellerne med DMEM-medium suppleret med 1% pen / strep og 10% føtalt bovint serum (FBS), og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
  2. Den næste dag, tænde mikroperforator og oprette Mikroperforeringsanordningen parametre til 950 V, 2 impulser, 25 ms. Bemærk: Disse parametre er blevet optimeret til HT1080-celler, men de er celletype afhængige og kan være adjusted til andre celletyper som beskrevet i producentens instruktioner.
  3. Fyld mikroperforeringsanordningen rør med 4 ml elektrolytisk buffer og placere den på mikroperforeringsanordningen stationen.
  4. Tag bestanden prøve af renset RBMB og optøning. Fortynd flere mikroliter til en endelig koncentration på 12 uM med 1x phosphatbuffer. Der er behov for en pi for hver mikroperforering.
  5. Der afpipetteres 1 ml dyrkningsmedium med FBS men uden antibiotika i et mikrocentrifugerør. Bemærk: Dette vil blive brugt til at suspendere cellerne umiddelbart efter mikroporering og kan sættes til side, nær mikroperforeringsanordningen, for tiden. Inddragelsen af ​​antibiotika i dyrkningsmedier vil reducere cellernes levedygtighed efter mikroporering.
  6. Fjern celledyrkningsmedier fra de manipulerede HT1080 celler (60-80% konfluerende), vaskes cellerne med 1 ml Ca2 + og Mg2 + -frie DPBS gang og inkuberes med 1 ml trypsin i 1-2 min.
  7. Stop trypsinization ved tilsætning af 1 ml DMEM-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum uden antibiotika og phenolrødt og overføre cellerne i to 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  8. Spin ned cellerne i mikrocentrifugerør ved 200 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten, resuspender og kombinere cellepellets i et slutvolumen på 1 ml DPBS.
  9. Tag 10 ul fra den godt blandede cellesuspensionen og tælle cellerne.
  10. Pipette cellerne op og ned flere gange for at sikre, at de er godt spredt og overføre 300.000 celler med DPBS ind i en ny 1,5 ml mikrocentrifugerør og spin ned ved 200 xg i 5 minutter.
  11. Fjern supernatanten, være omhyggelig med ikke at forstyrre cellepelleten. Resuspender pellet i 11 pi resuspensionsbuffer og pipette op og ned flere gange for at sikre, at cellerne er godt dispergeret. Vær sikker på ikke at generere eventuelle luftbobler. Bemærk: Luftbobler vil forårsage en gnist under mikroporering og resultere i dårlig RBMB levering og celledød.
  12. Tilsættes 1 ul af den fortyndede RBMB (12 uM) og bland godt ved pipettering op og ned adskillige gange. Igen skal du passe på ikke at generere eventuelle luftbobler.
  13. Aspirer 10 ul af RBMB-celleblanding, ved hjælp mikroperforeringsanordningen pipette, og indsæt pipetten ind mikroperforeringsanordningen røret. Tryk på knappen start for at starte mikroperforeringsanordningen. Bemærk: Der bør ikke være nogen synlige luftbobler i spidsen.
  14. Når skærmen på mikroperforator viser færdiggørelse, pipetten fra stationen, bortvise den 10 pi blandingen i mikrocentrifugerør, der blev udarbejdet tidligere, med 1 ml dyrkningsmedium med FBS men uden antibiotika. Bland forsigtigt ved rokkende rør side til side flere gange.
  15. Spin cellerne ved 200 x g i 5 minutter og vaskes cellerne to gange i 1 ml phenolrødt dyrkningsmedium FBS, men uden antibiotika, for at fjerne eventuelle RBMBs, der ikke blev leveret i cellerne. Resuspenderes med 400 ul phenolrødtfrit dyrkningsmedium med FBS men udenantibiotika.
  16. Plade microporated celler i poly-D-lysin belagt med 8 brønde kamre dækglas 200 pi per brønd eller på det ønskede sammenflydning.
  17. Valgfrit: Hvis det er ønskeligt at billedet kernen, tilføje Hoechst 33342 til cellerne til en slutkoncentration på 0,01 mg / ml.
  18. Placer kamre dækglas i en cellekultur inkubator. Inkuberes cellerne i 1-2 timer forud for billedbehandling, så cellerne har tilstrækkelig tid til at slå sig ned på dækglas overflade. Bemærk: Scanning kan udføres så hurtigt som 30 minutter efter mikroperforering.

