Summary
Rasyometrik bimoleküler işaretleri (RBMBs) canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri için kullanılabilir. Burada, RBMBs, mikroporasyonu ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkriptlerinin floresan görüntüleme hücrelere RBMBs teslimat hazırlanmasını ve saflaştırılmasını tanımlarlar.
Abstract
Her iki gen ifadesinin zamansal ve mekansal düzenleme hücre fonksiyonu üzerinde önemli sonuçları olabilir büyüyen gerçekleşme tek bir canlı hücrelerin içindeki bireysel RNA transkriptleri görselleştirmek için çeşitli tekniklerin geliştirilmesine yol açmıştır. Son zamanlarda tarif edilmiştir ümit verici bir teknik 3'-çevrilmemiş bölgesinde RBMB hedef dizinin en az dört tandem tekrarını ihtiva edecek şekilde, RNA transkriptlerini algılamak için bir oligonükleotid esaslı optik sonda, rasyometrik bimoleküler işaret fan (RBMB) kullanmaktadır. RBMBs tamamlayıcı RNA ile özel olarak melezleşme üzerine parlak bir flüoresan sinyal verecek şekilde tasarlanmış olan, ancak aksi takdirde söndürüldü kalır. Bu yaklaşımda, bir sentetik probunun kullanılması kırmızıya doğru kayar, ışığa karşı sağlar ve yüksek yayım organik boyalar görüntüleme için kullanılır. Bir geniş alan floresan mikroskop altında bakıldığı zaman farklı floresan noktalar işlenmiş olan RNA transkriptleri sonuçlar çok RBMBs bağlanması. Sonuç olarak, bireysel RNA transkript hareket hazır floresan görüntüleri bir zaman serisi alarak gerçek zamanlı olarak görülebilir. Burada mikroporasyonu hücrelere hazırlanması ve saflaştırılması RBMBs bölgesinin verilmesi tanımlanır ve canlı hücre tek RNA transkript görüntüleme.
Introduction
RNA transkript ifadesi ve düzenlenmesi hücre davranışlarını ve kaderini kontrol etmek için büyük ölçüde sorumlu olan bir karmaşık ve dinamik bir süreçtir. Dikte hücre fonksiyonunda RNA önemi bir süredir bilinmesine rağmen, bu iki en RNA analiz araçları gibi transkripsiyon ve çatlama gibi önemli düzenleyici bir etkinlik yakalamak için gerekli mekansal ve zamansal çözünürlüğü olmadığından, RNA arasında açık bir bağlantı çizmek zordur kaçakçılığı ve lokalize RNA işlenmesi. Bu, her RNA transkriptleri 1 gerçek zamanlı olarak canlı hücreler ile görselleştirilebilir olanak sağlayan çeşitli tekniklerin gelişmesiyle yol açmıştır. Belki de, bu tekniklerin en önemli 3'-UTR 2,3 MS2 olarak bağlanma alanının tandem tekrarını içeren işlenmiş olan RNA'yı hedef GFP MS2 füzyon proteinini kullanır. Yakın içine birden GFP molekülleri getirerek, bireysel RNA transkript gibi parlak floresan noktalar görünürfloresan mikroskobu ile. GFP-MS2 sistemi doğrudan görselleştirme ve transkripsiyon ölçümleri 4,5 patlama, benzersiz alt hücresel lokalizasyonu ve işleme 6-9 tespiti, ve RNA ulaşım 10 gerçek zamanlı görüntüleme, RNA davranış içine görülmemiş içgörü, sağlamıştır. Ancak, GFP-MS2 sisteminin muazzam potansiyele rağmen, bağlanmamış GFP-MS2 füzyon proteinleri bu tekniğin çok yönlülük ve dinamik aralığı sınırlar yüksek arka plan floresan sinyal oluşturabilir. Çeşitli yaklaşımlar subselüler bağlanmamış GFP-MS2 10 compartmentalization, protein fragmanı tamamlayamamakta 11, ve alternatif RNA bağlayıcı proteinler dahil, bu arka plan sinyali sınırlamak için geliştirilen ve 12 hedef oylandı. Ancak, bu yaklaşımların her RNA hedefinin ve GFP-MS2 füzyon proteinin nispi ifade toplam duyarlıdır.
Bir a olarakGFP-MS2 sistemlere lternative moleküler işaretçileri de 3'-UTR 13,14 tamamlayıcı bağlanma bölgesinin birbiri ardına dizilmiş tekrar mühendislikten RNA transkriptlerini algılamak için kullanılmıştır. Moleküler yol gösterici bir söndürücü ile bir ucunda ve bir flüoresan raportör diğer ucunda etiketlenmiştir saç tokası oluşturan oligonükleotid probları bulunmaktadır. RNA söndürücü flüoresan raportör hedef ve bağlı olmayan zaman düşük floresan hali ile sonuçlanarak, yakın kalır. Melezleme üzerine, floresan raportör ve söndürücü birbirinden ayrılır ve floresan restore edilmiştir. GFP-MS2 sistemi, floresan mikroskobu ile tespit edilebilir parlak florasan noktada bir tek RNA transkripti sonuçlar üzerine çok sayıda moleküler işaretçileri bağlanmasını benzer; Ancak, plan floresan nedeniyle bağlanmamış moleküler işaretlerinin söndürüldü yapılandırmasına, çok daha düşük olması beklenmektedir. Ne yazık ki, akıllı aktivasyon mekanizması rağmen bu m dahil edilirolecular işaret tasarımı, canlı hücre içine sokulduğunda bir saç tokası konformasyonunda kalmaz moleküler işaretleri melezleşmemiş giderek artan kanıtlar vardır. Sonuç olarak, belirgin bir sinyal-arka azaltan bir yanlış pozitif bir sinyal üretir. 15,16; Bu eksikliği gidermek için, biz son zamanlarda canlı hücreler, rasyometrik bimoleküler fenerler (Şekil 1A RBMBs) görüntüleme RNA için yeni bir sentetik sonda geliştirdi. RBMBs kısa saç tokası RNA (shRNA) ve moleküler işaretleri hem özelliklere sahip bir hibrid yapı oluşturan iki 2'-O-metil oligonükleotid şerit oluşur. 3'-UU çıkıntı ve uzun süreli etki, iki iplikçikli shRNA daha karakteristik ise döngü ve floresan aktivasyon mekanizması, moleküler işaret benzerdir. ShRNA özellikleri az gözlemlenebilir bozulması ile biz> 24 saat için yükseltmektedir içi ömür bulduk nükleer ihracat, sürücü tasarlanan vedöngüsünün spesifik olmayan açılmasını önler. Sonuç RBMBs moleküler işaretleri önemli ölçüde daha yüksek bir sinyal-arka plan gösterirler gibi.
RBMBs RNA esasına dayalı sondalar olarak aynı nükleer ihracat yetenekleri sahip olmayan DNA-temelli probları, çünkü DNA oligonükleotidleri kullanılarak hazırlanabilir edilemez Belirtilmelidir. Yapısal olarak, RBMB köprüsü tipik olarak RNA, melezleşme üzerine özgüllük ve seçicilik arasında bir denge oluşturmak için, 15 ve 21, uzun bazlar arasında olması tasarlanmıştır. İki kendi kendini tamamlayan etki oluşturan kısa bir kök, genellikle 4 bazlar arasında olacak şekilde tasarlanmıştır. Daha uzun bir sap seçilirse, RBMB döngü ve hedef RNA ile hibritleşmenin hızı önemli ölçüde 17,18 yavaşlatılır. Daha kısa bir sap dizisi seçildiğinde Tersine, erime sıcaklığı, yüksek bir zemin sinyali yol açan, 37 ° C 'de sap-halka yapısını sürdürmek için çoğu zaman çok düşüktür. RBMB spesifikliği de kırmızısap uzunluğu olarak kısaltılır uced. Ayrıca RBMB performansını etkileyebilir RBMB kök döngüsünün dizisi için, dikkatle 19 seçilmelidir. Özellikle, doğru döngü diziler, en az bir ikincil yapı olması gereken minimum sekonder yapısı ile RNA sekansları ile hibridize olan, protein bağlama siteleri önlemek ve bağlanma hedef dışı kaçının. RBMB ve RNA ikincil yapısının her ikisinin tahminlerin mfold 20 gibi yazılımları kullanılarak elde edilebilir. Tamamlayıcı hedef dışı siteler bir nükleotid Temel Yerel Atama Arama Aracı (ŞOK) kullanılarak tespit edebilirsiniz. Ancak, model tahminleri ve protein-bekliyorumdur bölgelerinin tanımlanmasında zorluk tutarsızlıklar, tüm RBMBs özgüllüğü sonuçta deneysel doğrulanması gerekir.
Eğer arzu edilirse, hibridizasyon durumuna karşı duyarsız olan söndürülmemiş referans boya RBMB 15 eklenebilir. Referans boyanın eklenmesi için prsistemi teslimat için bir işaretleyici Ovide ve toplam hücresel floresans daha kesin olarak ölçülmesi gereken eğer oran ölçer görüntüleme için kullanılabilir. Referans boyalar ölçüm teslimat hücre-hücre değişiklikleri nedeniyle arka farklılıkların ayarlanmasını sağlar. Bununla birlikte, tek tek RNA görüntülerken, belirli referans boya gerekli değildir transkript. Özellikle, bazı referans boyalar çekirdeğinde biraz daha yüksek bir arka plan sinyali yol çekirdekten RBMBs ihracat engelleyebilir.
