Summary
Pour les applications futures comme un patch pour réparer des déchirures partielles du ligament croisé antérieur (LCA), des cellules dérivées de LCA humain ont été isolés à partir de tissus obtenus au cours de procédures de reconstruction, d'agrandissement in vitro et cultivés sur des échafaudages de l'ingénierie tissulaire. L'adhésion cellulaire et la morphologie ont ensuite été effectuées pour confirmer la biocompatibilité sur la surface de l'échafaudage.
Abstract
Blessure à l'ACL est un problème fréquemment rencontré chez les personnes actives. Même ruptures partielles de cette intra-articulaire ligament du genou conduire à des carences biomécaniques qui nuisent à la fonction et la stabilité. Les options actuelles pour le traitement des déchirures partielles du LCA vont de non fonctionnement, la gestion prudente de plusieurs options chirurgicales, telles que: modification thermique, mono-faisceau de réparation, reconstruction complète, et la reconstruction de la partie endommagée du ligament natif. Peu d'études, le cas échéant, ont démontré une méthode unique pour la gestion soit toujours supérieure, et dans de nombreux cas, les patients continueront à démontrer l'instabilité persistante et d'autres comorbidités.
Le but de cette étude est d'identifier une source de cellules potentiel pour une utilisation dans le développement d'un patch de l'ingénierie tissulaire qui pourraient être mis en œuvre dans la réparation d'un ACL partiellement déchiré. Un protocole selon l'invention a été développé pour l'expansion des cellules dérivées de patients subissant une reconstruction du LCA. Pour isoler les cellules, les tissus HACL hachée obtenu lors de la reconstruction du LCA a été digéré dans une solution de collagénase. L'expansion a été réalisée en utilisant un milieu DMEM/F12 supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S). Les cellules ont ensuite été stockés à -80 ° C ou dans l'azote liquide dans un milieu de congélation constitué de DMSO, FBS et le moyen d'expansion. Après décongélation, les cellules HACL dérivés ont ensuite été ensemencées sur un échafaudage de l'ingénierie tissulaire, PLAGA (acide lactique-co-glycolique Poly) et le contrôle des tissus culture polystyrène (TCPS). Après 7 jours, SEM a été réalisée pour comparer l'adhésion cellulaire à la PLAGA contre l'EPTC de commande. La morphologie cellulaire a été évaluée à l'aide d'immunofluorescence. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographies démontré que les cellules ont augmenté et respectées sur les deux surfaces PLAGA et EPTC et ont été confluentes sur les surfaces entières par jour 7. Immunofluorescence a montré normale, morphologique non sollicitéal motifs sur les deux surfaces. Cette technique est prometteuse pour les applications de ACL régénération et de reconstruction.
Introduction
Le ligament croisé antérieur (LCA) est un ligament intra-articulaire souvent blessée du genou. Environ 200 000 (ACL) blessures sont signalés chaque année aux États-Unis. Plus de 75% des patients souffrant de blessures ACL opter pour la chirurgie reconstructive orthopédique 1,2,3,4. Une intervention chirurgicale est souvent indiquée en raison d'un potentiel de guérison intrinsèquement mauvaise 3. Reconstruction du LCA est généralement réalisé au moyen d'une autogreffe ou allogreffe tendon. Autogreffe et allogreffe représentent l'étalon-or pour la reconstruction car ils offrent des taux de réussite élevés, et la réparation de suture primaire, l'autre option de traitement, a montré des taux allant jusqu'à 94% 5,6,7 d'échec.
Ruptures partielles du LCA représentent 10% à 28% de toutes les ruptures du LCA 8. Dans une étude prospective, Noyes et al. Estime que 50% des patients atteints de ruptures partielles affectant plus de la moitié de la LCA a progressé à compléter ACL insuffisance après non-traitement chirurgical 9. D'autres études font état d'instabilité persistante et la fonction ont diminué de moins de 30% des patients capables de retourner dans leur pré-blessure niveau d'activité 9,10,11,12,13. Les options de traitement sont limitées et comprennent modalités conservatrices, retrait thermique de rester ACL, ou une reconstruction du LCA. Récemment, il ya eu un intérêt accru dans la réparation primaire augmentée. Ces techniques utilisent des produits biologiques pour améliorer la réparation de suture primaire 14. Des recherches récentes ont tenté de récolter mésenchymateuses comme HACL dérivée de cellules souches de contourner les limites de greffe, 31,32, mais la validité et l'efficacité de ces cellules est encore inconnue. La source des cellules idéales pour des applications d'ingénierie tissulaire semble être non mesechymal HACL dérivé des cellules de fibroblastes.
La recherche actuelle se concentre sur l'identification d'un matériau de matrice approprié et la source de la cellule de l'échafaudage d'ingénierie. C'est la procédure standard pour une rupture du LCA à être jetés comme sudéchets rgical cours de la chirurgie de reconstruction, cependant, ce ligament endommagé peut être une source de qualité pour l'acquisition de cellules nécessaires pour développer et renforcer un tissu idéal conçu remplacement ACL. Notre laboratoire a mis au point un protocole pour l'expansion in vitro de ces cellules dérivées de HACL récoltés. Utilisation d'une matrice 2D conçu infusé avec des cellules HACL dérivés, nous avons conçu un patch qui pourrait augmenter partielle réparation du LCA et de renforcer les ligaments déchirés.
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Protocol
1. Prélèvement chirurgical
Remarque: Une approbation de l'IRB a été obtenu pour recueillir le moignon du LCA lors de la chirurgie de reconstruction du LCA. Exonération de la CISR a été donné comme le moignon du LCA utilisés étaient généralement jeté comme un déchet opératoire. 20 patients ont été utilisés pour recueillir le moignon du LCA.
- Administrer une anesthésie générale et des antibiotiques préopératoires selon le protocole de l'établissement pour le patient.
- Mettez le garrot et gonfler 100 mg dessus la pression artérielle systolique.
- Situer le patient en décubitus dorsal. Faire une incision antéro-latérale horizontale avec le genou en 30-45 ° de flexion pour un portail de 5 mm et insérer le trocart arthroscopique et appareil photo dans la poche suprapatellaire à 30 °.
- Effectuez une arthroscopie diagnostique de routine.
- Entrez un cran et débrider la synoviale membraneuse sur la rupture du LCA.
- Utilisez un rasoir de 4,5 mm et ablateur pour identifier la souche d'ACL.
- Utilisez un bec de canard droite amer pour recueillir spé multiplecimens de l'ACL moignon restant.
- Maintenir l'échantillon dans une solution saline normale dans un contenant stérile.
- Envoyer les échantillons de pathologie pour le décodage et la livraison finale à l'installation de laboratoire.
- Récupérer des patients et effectuer les soins post-opératoires selon le protocole de l'établissement.
2. Digestion du tissu et HACL Isolation
- Transférer le tissu de LCA humain reçue de la pathologie à une boîte de Pétri avec une solution saline stérile / PBS (solution saline tamponnée au phosphate).
- Émincer le tissu à l'aide de ciseaux stériles dans 1-2 mm 3 pièces et laver le tissu haché avec une solution saline au moins 3 fois.
- Digérer le tissu haché avec 0,4% de collagénase en DMEM/F-12 (50/50, 1x) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine pour 4-6 heures à 37 ° C.
- Centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min, puis remettre en suspension les cellules dans le milieu.
- Laver les cellules avec le milieu de 2 à 3 fois, puis sEED / culture en flacons T-25 pour 2-3 jours.
3. Expansion cellulaire, de congélation et de décongélation
- Utiliser un microscope optique pour visualiser les cellules cultivées pendant 2-3 jours dans un flacon T-25.
- Maintenir les cellules à 37 ° C dans du DMEM/F-12 (50/50, 1x) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S).
Note: Changer les médias lorsque les cellules montrent le respect et la morphologie standard. Utiliser un microscope optique pour observer les cellules. - Laver les cellules confluentes avec du PBS au jour 7 (~ 1,3 x 10 6 cellules / flacon). Ajouter la trypsine (0,5 g / L) et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter des médias sur les cellules en suspension pour neutraliser la trypsine. Répartir le mélange médias cellule entre trois flacons T-25.
- Laver les cellules confluentes avec du PBS, ajouter de la trypsine (0,5 g / L), et de les remettre en suspension dans un milieu de congélation contenant le DMSO, le FBS et le milieu complet (DMEM/F-12 Medium + 10% FBS + 1% P / S) dans l' rapport 01:02:07.
- Magasinles flacons cryogéniques à -80 ° C si les cellules seront utilisés dans un mois, et dans l'azote liquide si les cellules seront conservées pendant des durées plus longues.
- Décongeler les flacons dans un bain d'eau à 37 ° pour la réutilisation.
Remarque: Généralement 90-95% de cellules survivent.
4. Fabrication de l'ingénierie tissulaire 2-D Poly lactique-co-acide glycolique (PLAGA) Échafaudages
- Dissoudre 1 g de PLAGA dans 12 ml de dichlorométhane dans un flacon à scintillation de 20 ml et le vortex de la solution pendant 8 heures à une vitesse constante (800 rpm).
Remarque: Description détaillée dans Gupta et al 15. - Transférer la solution dissoute dans un plat en verre de Pétri tapissée de papier de protection fluoré.
- Placez la boîte de Pétri sous une hotte d'aspiration pour 30 min. Laisser la boîte de Pétri à -20 ° C pendant une nuit, puis à température ambiante. Placer les boîtes de Pétri dans lyophilisateur pour assurer l'évaporation complète du solvant pour obtenir des films minces de polymère.
- Placez le fi polymèrelms dans un dessiccateur pendant 24 heures.
- Couper les films de polymère en 12 mm de diamètre disques circulaires et les stocker dans un dessiccateur jusqu'à ce que nécessaire.
5. Microscopie électronique à balayage (MEB)
- Laver les cellules (50 000 cellules / disque) ensemencées sur l'EPTC de contrôle et l'échafaud de PLAGA avec du PBS 7 jours après l'ensemencement.
- Utilisez 1,5% glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate 0,1 M pour fixer les cellules et de 2,5% OSO4 dans 0,1 M de tampon cacodylate de post-fixation.
- Laver les cellules fixées avec du tampon cacodylate 0,1 M. Sécher les cellules fixées à l'aide de la déshydratation de série de l'éthanol (50%, 70%, 80%, 90% et 100%) pendant 15 minutes chacun, et en outre à sec hexaméthyldisilazane (HMDS) pendant une nuit.
- Purger la chambre de SEM système de revêtement par pulvérisation avec soupape de bouton et soulever la plaque supérieure.
- Placer les échantillons séchés dans la chambre. Abaissez la plaque supérieure.
- Mettez le bouton de commande de la pompe de commencer à évacuer la chambre.
- Ouvrir la vanne de fuite de l'argon. Attendezpour le vide pour tomber à 0,05 mbar.
- Enduire les échantillons séchés avec une couche mince (0,13 nm) d'or / palladium.
- Retourner la soupape de fuite d'argon à sa position fermée.
- Mettez le bouton de réglage sur off.
- Purger la chambre de soupape de bouton et soulever la plaque supérieure.
- Retirer les échantillons et les stocker dans un dessiccateur pendant 24 heures.
- Observer les échantillons au microscope électronique à balayage.
6. Immunofluorescence
- Laver les cellules (50 000 cellules / disque) ensemencées sur l'EPTC de contrôle et l'échafaud de PLAGA avec du PBS 7 jours après l'ensemencement.
- Fixer les cellules en utilisant 70% d'éthanol (à froid) pendant 10 min.
- Incuber les cellules fixées à la température ambiante avec 1% de sérum-albumine bovine (BSA) dans du PBS avec 0,05% de Triton X-100 pendant 20 min.
- Immerger les échantillons dans 1% de Tween à température ambiante pendant 20 min.
- Ajouter anticorps anti-β-actine monoclonal de souris (1:400) et incuber les cellules overnight à 4 ° C.
- Laver les cellules avec 0,05% de Tween. Ajouter l'anticorps secondaire (chèvre anti-souris F (ab ') 2 d'IgG conjugué fragment avec une sonde de fluorescence, 1:400) aux cellules et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver les cellules avec du PBS. Colorer les cellules de colorant nucléaire et monter en utilisant 80% de glycérol.
- Respecter les cellules sous un microscope confocal.
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Representative Results
Le modèle de travail pour prélèvement chirurgical, la digestion du tissu et de l'isolement de la personne humaine Ligament croisé antérieur (HACL) des cellules dérivées est illustrée à la figure 1. Les cellules ayant migré à partir des explants et adhéré aux flacons T-25. Ces cellules ont été cultivées pendant 3 jours, puis ont été visualisées sous un microscope optique (figure 2). Une monocouche confluente a été obtenu par jour 7. La présence de cellules saines et viables a indiqué la récupération réussie et la culture de cellules dérivées HACL.
L'attachement cellulaire à la surface de PLAGA et EPTC a été déterminée qualitativement par SEM. Figure 3 présente l'adhésion et la prolifération des cellules dérivées HACL sur chaque surface du polymère. Confluence cellulaire a été observée pour PLAGA et EPTC.
La morphologie cellulaire et l'analyse de l'adhérence a été déterminée par immunofluorescence. coloration β-actine a démontré que les cellules adhèrent dérivés HACLd pour et proliféré sur la surface des deux PLAGA et EPTC. Figure 4 présente l'adhésion polymère et atténue l'apparence normale non contrainte des cellules HACL.
Figure 1. Une représentation schématique des étapes impliquées dans le prélèvement chirurgical, la digestion du tissu et de l'isolement des cellules de blessés ligament croisé antérieur (LCA) pour des applications de génie tissulaire. Cours de la chirurgie de reconstruction du LCA, le reste (déchets opératoires) ACL souche est collectée et stockée dans une solution saline. Le moignon ACL recueillies est hachée en 1-2 mm 3 pièces et lavé avec une solution saline. L'ACL hachée est digéré avec une solution de collagénase à 0,4% dans du milieu DMEM/F-12. Les cellules sont ensuite centrifugées, remises en suspension et cultivées dans desMoyen DMEM/F-12 à 37 ° C.
Figure 2 cellules. Humaine Ligament croisé antérieur dérivés capturées à l'aide d'un microscope optique (à 10X et 20X zoom). L'axe ou des cellules de forme allongée ont été vus de plus en plus sur la surface de flacons T-25 après 3 jours de culture.
Figure 3. Micrographies MEB de cellules humaines du ligament croisé antérieur dérivés cultivées sur EPTC de contrôle et PLAGA (à 100X, 300X et 1000 X grossissement). Les cellules adhérentes, ont grandi et ont été confluentes sur toute la surface de la PLAGA et ee contrôler EPTC.
Figure 4. Coloration images d'immunofluorescence capturées à l'aide d'un microscope confocal (à 10X 3.1 zoom). Cellules dérivées humain ligament croisé antérieur ont été colorées avec β-actine (vert) et nucléaire (bleu) colorant. Les cellules adhérentes, ont grandi et ont montré, une morphologie non souligné normale à la fois expérimental (PLAGA) et de contrôle (EPTC) les surfaces.
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Discussion
L'objectif principal de cette étude d'échafaudage hACL/2D était d'utiliser les cellules obtenues dans un patch pour augmenter la réparation primaire de larmes partielles du LCA. Traitement non chirurgical des ruptures du LCA partielles peut inclure une courte période d'immobilisation, des renforts, un programme de réhabilitation progressive et régulière des évaluations de suivi 13,16,17. Cependant, de nombreuses études montrent que le traitement conservateur chez les athlètes a été associé à de mauvais résultats et l'échec. Buckley et al. Évalué 25 patients avec des larmes partielles du LCA à intermédiaire suivi et constaté que seulement 44% des patients repris le sport à leur niveau d'avant la lésion, et 72% ont signalé des symptômes liés à l'activité 8. Bak et al. Suivie de 56 patients avec isolées larmes partielles du LCA pour une moyenne de 5,3 ans et seulement 30% des patients repris ses activités avant l'accident 10. Fritschy et al. Ont constaté que 18 des 43 patients avec des larmes partielles du LCA progressé de rupture complète par 5 ans de suivi11. Ces études démontrent un besoin de techniques innovantes pour traiter et réparer partielle rupture du LCA.
Le but de cette étude était de développer un protocole qui a démontré une nouvelle technique dans laquelle ACL humain (HACL) cellules ont été récoltées, respect culture et exposé à un échafaudage d'ingénierie. Cette technique est une manière reproductible et fiable pour fournir une source de cellules potentiel pour un large éventail d'enquêtes futures pour la reconstruction du LCA. Unique aux études antérieures 31,32, les cellules HACL dérivés ont été obtenus à partir de déchets opératoires et représentent non mésenchymateuses HACL dérivé des cellules de fibroblastes.
Dans cette étude, des cellules dérivées HACL non mésenchymateuses ont été isolés à partir de tissus obtenus lors de procédures de reconstruction, d'agrandissement et cultivés in vitro sur des échafaudages de l'ingénierie tissulaire. L'adhésion cellulaire et la morphologie ont ensuite été effectuées pour confirmer la biocompatibilité sur la surface de l'échafaudage. Les études futures doivent offrir davantage de quaAnalyse de prolifération ntitative, comme la réaction en temps réel de la polymérase en chaîne (PCR) et la cellule activé par fluorescence (FACS), pour caractériser les cellules isolées. De plus, l'analyse quantitative de la prolifération devrait être utilisé afin de déterminer quelle classe de biomatériaux les cellules isolées HACL poussent mieux sur.
L'absence d'une analyse quantitative de ces cellules HACL est une limitation importante de cette étude. Cependant, il s'agit d'une étude préliminaire et l'objectif de cette étude était de seulement isoler et d'élargir les cellules HACL dérivés. Les études futures comprendront des études de la prolifération cellulaire et la caractérisation de ces cellules en utilisant PCR en temps réel et FACS. Une autre limite de cette étude est que la quantité de temps nécessaire pour cultiver les cellules et de les incorporer dans la pièce, il faudrait au patient de subir deux interventions chirurgicales. En outre, la capacité de ces cellules de LCA humaines dérivées de survivre dans le liquide synovial n'a pas été établie. Les études futuresdoit évaluer la capacité de proliférer à HACL sur une construction d'ingénierie tissulaire en présence du liquide synovial.
Ce protocole permettra à la réparation d'un ACL partiellement déchiré par des moyens de suture et 2D échafaud. Ce protocole offre un système de livraison pour les fibroblastes HACL vers le site de la plaie et protège les cellules à partir du fluide synovial simultanément. Cela pourrait permettre la réparation et la guérison fonctionnelle d'une déchirure partielle de la LCA, en évitant les comorbidités associées à la reconstruction du LCA. Cette technique montre des résultats prometteurs et future enquête affichera le potentiel de cette technique pour la réparation et la reconstruction du LCA.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le démarrage fonds et département de chirurgie subvention de l'Université Southern Illinois, École de médecine de la recherche; et la subvention de la Fondation Memorial médicale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | Store at 4 °C |
| DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082 | Store at -80 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | Store at 4 °C |
| Centrifuge Tubes- 15 ml | Corning | 430790 | |
| T-25 flasks | BD Falcon | 3013 | |
| Trypsin-Versene mixture | Lonza | 17-161E | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation. |
| Cryogenic vials | Corning | 430489 | |
| PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | Store at -80 °C |
| TCPS disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC36423-0010 | Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place. |
| Bytac paper | Saint gobin performance plastics | 1420652 | |
| Scintillation vial | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Store at 4 °C |
| Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| mouse Anti-β-actin antibody (1° Ab) | Sigma Aldrich | A5441 | Store at -20 °C |
| goat-anti-mouse antibody (2° Ab) | Cell Signaling | 4408 | Store at -20 °C |
| Hoechst dye | Sigma Aldrich | 14530 | Store at -20 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | BP2547-1 | Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes. |
| Hexamethyldisilazane | Fisher Scientific | AC43085-1000 | Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes. |
| Sterile Scissors | McKesson | 25-716 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Light Microscope | Olympus | CK40 | |
| Water Bath | Thermo scientific | 2845 | |
| Vortex | Labnet | VX-200 | |
| Glass Petri plates | fisher Scientific | S31473 | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch was used to cut 12 mm disks |
| Cacodylate buffer | Sigma Aldrich | 97068 | Flammable liquid, carcinogen and irritant. |
| Osmium tetraoxide | Sigma Aldrich | 201030 | Highly toxic |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Harmful if swallowed |
| Ethanol | Decon Labs | 2705 | Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition. |
| General/regional Anesthesia | Amphastar pharmaceuticals | 1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance | |
| Antibiotics | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1 g i.v. |
| Arthroscopy trocar | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopy Camera | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopic grasper and bitter | Arthrex | ||
| 4.5 mm shaver | Arthrex | ||
| Interference Screws | Arthrex | stainless steel screws | |
| Sputter Coater | Polaron | E5400 |
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