4. Image Acquisition

  1. Tænd levende celler bordets øverste inkubationssystem og tempereres det indtil den når 37 ° C, 5% CO2 og 75% fugtighed.
  2. Tænd mikroskopet og fluorescerende lyskilde og åbn Metamorph softwaren. Bemærk: Andre lignende softwarepakker til mikroskop kontrol og image erhvervelse kan også bruges.
  3. Påfør Immersol olie tilmål.
  4. Overfør kamre dækglas med microporated celler til live celle stadiet top inkubation system. Inkubér scenen top-systemet, indtil temperaturen og CO 2 niveauer er stabiliseret.
  5. Åbn fanen Acquire i Metamorph software. Klik på knappen Vis Live-at finde det område, justere fokus under hvidt lys, og klik på knappen Stop Live.
  6. Under fanen Acquire, klik og åbne stream erhvervelse pop-op-knappen, og oprette de ønskede film erhvervelse parametre. Erhverve 150 frames ved hjælp af Cy5 / CF640R filter og gemme billederne på harddisken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kort efter mikroperforeringsanordningen af HT1080-celler i nærværelse af RBMBs, individuelle RNA-transkripter, der blev manipuleret indeholde flere RBMB bindingssites i deres 3'-UTR synes som lyse fluorescerende pletter, når afbildet med en bredt område fluorescensmikroskopi (Figur 2). Mens individuelle RNA-transkripter med så få som fire RBMB bindingssteder kan afbildes i levende-celler, mere RBMB bindingssteder i 3'-UTR, jo stærkere det fluorescerende signal. Desuden, jo flere RBMBs der er bundet til hver udskrift jo længere RNA kan visualiseres før signalet er tabt på grund fotoblegning. I denne protokol, blev RNA manipuleret til at indeholde 96-tandem gentagelser af RBMB målsekvensen i 3'-UTR. Købet af streaming billeder giver de enkelte RNA-transkripter, der skal afbildes i real-tid (Film 1). Individuelle RNA-transkripter kan let ses flytter inden cytoplasmaet og kernen of cellerne. Mens de fleste af de pletter at gennemgå Brownske eller sub-diffuse bevægelser, i sjældne tilfælde en RNA undergår rettet transport vil blive observeret (Film 2). Teser RNA-transkripter bevæge typisk hurtigt langs en ​​lige bane (figur 3); Men nogle RNA gøre følge buede kurver eller foretage pludselige ændringer i retning. Disse bevægelser er i skarp kontrast til Brownske bevægelser, der er tilfældigt i naturen og udviser lille samlet forskydninger inden for de korte tidsrammer, der er erhvervet her (dvs. <1 min). De styret RNA bevægelser er i overensstemmelse med transport af RNA langs mikrotubuli og mikrofilamenter. Disse forsøg viser, at RBMBs giver en alsidig og robust værktøj til billeddannelse individuelle RNA-transkripter i levende celler.

Figur 1
Figur1. Skematisk af RBMBs og den anvendte metode billede individuel RNA-transkripter i levende celler. A) RBMBs i nærvær og fravær af komplementært mål-RNA. I mangel eller mål-RNA, er RBMB fluorescens udslukkes. I nærværelse af mål-RNA, er RBMB fluorescens genoprettet. B) Flere RBMBs binder hver RNA transcript skabe en lys fluorescerende plet, der kan påvises ved bredt felt mikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Repræsentant billede af HT1080 celler stabilt udtrykker RNA med A) 96-tandemgentagelser eller B) 4-tandem gentagelser af RBMB bindingssted i3'-UTR efter intracellulær levering af RBMBs. Tilstedeværelsen af ​​96-tandemgentagelser giver de enkelte RNA-transkripter at fremstå som lyse fluorescerende pletter. RNA, som kun indeholder 4 tandemgentagelser kan også visualiseres, men intensiteten af ​​de fluorescerende pletter er meget svagt og ofte kun påviselige i områder med usædvanlig lav baggrund. Det lille antal særligt lyspunkter svarer til RNA, der ikke bevæger sig. Målestokken:. 10 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Montage af et RNA-transkript gennemgår rettet transport. Den bane af transkriptet er vist i venstre mest panel. Bevægelsesbaneprocessen overlejres over en enkelt fRame af tidsserien. Målestokken:. 2,5 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1. Repræsentant film af HT1080 celler stabilt udtrykker RNA med 96-tandem-gentagelser af RBMB bindingssted i 3'-UTR, efter den intracellulære levering af RBMBs. Individuelle RNA-transkripter forekommer som lyse fluorescerende pletter. Målestokken:. 10 um Klik her for at se video.