Doğru tasarlandığında hedef RNA en az dört RBMB bağlama sahası (Şekil 1B) 16 ihtiva edecek şekilde ise, RBMBs, tek bir canlı hücrelerde tek tek görüntü RNA transkriptleri için kullanılabilir. RBMBs verimli hücre canlılığı 21 az veya hiç etkisi ile mikroporasyonu yoluyla hücre türleri geniş bir aralığı içine teslim edilebilir, ve gen ifadesinin niceliksel ölçümler olabilir30 dakika içinde edinilmiş. Ilişkisiz RBMBs flüoresan verimli söndürülür Dahası, metodoloji, RBMB konsantrasyon ve hedef RNA düzeyleri oldukça duyarsızdır. Burada RBMBs hazırlamak ve saflaştırmak için kullanılan metodolojinin detaylı açıklamasını, yanı sıra mikroporasyonu üzerinden canlı-hücre içine RBMBs teslimat için genel bir prosedür ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkript görüntüleme sağlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, tek bir oligonükleotid (RBMB1) bir CF640R muhabir boya 5'-ucunda etiketlenmiştir ve aşağıdaki diziye sahiptir: 5'-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC mUmU-3 '. Saç tokası yapısının oluşumunu tahrik Öz-tamamlayıcı etki, cesur vardır. İkinci oligonükleotid (RBMB2) bir Iowa Siyah RQ-Sp söndürücü ile 3'-ucunda etiketlenmiştir ve sekansına sahiptir: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 '.
RBMBs hazırlanması 1.
- RBMB1 ve RBMB2 oligonükleotidleri içeren bu tüplerin hızlı bir spin gerçekleştirme kurutuldu, oligonükleotid 100 uM'lik bir son konsantrasyon elde DNase ve RNase-içermeyen su içinde tüpünün dibine ve tekrar süspansiyon olduğundan emin olmak için. Örneğin, oligonükleotidin 10 nmol numune su içinde yeniden süspanse 100 ul olmalıdır.
- Ölçümure, UV-vis spektroskopi ile RBMB1 ve RBMB2 stok numuneleri tesisinin konsantrasyonu.
- Bir mikrosantrifüj tüpü içinde (kalsiyum ve magnezyum olmadan) 117 ul DPBS RBMB numunenin 3 ul karıştırın.
- DPBS Boş spektrofotometre ve 200-800 nm absorbans ölçümü. Not: Tepe 260 nm'de absorbans 650 nm görülebilir olmalıdır.
- Aşağıdaki denklem kullanılarak, 260 nm'de (ve RBMB1 için 650 nm) 'de abzorbans göre RBMB numunelerin stok konsantrasyonu hesaplanır:
Stok Konsantrasyon (M) A 260 260 nm'de absorbans ve seyreltme faktörü 40 olan A 260 * seyreltme faktörü / söndürme katsayısı =.
Not: RBMB için söndürme katsayısı oligonükleotid üreticisi tarafından sağlanan özellikler sayfasında bulunabilir. 650 nm'de CF640R söndürme katsayısının 103,000 olan.
- 100 uM RBMB1 20 ul, 100 uM RBMB2 30 ul, karışım, 6 ul 10xFosfat tamponu (10x fosfat tampon çözeltisi: 480 mM K 2 HPO 4, 45 mM KH 2 PO 4, 140 mM NaH 2 PO 4, pH 7.2) ve 4 ul DNase ve RNase-barındırmayan su bulunmaktadır. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. Not: Bu, yaklaşık olarak 50 çalışmaları için yeterlidir.
- Herhangi bir melezleşmemiş RBMB2 oligonükleotidleri kaldırmak hazırlık derecesindeki Superdex 75 kullanılarak bir sıvı kromatografi sütunu hazırlayın. Karma probların küçük hacimli saflaştırmak için bir ~ 4 ml yatak hacmi ile 8 mL (0.7 x 20 cm), sıvı kromatografi sütunu kullanın.
- Yıkama, 0.6 ml / dk bir akış oranında bir akış hızında çalışan bir şırınga pompası kullanılarak ~ 1x fosfat tamponu, 50 ml Superdex dengelenmesi ve. Sıvının tümü yatak hacimli girmeden önce, şırınga pompası durdurmak ayırmak ve geriye kalan sıvı yerçekimi ile sütun geçelim.
- Kromatografi kolonuna RBMB karışımı (60 ul) yükleyin.
- RBMB örnek tamamen sahiptir sonrayatak girdi yavaşça bütün örnek tamamen sütun girdiğini sağlamak için yatağın üst 1x fosfat tampon başka bir 250 ul.
- 1x fosfat tampon maddesi ile jant sütunu doldurun. Üst kapatın ve şırınga pompası başlamak - şırınga ile doldurulmalıdır ~ 50 ml PBS 1x ve 0.6 ml / dk bir akış hızında gerçekleştirilmiştir.
- RBMB sütunun alt yaklaştığında kere - RBMB numunesi tipik kolayca probu içerisine dahil boyanın rengine bağlı olarak görselleştirilebilir - mikrosantrifüj tüpü başına 2 damla (1.5 mi) akış yoluyla toplayın. Mikrosantrifüj tüpleri içinde renk açık hale geldikten sonra bir numunenin alınması durdurun.
- Genellikle 5-6 tüpleri - - renkli RBMB örneği içeren tüpler birleştirin ve bir santrifüj filtre cihazı (10.000 MW kesme) yüklenemedi. 20 dakika boyunca ya da istenen hacme kadar 10000 RCF santrifüjleyin. Not: Bu hızları ve süreleri, tipik~ 30 ul'lik nihai bir hacim elde edildi.
- UV-Vis spektroskopisi yoluyla saflaştırılmış RBMB numunenin tam konsantrasyonu ölçümü.
- Konsantre RBMB numunenin 3 ul alın ve bir mikrosantrifüj tüp içinde 117 ul DPBS ile karıştırın.
- DPBS Boş spektrofotometre ve 200-800 nm absorbans ölçümü. Not: Tepe 260 nm'de absorbans 650 nm görülebilir olmalıdır.
- Aşağıdaki denklem kullanılarak, 650 nm'de absorbans göre melezleştirilmiş RBMB stok konsantrasyonu hesaplanır:
Hazır Konsantrasyon (M) bir 650 650 nm'de emicilik olan bir 650 x seyreltme faktörü / sönmüş katsayısı = seyreltme faktörü 40'tır.
Not: 650nm de CF640R için yok olma katsayısı 103,000 ve Iowa siyah RQ söndürme katsayısının ~ 20000. Söndürme katsayısı katkı maddesi olan ve melezleştirmeyi duyarlı değildir. Bu nedenle, örnek stok RBMB approximatel birleştirilmiş bir sönüm katsayısının650 nm'de Y 123,000.
- Gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de adı ve konsantrasyon ve mağaza ile uygun tüp etiketleyin.
8 oyuklu odacıklı coverglass Kaplı poli-D-lisin 2. Hazırlık
- Steril bir ortamda sterilize edilmiş 25 ml su içinde Poly-D-lisin (liyofilize edilmiş tozu, G-irradyasyona maruz bırakılmış), 5 mg çözülmesiyle poli-D-lizin, 0.2 mg / ml çözelti hazırlayın.
- Steril bir ortamda bir 8 oyuklu odacıklı coverglass her çukuruna 0.2 mg / mL poli-D-lisin çözeltisinin 200 ul ilave edin.
- Hücre kültürü kaputu 16-18 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- Poli-D-lisin aspire ve steril damıtılmış su ile oyuk 3 kez yıkayın. Not: Kaplanmış bölmeli lamlar 4 ° C'de saklanabilir.
3. Probe Teslimat
Not: en az 4 ardışık olarak bağlanan RNA eksprese eden bir entegre bir gen yapısını içermelidir ikinci hücre sistemini3'-tercüme edilmemiş bölge (UTR) için siteler RBMB ing. Hedef sekansları, RBMB uzanımına göre tamamlayıcı olmalıdır. Bir negatif kontrol olarak, aynı hücre çizgisi, aynı gen yapısını ifade etmek için tavsiye fakat birbiri ardına dizilmiş tekrar temin etmemektedir. Bu protokol, insan fiberli sarkoma hücre çizgisi, HT1080, 3'-UTR RBMB hedef dizinin 96 tandem tekrarı ile GFP RNA'yı ifade etmek için üretilmiştir. Kontrol hücre çizgisi, vahşi tip GFP RNA'yı ifade etmek için üretilmiştir.
- Bir gün sonda teslimattan önce% 40-50 confluency bir T25 şişesi Levha hücreleri. Kültür,% 1 pen / strep,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM ortamı, hücreleri, ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, microporator açın ve 950 V, 2 bakliyat, 25 msn mikrogözeneklendirme parametrelerini ayarlamak. Bu parametreler, HT1080 hücreler için optimize edilmiştir, ancak bağımlı hücre tipidir ve adjus olabilir: Notted diğer hücre türleri için üreticinin talimatlarına açıklandığı gibi.
- 4 mi elektrolitik tamponu ile gözeneklendirilmesinde tüp doldurun ve gözeneklendirme istasyonu üzerine yerleştirin.
- Saflaştırılmış RBMB stok örnek çıkarın ve buzunu. 1x fosfat tampon maddesi ile 12 uM'lik nihai bir konsantrasyona kadar birkaç mikrolitre seyreltin. 1 ul her mikroporasyonu için gereklidir.
- Pipet FBS ile, ancak bir mikrosantrifüj tüpü içine, antibiyotikler olmaksızın kültür ortamı 1 mi. Not: Bu sefer olmak için, mikrogözeneklendirme cihazın yakınında, mikroporasyonu hemen sonra hücrelerin askıya kullanılacak ve kenara olabilir. Kültür ortamında antibiyotik dahil mikroporasyonu sonra hücre canlılığını azaltır.
- Bir kere 1 mi Ca 2 + 2 + ve Mg-free DPBS Hücreleri yıkamak, işlenmiş HT1080 hücreler (% 60-80 ortak akışlı) hücre kültür ortamını çıkarın ve 1-2 dakika boyunca 1 ml tripsin ile inkübe edin.
- Trypsinizatio durdurunantibiyotik ve fenol kırmızısı olmaksızın,% 10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 1 mi DMEM ortamı, ekleme ve iki adet 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine hücreleri aktarırlar: n.
- 5 dakika boyunca 200 x g'de mikrosantrifüj tüpü içinde hücreleri aşağı dönerler. Süpernatan, tekrar süspansiyon çıkarın ve 1 ml DPBS nihai hacimde hücre pelletleri birleştirir.
- Iyi karıştırılmış hücre süspansiyonundan 10 ul ve al hücreleri sayın.
- Emin onlar da dağılır yapmak ve yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine DPBS ile 300.000 hücreleri aktarmak ve 5 dakika boyunca 200 xg'de spin yukarı ve aşağı birkaç kez hücreleri pipetle.
- Hücre pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, süpernatantı. Hücreler, disperse olmasını sağlamak için 11 ul resüspansiyon tamponu ve pipet ve aşağı yukarı birkaç kez pelletini. Herhangi bir hava kabarcıkları üretmek için değil emin olun. Not: Hava kabarcıkları mikroporasyonu sırasında bir kıvılcıma yol ve fakir RBMB teslimat ve hücre ölümüne neden olur.
- Seyreltilmiş RBMB (12 mM) 1 ul ekleyin ve pipetleme ve birkaç kez aşağı iyice karıştırın. Yine herhangi bir hava kabarcıkları üretmek için dikkatli olun.
- Aspire RBMB-hücre karışımı, 10 ul, mikro-gözeneklendirmeden pipet kullanılarak ve mikro-gözeneklendirmeden tüp içine pipet yerleştirin. Gözeneklendirilmesinin başlatmak için start düğmesine basın. Not: ucunda hiçbir görünür hava kabarcığı olmalıdır.
- Microporator ekran tamamlanmasını gösterdiğinde, FBS'li ancak antibiyotik olmadan 1 ml kültür ortamı ile, daha önce hazırlanan mikrosantrifüj tüpe 10 ul karışımı sınırdışı istasyonundan pipet kaldırmak. Tüp yan-yan birkaç kez sallanan hafifçe karıştırın.
- 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri Spin ve hücrelere verilebilir değil bir RBMBs kaldırmak için FBS ile antibiyotikler olmadan 1 mi fenol kırmızı içermeyen kültür ortamı içinde hücreleri iki kere yıkayın. FBS ile ancak olmadan 400 ul fenol kırmızı içermeyen kültür ortamı ile yeniden süspanseantibiyotikler.
- Plaka oyuk başına ya da istenen birbirine karıştığında, 200 ul 8 oyuklu odacıklı coverglass kaplanmış poli-D-lisin içine microporated hücreleri.
- İsteğe bağlı: bu çekirdeği görüntüye arzu edilir ise, 0.01 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda, hücrelere Hoescht 33342 ekleyin.
- Bir hücre kültür inkübatör içine odacıklı coverglass yerleştirin. Hücreler coverglass yüzeyinde yerleşmek için yeterli zaman var, böylece önce görüntüleme 1-2 saat inkübe hücreleri. Not: Görüntüleme 30 dakika sonra mikroporasyonu kısa sürede gerçekleştirilebilir.
4. Görüntü Alma
- Canlı hücre aşamada üst kuluçka sisteminde açın ve 37 ° C,% 5 CO 2 ve% 75 nem ulaşıncaya kadar dengelenmeye.
- Mikroskop ve floresan ışık kaynağı açın ve Metamorph yazılımını açın. Not: mikroskop kontrolü ve görüntü alımı için diğer benzer yazılım paketleri de kullanılabilir.
- Için İmmersol yağı sürünhedefi.
- Canlı hücre aşamada üst inkübasyon sistemine microporated hücreleri ile odacıklı coverglass aktarın. Sıcaklığına kadar sahne üst sistemini inkübe ve CO 2 düzeyleri stabilize edilir.
- Metamorph yazılım, Edinme sekmesini açın. , Alanı bulmak için Show Canlı düğmesini tıklatın beyaz ışık altında odağı ayarlamak ve Stop Live düğmesini tıklatın.
- Edinme sekmesinde, tıklayın ve dere satın alma pop-up düğme açın ve istenen film satın parametrelerini ayarlamak. Cy5 / CF640R filtre kullanarak 150 kare Edinme ve sabit diskinize kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geniş alan floresan mikroskobu (Şekil 2) ile görüntülendi zaman kısa bir süre RBMBs varlığında HT1080 hücrelerinin gözeneklendirilmesinin takiben, işlenmiş olan bireysel RNA transkriptleri, 3'-UTR birden RBMB bağlanma mevkilerini ihtiva edecek şekilde parlak noktalar floresan görülür. Gibi sadece dört RBMB bağlanma bölgeleri ile ayrı RNA transkriptleri canlı hücreler olarak görüntülenebilir birlikte, 3'-UTR bağlanma yerleri daha RBMB, güçlü flüoresan sinyal. Nedeniyle bir sinyal foto ağartıcı kaybetti önce Ayrıca, uzun Her bir transkrip için bağlı daha RBMBs RNA görselleştirilebilir. Bu protokolde, RNA 3'-UTR RBMB hedef dizinin 96 tandem tekrarını içeren üretilmiştir. Akarsu görüntülerin edinimi bireysel RNA transkript gerçek zamanlı (Film 1) görüntülü sağlar. Bağımsız RNA transkriptleri kolaylıkla sitoplazma ile çekirdek O içinde hareket görülebilirHücrelerin, f. Lekelerin en nadir durumlarda, Brown ya da alt-pasif hareketleri geçmesi gözükse de yönettiği taşıma geçiren bir RNA (Film 2) görülecektir. RNA transkript genellikle düz bir yol (Şekil 3) boyunca hızla hareket tezleri; Ancak, bazı RNA kavisli yolları takip veya yönde ani değişiklik yapabilirim. Bu hareketler doğada rastgele ve burada edinilen kısa zaman dilimlerinde (yani <1 dakika) içinde küçük toplam deplasmanları sergileyen Brown hareketleri, keskin bir karşıtlık vardır. Idareli RNA hareketleri mikrotübüller ve mikro boyunca RNA taşıma ile tutarlıdır. Bu deneyler RBMBs canlı hücrelerin içindeki bireysel RNA transkript görüntüleme için çok yönlü ve sağlam bir araç sağladığını göstermektedir.
Şekil1. RBMBs şematik ve canlı hücrelerin a.) Tamamlayıcı bir hedef RNA 'nın varlığında ve yokluğunda RBMBs olarak yöntem ikinci görüntü ayrı RNA transkriptleri. Ya da yokluğu, hedef RNA üzerinde RBMB floresan söndürülür. Hedef RNA varlığında, RBMB floresan restore edilmiştir. B) Birden RBMBs geniş alan floresan mikroskobu ile tespit edilebilir bir parlak floresan nokta oluşturarak her RNA transkript bağlamak. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
A ile kararlı bir şekilde ifade eden HT1080 hücreler, RNA), 96 ya da birbiri ardına dizilmiş tekrar RBMB bağlanma yeri B) 4-dizilmiş tekrar bölgesindeki Şekil 2. Örnek Resim3'-UTR, RBMBs hücre içi uygulamayı izleyen. 96-tandem tekrarlar varlığı bireysel RNA transkript parlak floresan noktalar olarak görünmesini sağlar. Sadece 4-tandem tekrarını ihtiva eden RNA da görüntülenmiştir, ama floresan lekelerinin yoğunluğu çok loş ve son derece düşük arka bölgelerde genellikle sadece tespit edilebilir. Özellikle parlak noktalar az sayıda hareket değil RNA gelir. Ölçek çubuğu:. 10 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir RNA transkripti Şekil 3. Montajı taşıma yönetti Yapılıyor. Transkriptinin yörünge en sol panelde gösterilmektedir. Yörünge tek bir f üzerinde kaplanırzaman serilerinin rame. Ölçek çubuğu:. 2.5 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kararlı biçimde RBMBs hücre içi doğum sonrası, 3'-UTR RBMB bağlanma yerinin 96 tandem tekrarı ile RNA eksprese eden HT1080 hücreler Film 1. Örnek film. Bireysel RNA transkript gibi parlak floresan noktalar görünür. Ölçek çubuğu:. 10 mikron videoyu görmek için buraya tıklayın.
Film 2. yönettiği taşıma geçiren bir RNA transkripti Temsilcisi film. Ölçek çubuğu:. 10 mikron videoyu görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bilinen bir geniş alan mikroskop kullanılarak canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri yeteneği, her bir RNA transkripti ve bağlanmayan flüoresan kaynaklanan düşük bir floresan arka plan ile ilişkili bir parlak ve ışığa karşı kararlı floresan sinyali gerektirmektedir. Bu yöntemde, parlak bir flüoresan sinyal, her bir RNA transkripti üzerine (96 kadar) birden fazla oligonükleotid bazlı flöresanlı sondalar örneğin, RBMBs hibritleme ile elde edilir. Bununla birlikte, sadece dört bağlanma siteleri 16 yeterlidir. Toplu sinyalleri gerçek zamanlı olarak takip edebilirsiniz parlak floresan noktada sonuçlanır. Toplam sinyal kaybedilmeden önce bilgiler sağlayan flüoresan boyaların büyük bir bölümüne photobleached gereken yana çok sondalanmn mevcudiyeti, aynı zamanda, daha uzun görüntüleme süreleri sağlar. Bu teknik, bir RNA biyolojisi özgü bilgi sağlar ve th ölçüm arasında değişen bir RNA davranışları geniş bir çalışma için izin verir öngörülmektedirhedef RNA eşsiz hücre içi lokalizasyonu desenleri gözlemleyerek çeşitli dış uyaranlara, RNA kaderini ve ömrünü eğitim ve RNA yönetmelik içgörü sağlayarak RNA ticareti e tepki. Buna ek olarak RNA ifadesi (yani yukarı ve aşağı-regülasyon) değişiklikleri izlemek mümkün olabilir. Bu yeteneği henüz doğrulanmış olmasına rağmen, biz daha önce RNA kopya sayısı oldukça doğru canlı hücrelerde 22 kadar 24 saat boyunca ölçülebilir olduğunu göstermiştir. Ayrıca, RBMBs gen ifadesinin seviyesini etkilemesi görünmüyor. Kombine olarak, bu sonuçlar, bir hücre ile hücre temelinde, hassas bir şekilde takip edildi, bu süre boyunca gen ifadesinde bir değişir ve RBMBs RNA kararlılığı bir artışa yol açabilir veya RNA bozulmasını yavaşlattı etmediğini ilk kanıt sağlar. Ancak, hiç değilse ölçüde gen ifadesi aslında bu süre içinde ne değişti açık değildir.
Genel olarak, bunungen ifadesinde herhangi bir artış kolayca tespit edilmesi beklenmektedir; yeni oluşan transkript bağlamak için ücretsiz hücrede bağlanmamış RBMB bolluğu. Ancak, ne daha az açık RBMBs çeviri ve yıkımı sırasında RNA'dan ayırmak nasıl ve RNA ifadesi / bozulması ve bu transkript görüntüleme arasında bir gecikme varsa. Ek çalışmalar hala daha bu senaryolarda RBMB performansını anlamak için gereklidir.
Tek RNA transkript görüntüleme için çeşitli alternatif yaklaşımlar daha önce rapor edilmiştir. Katılan ilk çalışmalar floresan izole RNA transkript etiketleme ve tipik mikroenjeksiyon 23,24 ile, hücre içine bu transkript yeniden tanıtan. Sinyal-arka bu yaklaşım nedeniyle herhangi bağlanmamış floresan boyalar kaldırmak için yeteneği, çok yüksek, ancak gözlenen RNA davranış doğru tru temsil edip kaygıları vardıre RNA işlenmesi. Bu eksiklik için en yaygın çözüm burada sunulan RBMB yaklaşımına benzer bir floresan muhabir tarafından bağlı olabilir 3'-UTR'de tandem tekrarlar, mühendislik transgenleri yer almıştır. Önceki floresan gazetecilere sadece yaygın Ispanak 25 ve GFP olarak adlandırılan RNA aptamers, bağlanma üzerine floresan küçük molekülleri dahil ettik. Ispanak ancak tek RNA transkriptleri görüntülenmesinde kullanılan olmamıştır, fakat resim genel ifadesi için kullanılmıştır. Bunun tersine GFP görüntü başarıyla tek RNA transkriptleri için kullanılmıştır. 3'-UTR 2,10 olarak MS2 bağlanma yeri tandem tekrarı ile inşa Bu yaklaşımda, bir GFP raportör bakteriyel faj MS2 (GFP MS2) örtü proteinine kaynaştığı ve bir mühendislik RNA bağlanır. Bu yaklaşım, burada tarif edilen yöntemlerden çok benzer olmasına rağmen, RBMBs birçok avantaj sağlar. Örneğin, daha geniş bir RBMBs div sağlayan organik flüoroforlar görüntüleme için kullanılmasına izinÜstün fotostabilite ve floresan proteinleri ile karşılaştırıldığında üstün parlaklık ile seçimler ersity. Ayrıca, yakın-kızılötesi için çok yayan Piyasada bulunan birçok organik flüoroforlar vardır. Kırmızı-kaymıştır emisyon spektrumları boyaları seçmenin yararı, bu dalga boylarında gözlenen alt hücresel otofloresansı kaynaklanıyor. Otofloresanm yüksek düzeyleri kolaylıkla RNA melezleme ile alakalı floresan sinyalleri boğulabilir yana, dramatik otoflüoresanı azaltmak için yeteneği sinyal-arka planda önemli bir destek sağlar. RBMBs kullanılmasının diğer önemli bir avantaj bağlanmamış problardan sinyalinin önemli ölçüde söndürülür olmasıdır. Çeşitli yaklaşımlar GFP seviyelerini kontrol, bağlanmamış GFP-MS2 yaklaşımla GFP, örneğin, nükleer lokalizasyon sinyalleri kullanım arka floresan azaltmak için alınmış, ve split GFP tamamlama 1,10,11,26,27, olsa gerçek bir söndürme Moie varlığıRBMB tasarım içinde ty çok daha deneysel esneklik sağlıyor. Örneğin, RBMB yaklaşım RNA ekspresyonu ve prob konsantrasyonu göreceli ve toplam seviyede hem de göreceli olarak duyarsızdır. Aslında, bireysel transkript büyüklükte bir sipariş yayılan RBMB konsantrasyonları ile görüntülü olabilir. Yüksek fotostabilite, parlak sinyal, alt ve arka kombine avantajları sınırlı uzmanlığa sahip mikroskopi kullanıcılar için çok daha erişilebilir RBMBs ile gerçek zamanlı RNA görüntüleme deneyleri yapmak.
