Summary
Per le future applicazioni come una patch per riparare rotture parziali del legamento crociato anteriore (LCA), le cellule derivate ACL umane sono state isolate da tessuti ottenuti durante le procedure ricostruttive, espanse in vitro e coltivati in ingegneria tessutale ponteggi. Adesione cellulare e la morfologia è stata poi eseguita per confermare biocompatibilità sulla superficie patibolo.
Abstract
Lesioni al LCA è un problema comunemente riscontrato nei soggetti attivi. Anche le lacrime parziali di questa intra-articolare del legamento del ginocchio portare a carenze biomeccanici che compromettono la funzione e la stabilità. Le opzioni correnti per il trattamento delle lacrime ACL parziali vanno da incruento, gestione conservativa a molteplici opzioni chirurgiche, come ad esempio: modifica termica, riparazione singolo fascio, ricostruzione completa, e la ricostruzione della parte danneggiata del legamento nativo. Pochi studi, se del caso, hanno dimostrato un metodo unico per la gestione sia costantemente superiore, e in molti casi i pazienti continuano a dimostrare persistente instabilità e di altre comorbidità.
L'obiettivo di questo studio è quello di individuare una fonte cellulare potrebbe ricorrere allo sviluppo di una patch tessutale che potrebbe essere implementata nella riparazione di un ACL parzialmente strappata. Un nuovo protocollo è stato sviluppato per l'espansione di cellule derivate da patienti sottoposti a ricostruzione del LCA. Per isolare le cellule, tessuti HACL macinate ottenute durante la ricostruzione del LCA è stato digerito in una soluzione di collagenasi. Espansione è stata effettuata utilizzando mezzo DMEM/F12 supplementato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S). Le cellule sono state poi conservati a -80 ° C o in azoto liquido in un mezzo costituito da congelamento DMSO, FBS e il mezzo di espansione. Dopo lo scongelamento, le cellule derivate HACL sono state poi seminate su un ponteggio ingegneria tessutale, plaga (acido lattico-co-glicolico Poly) e il controllo del tessuto della cultura polistirene (TCPS). Dopo 7 giorni, SEM è stata eseguita per confrontare adesione cellulare alla plaga contro il TCPS controllo. Morfologia cellulare è stata valutata mediante immunofluorescenza. SEM (Scanning Electron Microscope) microscopio hanno dimostrato che le cellule crescevano e rispettati su entrambe le superfici plaga e TCP ed erano confluenti su tutta la superficie di giorno 7. Immunofluorescenza mostrava normale, morfologiche non-ha sottolineatoAL modelli su entrambe le superfici. Questa tecnica è promettente per applicazioni nella rigenerazione e ricostruzione del LCA.
Introduction
Il legamento crociato anteriore (LCA) è un legamento intra-articolare comunemente feriti del ginocchio. Circa 200.000 (ACL) lesioni sono segnalati ogni anno negli Stati Uniti. Oltre il 75% dei pazienti con lesioni ACL optare per la chirurgia ricostruttiva ortopedica 1,2,3,4. L'intervento chirurgico è spesso indicato a causa di un potenziale di guarigione per sé mediocre 3. Ricostruzione del LCA in genere viene eseguita per mezzo di un innesto di osso autologo o allogenico tendine. Autologo e allogenico rappresentano il gold standard per la ricostruzione come si vantano tassi di successo elevati, e la riparazione sutura primaria, l'altra opzione di trattamento, ha mostrato tassi di fallimento fino al 94% 5,6,7.
Rotture parziali della ACL rappresentano il 10% al 28% di tutte le lacrime ACL 8. In uno studio prospettico, Noyes et al. Stima che il 50% dei pazienti con rotture parziali che interessano più della metà del LCA progredito per completare ACL insufficienza dopo la non-trattamento chirurgico 9. Altri studi riportano persistente instabilità e la funzione diminuiti con meno del 30% dei pazienti in grado di tornare alle loro pre-infortunio livello di attività 9,10,11,12,13. Le opzioni di trattamento sono limitate e comprendono le modalità conservative, ritiro termico di rimanere ACL, o ricostruzione del LCA. Recentemente, c'è stato un crescente interesse per la riparazione primaria aumentata. Queste tecniche utilizzano farmaci biologici per migliorare la riparazione di sutura primaria 14. Recenti ricerche hanno tentato di raccogliere mesenchimali come HACL derivato cellule staminali per aggirare le limitazioni innesto, 31,32 ma la validità e l'efficacia di queste cellule è ancora sconosciuta. La fonte cellulare ideale per applicazioni di ingegneria tissutale sembra essere non mesechymal HACL derivato cellule di fibroblasti.