Movie 2. Repræsentant film af et RNA-transkript undergår rettet transport. Målestokken:. 10 um Klik her for at se video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evnen til at afbilde enkelt manipuleret RNA-transkripter i levende celler ved hjælp af en konventionel lang-felt mikroskop kræver en lys og fotostabile fluorescerende signal at være forbundet med hver RNA transcript og en lav fluorescerende baggrund stammer fra ubundne fluorescerende prober. Ved denne fremgangsmåde er en lys fluorescerende signal opnået ved hybridisering flere (op til 96) oligonukleotid-baserede fluorescerende prober, dvs RBMBs, på hver RNA-transkript. Men så få som fire bindinger steder er tilstrækkelig 16. De kollektive signaler resulterer i en lys fluorescerende plet, der kan spores i realtid. Tilstedeværelsen af ​​multiple prober også mulighed for længere billedoptagning, da en væsentlig del af de fluorescerende farvestoffer skal Lysblegede før den fælles signal er tabt. Det antages, at denne teknik vil give unik indsigt i RNA-biologi og giver mulighed for undersøgelse af en lang række RNA adfærd spænder fra måling the respons af RNA menneskehandel til forskellige eksterne stimuli, observere unikke subcellulære lokalisering mønstre af mål-RNA, studerer skæbne og levetid af RNA, og leverer indsigt i RNA-regulering. Desuden kan det være muligt at spore ændringer (dvs. op-og ned-regulering) i RNA-ekspression. Selv om denne evne er endnu ikke blevet valideret, har vi tidligere vist, at RNA kopiantal kan temmelig præcist tal for op til 24 timer i levende celler 22. Hertil kommer, at RBMBs ikke at påvirke niveauet af genekspression. Kombineret, disse resultater giver indledende bevis for, at ændringer i genekspression i løbet af denne periode var præcist spores, på en celle til celle-basis, og at RBMBs ikke føre til en stigning i RNA-stabilitet eller bremset RNA-nedbrydning. , Det er imidlertid ikke klart, i hvilket omfang genekspression faktisk ændret i løbet af denne tid, hvis overhovedet.

I almindelighed er detforventes, at enhver stigning i genekspression vil let kunne identificeres; grund af den overflod af ubundet RBMB i den celle, der er gratis at binde nydannede afskrifter. , Hvad er mindre klart er, hvordan RBMBs dissocierer fra RNA under translation og nedbrydning, og hvis der er en vis forsinkelse mellem RNA-ekspression / nedbrydning og imaging af disse afskrifter. Yderligere undersøgelser er stadig behov for bedre at forstå RBMB præstationer i disse scenarier.