Belki de, bu gibi bir GFP raportör molekül tersine, bu gibi bir eksojen RBMBs problar kullanılarak en önemli dezavantajı, hücre içi iletimi için ihtiyaç vardır. Neyse ki, bir dizi seçenek var, örneğin, mikroenjeksiyon 28, transfeksiyon ajanlar 29, hücre delici peptidler, 30, ve streptolizin O (SLO) 31. Kişisel olarak, biz gözeneklendirme olduğunu buldukgenellikle>% 95 canlılığı ve teslimat verimliliği 21 sonuçlanan en kullanıcı dostu ve çok yönlü bir seçenek. Mikrolitre hacimli elektroporasyon süreç ısı üretimi, metal iyonu çözünme, pH değişimi ve oksit oluşumu da dahil olmak üzere sık sık elektroporasyon ile ilişkili birçok zararlı olayların bir azalma sergiler çünkü bu muhtemeldir. RBMBs tek bir deneyde> 100,000 hücre içine taşınabilir yana önemlisi, mikrogözeneklendirme, aynı zamanda yüksek verimli çalışmalar elverişlidir.
Canlı hücrelerde görüntü RNA lokalizasyon ve hareket RBMBs kullanmanın birçok avantajı olmasına rağmen, sınırlamalar ve sorunlar bir dizi hala devam etmektedir. Belki de, büyük zorluk sürekli maruz kalma altında birkaç dakikadan fazla RNA izlemek için yetersizliğidir. Bu, ışıkla ağartma ve odak düzlemi görüntüleme dışına taşımak için RNA yeteneği hem de bir sonucudur. Daha parlak ve ışığa boyalar al yardımcı olabilirbu eksikliklerin leviate ikisi, her bir boya heyecanlı olabilir sayısını artırmak ve izin vererek ayrık floresan noktalar odak düzleminden büyük uzaklıklarda yansıması için. Foto-geliştirmek için ümit verici bir yaklaşım, ömrünü uzatmak için 32 organik florofor yakın olarak söndürme maddeleri üçlü-durumunu kullanan kendi kendini iyileştirme boyaların kullanımını kapsamaktadır. Başka bir seçenek de kendini bastırma işlemi değil bağlı florofor çok sayıda oluşan floresan yükseltme konjüge polimerlerin kullanımı olabilir. Bu polimerler birçok kez tek organik fluoroforlar daha parlak ve henüz hala verimli tek bir söndürme yarımı 33,34 ile söndürülür olabilir; Ancak, bu alanda ek iş hala ihtiyaç duyulmaktadır. O t, emin olmak zordur, çünkü uzun süreler boyunca bir görüntü için tek bir RNA transkriptini gerçekleştirilemez, saniye başına çerçeve oranı> 1 bir çerçeve ile bu aralıklı görüntüleme unutulmamalıdıro aynı RNA transkript çerçeve-to-çerçeveden izleniyor. Tabii ki, tek hücre düzeyinde gen ekspresyonunun nicelik değerlendirmesi, bir hücre bazında 16,35,36 bireysel floresan lekelerinin sayımı yoluyla uzun bir zaman dilimlerinde üzerinde hala mümkündür. Bu durumda, tek tek kopyalarının takip etmek için gerekli değildir. Genel olarak, bu RBMBs RNA işlevi içine önemli ipuçları sağlama yeteneğine sahip olduğuna inanılmaktadır ve konvansiyonel mikroskopi ekipman ve sınırlı uzmanlığa sahip tek mühendislik RNA transkript görüntüleme mümkün kılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Mark Behlke ve Dr Ling Huang, metin içinde tarif edilen bileşiklerin bazıları Benzer İkinci oligonükleotidleri sağlamadığı IDT çalışmaktadır. IDT ancak, halka açık bir şirket, ve onlar bizzat IDT / sermaye hisse sahibi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı KARİYER Ödülü (0953583) ve Sağlık NCI / R21-CA116102 Ulusal Enstitüsü NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 ml |
| Chromatography column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7 x 20 cm |
| Superdex 75 prep grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60 ml, Luer-lok tip |
| Centrifugal filter units | Millipore | UFC501096 | MW 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5 ml |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | 25 cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without phenol red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
References
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
- Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
- Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
- Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
- Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
- Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
- Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
- Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
- Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
- Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
- Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S.
- Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
- Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
- Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
- Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
- Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
- Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
- Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
- Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
- Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