La ricerca attuale si concentra sull'identificazione un materiale di matrice adatto e fonte di cellule per il scaffold ingegnerizzati. Si tratta di una procedura standard per un ACL strappato da scartare come surifiuti rgical durante l'intervento chirurgico di ricostruzione, tuttavia, questo legamento danneggiato può essere una fonte di qualità per l'acquisizione di cellule necessarie per sviluppare e valorizzare un tessuto ideale ingegnerizzato sostituzione ACL. Il nostro laboratorio ha sviluppato un protocollo per l'espansione in vitro di queste cellule derivate HACL raccolte. Utilizzando una matrice 2D di ingegneria infuso con celle HACL derivate, abbiamo progettato una patch che potrebbe potenzialmente aumentare la riparazione ACL parziale e rafforzare legamenti strappati.
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Protocol
1. Recupero chirurgico
Nota: L'approvazione IRB è stata ottenuta per raccogliere il moncone del LCA durante l'intervento chirurgico di ricostruzione del LCA. Esenzione IRB è stato dato come il moncone ACL utilizzato erano generalmente scartati come rifiuti chirurgico. 20 pazienti sono stati usati per raccogliere il moncone ACL.
- Somministrare anestesia generale e antibiotici pre-operatorie come da protocollo dell'ente per il paziente.
- Applicare il laccio emostatico e gonfiare 100 mg di sopra della pressione arteriosa sistolica.
- Collocare il paziente in posizione supina. Effettuare una incisione antero-laterale orizzontale con il ginocchio in 30-45 ° di flessione per un portale 5 mm e inserire il trocar artroscopica e la macchina fotografica nella borsa sovrarotuleo a 30 °.
- Eseguire una artroscopia diagnostica di routine.
- Inserisci una tacca e debride sinovia membranosa sul strappato ACL.
- Utilizzare un rasoio 4,5 millimetri e ablator per identificare il ceppo ACL.
- Utilizzare un ornitorinco dritto amaro per raccogliere spe multiplacimens dei restanti ceppo ACL.
- Mantenere il campione in soluzione salina in un contenitore sterile.
- Inviare i campioni alla patologia per la decodifica e la consegna finale alla struttura di laboratorio.
- Recuperare paziente ed eseguire cure post-operatorie come da protocollo dell'ente.
2. Digestione tessuti e isolamento HACL
- Trasferire il tessuto umano ACL ricevuto da patologia a una piastra di Petri con soluzione salina sterile / PBS (tampone fosfato salino).
- Tritare il tessuto con le forbici sterili in 1-2 mm 3 pezzi e lavare il tessuto tritato con soluzione fisiologica almeno 3 volte.
- Digerire il tessuto tritato con 0,4% collagenasi in DMEM/F-12 (50/50, 1x) medium supplementato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina per 4-6 ore a 37 ° C.
- Centrifugare le cellule a 1000 xg per 5 minuti e poi risospendere le cellule in medium.
- Lavare le cellule con il mezzo per 2-3 volte e poi seed / cultura in T-25 palloni per 2-3 giorni.
3. Espansione cellulare, congelamento e di scongelamento
- Utilizzare un microscopio ottico per visualizzare le cellule in coltura per 2-3 giorni in un pallone T-25.
- Mantenere le cellule a 37 ° C in DMEM/F-12 (50/50, 1x) medie supplementato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S).
Nota: Cambiare i media quando le cellule mostrano l'aderenza e la morfologia standard. Utilizzare un microscopio ottico per osservare le cellule. - Lavare le cellule confluenti con PBS al giorno 7 (~ 1,3 x 10 6 cellule / boccetta). Aggiungere tripsina (0,5 g / L) e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min. Aggiungere supporti per cellule sospese per neutralizzare la tripsina. Dividere il composto media-cellulare tra tre T-25 palloni.