Flere alternative metoder til billedbehandling enkelt RNA-transkripter er blevet rapporteret tidligere. De tidligste undersøgelser omfattede fluorescens mærkning isolerede RNA-transkripter og re-indføre disse transkripter i celler, typisk ved mikroinjektion 23,24. Signal-til-baggrund af denne fremgangsmåde er meget høj på grund af evnen til at fjerne eventuelle ubundne fluorescerende farvestoffer, men der er bekymring over, om den observerede RNA adfærd repræsenterer nøjagtigt true RNA-forarbejdning. Den mest almindelige løsning på denne mangel har involveret tekniske transgener med tandemgentagelser i 3'-UTR, der kan være bundet af en fluorescerende reporter, analoge med RBMB strategi, der fremlægges her. Tidligere fluorescerende reportere har medtaget små molekyler, der kun fluorescerer ved binding RNA aptamerer, der almindeligvis omtales som spinat 25, og GFP. Spinat er endnu ikke blevet anvendt til billeddannelse af en enkelt RNA-transkripter, men er blevet anvendt til at afbilde globale udtryk. I modsætning hertil har GFP blevet anvendt med succes billede enkelt RNA-transkripter. I denne fremgangsmåde er et GFP reporter fusioneret til kappeprotein bakteriofag MS2 (GFP-MS2), og binder til en manipuleret RNA konstruktion med tandemgentagelser af MS2-bindingssted i 3'-UTR 2,10. Mens denne tilgang er meget lig den fremgangsmåde, der beskrives her, RBMBs flere fordele. For eksempel RBMBs tillade organiske fluoroforer, der skal anvendes til billeddannelse, som giver et bredere diversity valg med overlegen fotostabilitet og overlegen lysstyrke sammenlignet med fluorescerende proteiner. Desuden er der mange kommercielt tilgængelige organiske fluoroforer, der udsender i langt til nær-infrarød. Fordelen ved at vælge farvestoffer med rød-skiftet emission spektre stammer fra den nedre cellulær autofluorescens observeret ved disse bølgelængder. Da høje niveauer af autofluorescens nemt kan overdøve enhver fluorescerende signaler forbundet med RNA hybridisering, evnen til at drastisk at reducere autofluorescens giver et vigtigt løft i signal-baggrund. En anden vigtig fordel ved anvendelse af RBMBs er, at signalet fra ubundne prober væsentligt udslukkes. Selv er taget forskellige metoder til at reducere baggrunden fluorescens af ubundet GFP i GFP-MS2 tilgang, fx anvendelse af nukleart signaler lokalisering, kontrollerende GFP ekspressionsniveauer, og split GFP komplementation 1,10,11,26,27, den tilstedeværelse af en egentlig afkølende Moiety i RBMB design giver brugerne langt større eksperimentel fleksibilitet. For eksempel RBMB fremgangsmåde er relativt ufølsomme over for både den relative og totale niveau af RNA-ekspression og probekoncentration. Faktisk kan de enkelte afskrifter skal afbildes med RBMB koncentrationer, der spænder en størrelsesorden. De kombinerede fordele ved højere fotostabilitet, lysere signal og lavere baggrund foretage tidstro RNA billeddannelse eksperimenter med RBMBs langt mere tilgængelige til mikroskopi brugere med begrænset ekspertise.

Måske den mest bemærkelsesværdige ulempe ved anvendelse af exogene prober såsom RBMBs, i modsætning til en molekylær reporter, såsom GFP, er behovet for intracellulær levering. Heldigvis findes der en række muligheder, fx mikroinjektion 28 transfektionsreagenser agenter 29, cellepenetrerende peptider 30, og streptolysin O (SLO) 31. Personligt har vi fundet, at mikroporering erden mest brugervenlige og alsidig løsning, der typisk resulterer i> 95% levedygtighed og levering effektivitet 21. Det er sandsynligt, fordi den mikroliter volumen elektroporation proces udviser en reduktion i de mange skadelige begivenheder ofte er forbundet med elektroporation, herunder varmeudvikling, metalion opløsning, pH-variationer og oxiddannelse. Vigtigere er det, mikroporering er også modtagelig for high-throughput undersøgelserne, fordi RBMBs kan leveres i> 100.000 celler i et enkelt eksperiment.