- Lavare le cellule confluenti con PBS, aggiungere tripsina (0,5 g / L), e risospendere in congelamento terreno contenente DMSO, FBS e il mezzo completo (DMEM/F-12 Piano + 10% FBS + 1% P / S) nella rapporto 01:02:07.
- Negoziole fiale criogeniche a -80 ° C se verranno utilizzati le cellule entro un mese, e in azoto liquido se saranno conservati cellule per periodi più lunghi.
- Scongelare le provette in un bagno d'acqua a 37 ° per il riutilizzo.
Nota: in genere le cellule 90-95% sopravvivono.
4. Fabbricazione di Tissue Engineered 2-D Poly lattico-co-glicolico acido (plaga) Scaffold
- Sciogliere 1 g di plaga in 12 ml di diclorometano in 20 ml di scintillazione flaconcino e agitare la soluzione per 8 ore a velocità costante (800 rpm).
Nota: Descrizione dettagliata in Gupta et al 15. - Trasferire la soluzione disciolta in un piatto di vetro Petri foderata con carta di protezione fluorurato.
- Porre la capsula Petri sotto una cappa di aspirazione per 30 min. Lasciare la piastra di Petri a -20 ° C per una notte e poi a temperatura ambiente. Porre le capsule di Petri in liofilizzatore per garantire la completa evaporazione del solvente per ottenere film sottili di polimero.
- Posizionare il fi polimeroLMS in un essiccatore per 24 ore.
- Tagliare le pellicole polimeriche in 12 mm di diametro dischi circolari e memorizzarli in un essiccatore fino a quando necessario.
5. Scanning Electron Microscopy (SEM)
- Lavare le cellule (50.000 cellule / disk) seminati sul TCPS controllo e il scaffold plaga con PBS 7 giorni successivi semina.
- Utilizzare 1,5% glutaraldeide in tampone 0,1 M cacodilato per fissare le cellule e il 2,5% OsO 4 in 0.1 M tampone cacodilato per la post-fissazione.
- Lavare le cellule fissate con 0.1 M tampone cacodilato. Essiccare le cellule fissate mediante disidratazione seriale etanolo (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) per 15 minuti ciascuno, e in seguito secco in Esametildisilazane (HMDS) durante la notte.
- Ventilare la camera di SEM sistema di rivestimento a polverizzazione con valvola a pulsante e sollevare la piastra superiore.
- Posizionare i campioni essiccati in camera. Abbassare la piastra superiore.
- Accendere la manopola di controllo per pompare per iniziare l'evacuazione della camera.
- Valvola di fuga aperta argon. Aspettiper il vuoto scenda a 0,05 mbar.
- Cappotto campioni essiccati con uno strato sottile (0,13 nm) di oro / palladio.
- Riportare la valvola perdita argon alla sua posizione chiusa.
- Accendere la manopola off.
- Ventilare la camera con valvola tasto e sollevare la piastra superiore.
- Rimuovere i campioni e conservarli in un essiccatore per 24 ore.
- Osservare i campioni al microscopio elettronico a scansione.
6. Immunofluorescenza
- Lavare le cellule (50.000 cellule / disk) seminati sul TCPS controllo e il scaffold plaga con PBS 7 giorni successivi semina.
- Fissare le cellule con 70% di etanolo (freddo) per 10 min.
- Incubare le cellule fissate a temperatura ambiente con 1% di sieroalbumina bovina (BSA) in PBS con 0,05% Triton X-100 per 20 min.
- Immergere i campioni in 1% Tween a temperatura ambiente per 20 min.
- Aggiungi monoclonale anti-β-actina anticorpi (1:400) e incubare le cellule overnight a 4 ° C.
- Lavare le cellule con il 0,05% di Tween. Aggiungere anticorpo secondario (capra anti-topo F (ab ') 2 frammento di IgG coniugato con una sonda a fluorescenza, 1:400) alle cellule e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule con PBS. Colorare le cellule con colorazione nucleare e montare con l'80% di glicerina.
- Osservare le cellule al microscopio confocale.
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Representative Results
Il modello di lavoro per il recupero chirurgico, la digestione del tessuto e l'isolamento della persona umana legamento crociato anteriore (HACL) cellule derivate è mostrato in Figura 1. Le cellule migrate dai espianti e aderito alle T-25 palloni. Queste cellule sono state coltivate per 3 giorni e poi sono stati visualizzati sotto un microscopio ottico (Figura 2). Un monostrato confluente stato ottenuto giorno 7. La presenza di cellule vitali, sani ha indicato l'operazione riuscita e coltura di cellule derivate HACL.
Attaccamento cellulare alla superficie di plaga e TCPS stata determinata qualitativamente mediante SEM. Figura 3 presenta adesione e proliferazione delle cellule derivate HACL su ogni superficie del polimero. Confluenza cellulare è stata osservata per la plaga e TCPS.
Morfologia cellulare e analisi adesione è stata determinata mediante immunofluorescenza. colorazione β-actina dimostrato che le cellule derivate HACL aderisconod ae proliferato sulla superficie sia plaga e TCPS. Figura 4 presenta aderenza polimerica e extenuates normale, aspetto non sottolineato delle cellule HACL.
Figura 1. Una rappresentazione schematica delle fasi coinvolte nel recupero chirurgico, la digestione del tessuto e l'isolamento di cellule da feriti Legamento crociato anteriore (LCA) per applicazioni di ingegneria tissutale. Durante l'intervento chirurgico di ricostruzione del LCA, il restante (rifiuti chirurgica) ceppo ACL viene raccolto e memorizzato in soluzione salina. Il moncone ACL raccolto viene tritata in 1-2 mm 3 pezzi e lavato con soluzione salina. L'ACL macinata viene digerito con soluzione di collagenasi 0,4% in DMEM/F-12 mezzo. Le cellule vengono quindi centrifugate, risospese e coltivate inMedio DMEM/F-12 a 37 ° C.
Cellule Figura 2. Umano legamento crociato anteriore derivati acquisiti utilizzando un microscopio ottico (a 10X e 20X zoom). Il mandrino o cellule di forma allungata sono stati visti crescere sulla superficie del T-25 palloni dopo 3 giorni di coltura.
Figura 3. Micrografie SEM legamento crociato anteriore cellule derivate umane coltivate su TCPS controllo e plaga (a 100X, 300X e 1000 ingrandimenti). Le cellule aderito, cresciuti e sono stati confluenti su tutta la superficie della plaga e THe controllare TCPS.
Immagini colorazione Figura 4. Immunofluorescenza catturate utilizzando un microscopio confocale (a 10X 3.1 zoom). Cellule derivate umano legamento crociato anteriore sono state colorate con β-actina (verde) e nucleare (blu) colorante. Le cellule aderito, sono cresciuti e hanno mostrato una normale morfologia non-ha sottolineato sia sperimentale (plaga) e controllo (TCPS) le superfici.
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Discussion
L'obiettivo primario di questo studio impalcatura hACL/2D stato quello di utilizzare le cellule ottenute in una patch per aumentare la riparazione primaria di lacrime ACL parziali. Gestione incruento di lacrime ACL parziali possono includere un breve periodo di immobilizzazione, tonificante, un programma di riabilitazione progressiva e regolari valutazioni di follow-up 13,16,17. Tuttavia, molti studi dimostrano che il trattamento conservativo negli atleti è stata associata con scarsi risultati e fallimento. Buckley et al. Ha valutato 25 pazienti con parziali lacrime ACL a follow-up intermedio e ha scoperto che solo il 44% dei pazienti ha ripreso sport al loro livello pre-infortunio, e il 72% ha riferito sintomi di attività correlate 8. Bak et al. Ha seguito 56 pazienti con isolate rotture parziali ACL per una media di 5,3 anni e solo il 30% dei pazienti ha ripreso le attività di pre-infortunio 10. Fritschy et al. Hanno trovato che 18 di 43 pazienti con lesioni del LCA parziali progredito per completare la rottura da 5 anni di follow-up11. Questi studi dimostrano la necessità di tecniche innovative per curare e riparare parziale ACL lacrima.
L'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un protocollo che ha dimostrato una nuova tecnica in cui sono state raccolte ACL umano (HACL), le cellule, aderenza coltivate ed esposte ad un ponteggio costruito. Questa tecnica è un modo riproducibile e affidabile per fornire una fonte potenziale cella per una vasta gamma di indagini future per la ricostruzione del LCA. Unico a studi precedenti 31,32, le cellule derivate HACL sono state ottenute da scarti chirurgici e rappresentano non mesenchimali HACL derivato cellule di fibroblasti.
In questo studio, le cellule derivate HACL non mesenchimali sono state isolate da tessuti ottenuti durante le procedure ricostruttive, espanse in vitro e coltivate su ingegneria tessutale ponteggi. Adesione cellulare e la morfologia è stata poi eseguita per confermare biocompatibilità sulla superficie patibolo. Studi futuri devono offrire ulteriore quaanalisi proliferazione ntitative, come tempo reale reazione polimerasica a catena (PCR) e cella fluorescenza-attivato (FACS), per caratterizzare le cellule isolate. Inoltre, l'analisi quantitativa proliferazione deve essere utilizzato per determinare quale classe di biomateriali isolate cellule HACL crescono meglio su.
La mancanza di una analisi quantitativa di queste cellule HACL è una limitazione importante di questo studio. Tuttavia, questo è uno studio preliminare e l'obiettivo di questo studio era solo di isolare ed espandere cellule HACL derivate. Studi futuri riguarderanno studi di proliferazione cellulare e la caratterizzazione di queste cellule utilizzando real time PCR e FACS. Un altro limite di questo studio è che la quantità di tempo necessario per coltivare le cellule e inserirli in patch richiederebbe il paziente a sottoporsi due procedure chirurgiche. Inoltre, non è stata stabilita la capacità di queste cellule ACL derivazione umana di sopravvivere nel liquido sinoviale. Studi futurideve valutare la capacità di HACL di proliferare in un costrutto di ingegneria tessutale in presenza di fluido sinoviale.
Questo protocollo permetterà per la riparazione di un ACL parzialmente strappata mediante sutura e scaffold 2D. Questo protocollo offre un sistema di erogazione per HACL fibroblasti al sito della ferita e contemporaneamente protegge le cellule dal fluido sinoviale. Questo potrebbe consentire di riparazione funzionale e la guarigione di una lacerazione parziale del LCA, evitando le comorbidità associate a ricostruzione del LCA. Questa tecnica mostra risultati promettenti e di indagine futuro mostrerà le potenzialità di questa tecnica per la riparazione e la ricostruzione del LCA.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare l'avvio del fondo e il reparto di chirurgia assegno di ricerca presso la Southern Illinois University, School of Medicine; e la concessione Memorial Medical Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | Store at 4 °C |
| DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082 | Store at -80 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | Store at 4 °C |
| Centrifuge Tubes- 15 ml | Corning | 430790 | |
| T-25 flasks | BD Falcon | 3013 | |
| Trypsin-Versene mixture | Lonza | 17-161E | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation. |
| Cryogenic vials | Corning | 430489 | |
| PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | Store at -80 °C |
| TCPS disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC36423-0010 | Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place. |
| Bytac paper | Saint gobin performance plastics | 1420652 | |
| Scintillation vial | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Store at 4 °C |
| Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| mouse Anti-β-actin antibody (1° Ab) | Sigma Aldrich | A5441 | Store at -20 °C |
| goat-anti-mouse antibody (2° Ab) | Cell Signaling | 4408 | Store at -20 °C |
| Hoechst dye | Sigma Aldrich | 14530 | Store at -20 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | BP2547-1 | Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes. |
| Hexamethyldisilazane | Fisher Scientific | AC43085-1000 | Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes. |
| Sterile Scissors | McKesson | 25-716 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Light Microscope | Olympus | CK40 | |
| Water Bath | Thermo scientific | 2845 | |
| Vortex | Labnet | VX-200 | |
| Glass Petri plates | fisher Scientific | S31473 | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch was used to cut 12 mm disks |
| Cacodylate buffer | Sigma Aldrich | 97068 | Flammable liquid, carcinogen and irritant. |
| Osmium tetraoxide | Sigma Aldrich | 201030 | Highly toxic |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Harmful if swallowed |
| Ethanol | Decon Labs | 2705 | Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition. |
| General/regional Anesthesia | Amphastar pharmaceuticals | 1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance | |
| Antibiotics | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1 g i.v. |
| Arthroscopy trocar | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopy Camera | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopic grasper and bitter | Arthrex | ||
| 4.5 mm shaver | Arthrex | ||
| Interference Screws | Arthrex | stainless steel screws | |
| Sputter Coater | Polaron | E5400 |
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