På trods af de mange fordele ved at bruge RBMBs til billedet RNA lokalisering og bevægelse i levende celler, er stadig en række begrænsninger og udfordringer. Måske den største udfordring er den manglende evne til at spore RNA i mere end et par minutter under kontinuerlig eksponering. Dette er en konsekvens af både fotoblegning og evnen af ​​RNA til at bevæge sig ud af den fokale afbildningsplanet. Lysere og mere fotostabile farvestoffer kan hjælpe alleviate begge af disse mangler, ved at øge antallet af gange hver farve kan være glade og lade de diskrete fluorescerende pletter, der skal afbildes ved større afstande fra brændplanet. En lovende tilgang til at øge fotostabilitet indebærer brug af selvhelbredende farvestoffer, der udnytter triplet-tilstand quenchere i nærhed til den organiske fluorofor at forlænge deres levetid 32. En anden mulighed kan være at anvende fluorescerende forstærkende konjugerede polymerer, som er sammensat af et stort antal forbundne fluoroforer, der ikke selv bratkøling. Disse polymerer kan være mange gange kraftigere end enkelte organiske fluoroforer og alligevel effektivt standset ved en enkelt afkølende del 33,34; er dog stadig behov for yderligere arbejde på dette område. Det skal bemærkes, at intermitterende billeddannelse med en rammehastighed> 1 ramme pr sekund, kan ikke udføres for at afbilde et enkelt RNA-transskript over længere tid, fordi det er vanskeligt at sikre, at det er than samme RNA transcript spores fra ramme-til-frame. Selvfølgelig, kvantitativ vurdering af genekspression på enkelt celle niveau er stadig muligt over lange tidshorisonter, gennem optællingen af de enkelte fluorescerende pletter på en per celle basis 16,35,36. I dette tilfælde er det ikke nødvendigt at holde styr på de enkelte afskrifter. Generelt antages det, at RBMBs er i stand til at tilvejebringe vigtig indsigt i RNA-funktion og muliggør billeddannelse af enkelt manipuleret RNA-transkripter med konventionel mikroskopi udstyr og begrænset ekspertise.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Mark Behlke og Dr. Ling Huang er ansat af IDT som giver oligonukleotider til salg ligner nogle af forbindelserne beskrevet i manuskriptet. IDT er dog ikke et børsnoteret selskab, og de personligt ikke ejer ingen aktier / egenkapital i IDT.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation KARRIERE Award (0953583) og National Institute of Health NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nuclease-free water Life Technologies AM9932 no DEPC-treated
DPBS Life Technologies 14190-144 No Ca2+ and Mg2+
Cary 100 UV-Vis spectrophotometer Agilent Technologies
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P284-500
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific S381-500
Microcentrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 ml
Chromatography column Kimble Chase Life Science 420400-0720 0.7 x 20 cm
Superdex 75 prep grade GE healthcare 17-1044-01
Syringe pump Braintree Scientific BS-300
Syringe BD 301035 60 ml, Luer-lok tip
Centrifugal filter units Millipore UFC501096 MW 10,000 cutoff
Centrifuge 5418 Eppendorf
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P7280-5MG lyophilized powder, g-irradiated
8-well chambered coverglass Fisher Scientific 155409 Working volume 0.2-0.5 ml
HT1080 ATCC CCL-121 Human Fibrosarcoma cell line
Cell culture flask Corning 430639 25 cm2
DMEM Life Technologies 11965084 High glucose
DMEM without phenol red Life Technologies 21063029 High glucose
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500ML
Penecillin/streptomycin Life Technologies 15140122
Trypsin Life Technologies 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Neon transfection system Life Technologies MPK5000
Neon transfection system kit Life Technologies MPK1096
Hemacytometer Fisher Scientific 02-671-10
Hoescht 33342 Life Technologies H1399
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus
SOLA light engine Lumencor
Metamorph Molecular Devices Software controlling microscope
Immersol oil 518F Fisher Scientific 12-624-66B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  3. Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
  4. Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
  5. Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
  6. Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  7. Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
  8. Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
  9. Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
  10. Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
  11. Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
  12. Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
  13. Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
  14. Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).
  15. Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
  16. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
  17. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
  18. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
  19. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
  20. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  21. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
  22. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
  23. Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
  24. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
  25. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  26. Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
  27. Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
  28. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
  29. Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
  30. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
  31. Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
  32. Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
  33. Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
  34. Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
  35. Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
  36. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).

Tags

Genetik RNA billedbehandling enkelt molekyle fluorescens levende celle
Real-time Imaging af Single Engineered RNA-transkripter i levende celler Brug Ratiometrisk bimolekylær Beacons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Song, Y., Zhang, X., Huang, L.,… More

Song, Y., Zhang, X., Huang, L., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons. J. Vis. Exp. (90), e51544, doi:10.3791/51544 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter