Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

אחזור כירורגי, בידוד ו Published: April 30, 2014 doi: 10.3791/51597
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2, 4, 1,2,3
1Department of Medical Microbiology, Immunology & Cell Biology, Southern Illinois University School of Medicine, 2Division of Orthopaedics and Rehabilitation, Department of Surgery, Southern Illinois University School of Medicine, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Biomedical Engineering Program, Southern Illinois University Carbondale, 4University of Illinois at Springfield

Summary

עבור יישומים עתידיים כתיקון כדי לתקן דמעות חלקיות של הקדמית הצולבת הרצועה (ACL), תאי שמקורם ACL האנושי בודדו מרקמות שהושגו במהלך הליכים שיקומיים, הרחיבו במבחנה וגדלו על פיגומי רקמה מהונדסת. הידבקות ומורפולוגיה תאיות הייתה אז מבוצעים כדי לאשר התאמה ביולוגית על פני פיגום.

Abstract

הפגיעה ACL היא בעיה בדרך נתקלה באנשים פעילים. אפילו דמעות חלקיות של רצועה בברך להוביל תוך מפרק זה לליקויים ביומכניים הפוגעים בתפקוד ויציבות. אפשרויות הנוכחיות לטיפול בדמעות ACL החלקיים נעות בין ניהול שמרני, שמרני לאפשרויות כירורגיות מרובות, כגון: שינוי תרמי, תיקון יחיד צרור, שחזור מלא, ובנייה מחדש של החלק הפגום של רצועת הילידים. מחקרים מעטים, אם בכלל, הוכיחו בכל שיטה יחידה עבור ניהול להיות מעולה באופן עקבי, ובמקרים רבים חולים ממשיכים להפגין חוסר יציבות מתמשכת ומחלות רקע אחרות.

מטרתו של מחקר זה היא לזהות מקור תא פוטנציאל לניצול בפיתוח של תיקון רקמות מהונדסות שיכול להיות מיושם בתיקון של ACL קרוע באופן חלקי. פרוטוקול רומן פותח להרחבת התאים שמקורם patieלילות עוברים שחזור ACL. כדי לבודד את התאים, רקמות hACL טחונות שהושגו במהלך שחזור ACL היו מתעכל בפתרון Collagenase. הרחבה בוצעה באמצעות מדיום DMEM/F12 תוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S). התאים אוחסנו לאחר מכן ב-80 º C או בחנקן נוזלי בהקפאה בינונית בהיקף של DMSO, FBS ובינוני ההתרחבות. לאחר הפשרה, תאי hACL נגזרים היו אז זורעים על פיגום רקמה מהונדסת, PLAGA (לקטית, חומצה גליקולית שיתוף פולי) וקלקר תרבות רקמות שליטה (TCPS). לאחר 7 ימים, SEM בוצע כדי להשוות הידבקות סלולרית לPLAGA לעומת TCPS השליטה. מורפולוגיה תאית הוערכה באמצעות מכתים immunofluorescence. SEM micrographs (סריקת אלקטרונים מיקרוסקופ), הוכיח כי תאים גדלו ודבק בשני משטחי PLAGA וTCPS והיו מחוברות על פני כל המשטחים ביום 7. מכתים Immunofluorescence הראה מורפולוגיים רגיל, שאינו לחוץדפוסי אל על שני המשטחים. טכניקה זו מבטיחה עבור יישומים בהתחדשות ACL ובנייה מחדש.

Introduction

הרצועות הצולבות הקדמית (ACL) היא רצועת התוך מפרקים נפוצות נפצעה בברך. כ 200,000 פציעות (ACL) מדווחות מדי שנה בארצות הברית. מעל 75% מהחולים חווים opt פציעת ACL לניתוח שחזור אורתופדי 1,2,3,4. התערבות כירורגית היא לעתים קרובות הצביעה בשל פוטנציאל ריפוי לקוי מיסודו 3. שחזור ACL נעשה בדרך כלל באמצעות autograft או גיד של שתל. Autograft ושתל מייצגים את תקן הזהב לשיקום כפי שהם מתגאים בשיעורי הצלחה גבוהים, ותיקון תפר ראשוני, אפשרות טיפול אחרת, הראה שיעורי כישלון של עד 94% 5,6,7.

דמעות חלקיות של ACL מייצגות 10% ל28% מכל דמעות ACL 8. במחקר פרוספקטיבי, נויס ואח'. ההערכה היא כי 50% מהחולים עם דמעות חלקיות משפיעים על יותר ממחצית ACL התקדמו כדי להשלים ספיקת ACL לאחר איטיפול אופרטיבי 9. מחקרים אחרים מדווחים על חוסר יציבות מתמשכת וירידה בתפקוד עם פחות מ 30% מהחולים יוכלו לחזור ל9,10,11,12,13 רמת פעילות שלפני פציעתם. אפשרויות טיפול מוגבלות וכוללות שיטות שמרניות, הצטמקות תרמית של ACL שנותר, או שחזור ACL. לאחרונה, יש כבר עלה עניין בתיקון עיקרי מתוגבר. טכניקות אלה להשתמש ביולוגיים כדי לשפר את תיקוני תפר עיקריים 14. מחקר שנערך לאחרונה ניסה לקצור hACL כמו mesenchymal נגזר בתאי גזע כדי לעקוף מגבלות שתל, 31,32 אבל התוקף והיעילות של תאים אלה עדיין אינם ידועים. נראה מקור התא האידיאלי עבור יישומי הנדסת רקמות להיות בלתי mesechymal hACL נגזר תאי פיברובלסטים.

מחקר הנוכחי התמקד בזיהוי חומר מטריצה ​​מתאים ומקור תא לפיגום המהונדס. זה הליך סטנדרטי עבור ACL קרוע להיות מושלך כמו suפסולת rgical במהלך ניתוח שחזור, לעומת זאת, רצועה פגום עשויה להיות מקור באיכות לרכישת התאים הדרושים כדי לפתח ולשפר את רקמה מהונדסת אידיאלית החלפת ACL. המעבדה שלנו פיתחה פרוטוקול להרחבה במבחנה של תאי hACL נקטפו אלה נגזרים. שימוש במטריצת 2D מהונדס רווי תאי hACL נגזרים, עיצבנו תיקון שעלול להגדיל את תיקון ACL חלקי ולחזק את הרצועות קרועות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. אחזור כירורגי

הערה: אישור IRB הושג לאסוף את גדם ACL במהלך ניתוח שחזור ACL. פטור IRB ניתנו כגדם ACL משמש, בדרך כלל, מושלך כפסולת כירורגית. 20 חולים שימשו כדי לאסוף את גדם ACL.

  1. לנהל הרדמה כללית ואנטיביוטיקה לפני ניתוח לפי הפרוטוקול של מוסד למטופל.
  2. החל חוסם עורקים ולנפח מעל לחץ דם הסיסטולי 100 מ"ג.
  3. למקם את המטופל במצב שכיבה. לעשות חתך anterolateral אופקי עם הברך בכיפוף ° 30-45 לפורטל 5 מ"מ ולהכניס נקז ארתרוסקופי ומצלמה לתוך כיס suprapatellar ב30 מעלות.
  4. לבצע ארתרוסקופיה אבחון שגרתית.
  5. הזן ברמה גבוהה וdebride הסינוביום הקרומי על ACL הקרוע.
  6. השתמש במכונת גילוח 4.5 מ"מ וablator לזהות את גדם ACL.
  7. השתמש במקור ברווז ישר מרים לאסוף SPE מרובהcimens מגדם ACL הנותר.
  8. לשמור על המדגם במלח רגיל במכל סטרילי.
  9. שלח את הדגימות לפתולוגיה לפענוח ואספקה ​​סופית למתקן במעבדה.
  10. לשחזר מטופל ולבצע טיפול שלאחר ניתוח לפי הפרוטוקול של המוסד.

2. עיכול רקמות ובידוד hACL

  1. העברת רקמת ACL האדם קיבלה מהפתולוגיה בצלחת פטרי עם תמיסת מלח סטרילית / PBS (פוספט שנאגרו מלוח).
  2. לרכך את הרקמה באמצעות מספריים סטרילי לתוך 1-2 מ"מ 3 חתיכות ולשטוף את הרקמה הטחון עם מי מלח לפחות 3 פעמים.
  3. לעכל את הרקמה הטחון עם Collagenase 0.4% בDMEM/F-12 (50/50, 1x) בינוני בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין ל4-6 שעות על 37 ° C.
  4. צנטריפוגה התאים XG ב 1000 למשך 5 דקות ולאחר מכן resuspend התאים במדיום.
  5. לשטוף את התאים עם המדיום ל2-3 פעמים ולאחר מכן seed / תרבות בT-25 צלוחיות ל2-3 ימים.

3. ההרחבה נייד, הקפאה להפשרה

  1. השתמש במיקרוסקופ אור כדי להמחיש את התאים בתרבית למשך 2-3 ימים בבקבוק T-25.
  2. לשמור על התאים ב37 מעלות צלזיוס בDMEM/F-12 (50/50, 1x) הבינוני בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S).
    הערה: שנה את התקשורת כאשר תאים להראות דבקות ומורפולוגיה סטנדרטית. השתמש במיקרוסקופ אור כדי לבחון את התאים.
  3. שוטף את התאים ומחוברות עם PBS ביום 7 (~ 1.3 X 10 6 תאים / בקבוק). הוספת טריפסין (0.5 g / L) ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הוסף מדיה לתאים הושעו לנטרל טריפסין. מחלקים את תערובת מדיה התאים בין שלוש T-25 צלוחיות.
  4. שוטף את התאים ומחוברות עם PBS, להוסיף טריפסין (0.5 גר '/ ל'), וresuspend אותם בהקפאת מדיום המכיל DMSO, FBS ובינוני המלא (DMEM/F-12 בינוני + 10% P FBS 1% + / S) ב 1:02:07 יחס.
  5. חנותבקבוקוני קריוגני ב -80 ° C אם התאים ישמשו בתוך חודש, ובחנקן נוזלי, אם התאים יישמרו במשך תקופות ארוכות.
  6. להפשיר את המבחנות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לשימוש חוזר.
    הערה: בדרך כלל תאי 90-95% לשרוד.

4. ייצור של רקמות מהונדסות 2-D לקטית, חומצה גליקולית שיתוף פולי פיגום (PLAGA)

  1. להמס 1 גרם של PLAGA ב12 מיליליטר dichloromethane בבקבוקון נצנץ 20 מיליליטר ומערבולת הפתרון במשך 8 שעות במהירות קבועה (800 סל"ד).
    הערה: תיאור פרטני בגופטה ואח' 15.
  2. מעביר את הפתרון המומס לצלחת פטרי זכוכית מרופדת בנייר הגנת Fluorinated.
  3. מניחים את צלחת פטרי מתחת למכסת מנוע ואקום ל30 דקות. השאר את צלחת פטרי ב -20 מעלות צלזיוס למשך לילה ולאחר מכן בטמפרטורת חדר. הנח את צלחות פטרי בlyophilizer כדי להבטיח אידוי של הממס מלא להשיג סרטים דקים של הפולימר.
  4. הנח בדיוני הפולימרLMS בייבוש ל24 שעות.
  5. חותכים את סרטי פולימר ל12 דיסקים עגולים בקוטר מ"מ ולאחסן אותם בתא ייבוש עד צורך.

5. סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים (SEM)

  1. לשטוף את התאים (50,000 תאים / דיסק) זורעים על TCPS השליטה ופיגום PLAGA עם PBS 7 ימים לאחר זריעה.
  2. השתמש glutaraldehyde 1.5% במאגר M 0.1 cacodylate לתקן תאים ו2.5% Oso 4 במאגר M 0.1 cacodylate להודעה קיבעון.
  3. לשטוף את התאים הקבועים עם מאגר M 0.1 cacodylate. ייבש את התאים הקבועים באמצעות התייבשות סידורי אתנול (50%, 70%, 80%, 90% ו100%) ל15 דקות כל אחד, ועוד יותר יבש בHexamethyldisilazane (HMDS) למשך לילה.
  4. Vent הקאמרית של מערכת ציפוי גמגום SEM עם שסתום לחץ ולהעלות את הצלחת העליונה.
  5. מניחים את הדגימות יבשות בחדר. מנמיכים את הצלחת העליונה.
  6. לעבור את ידית השליטה לשאוב כדי להתחיל בפינוי החדר.
  7. שסתום דליפת ארגון פתח. חכהלוואקום לרדת ל 0.05 mbar.
  8. דגימות המעיל היבשים בשכבה דקה (0.13 ננומטר) של זהב / פלדיום.
  9. להחזיר את שסתום דליפת ארגון למצב הסגור שלה.
  10. לעבור את ידית שליטה לכבויה.
  11. Vent קאמרי עם שסתום לחץ ולהעלות את הצלחת העליונה.
  12. הסר את הדגימות ולאחסן אותם בתא ייבוש ל24 שעות.
  13. שים לב הדגימות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

6. Immunofluorescence מכתים

  1. לשטוף את התאים (50,000 תאים / דיסק) זורעים על TCPS השליטה ופיגום PLAGA עם PBS 7 ימים לאחר זריעה.
  2. תקן את התאים באמצעות 70% אתנול (קר) ל10 דקות.
  3. דגירה התאים הקבועים בטמפרטורת חדר עם 1% הסרום אלבומין שור (BSA) ב-PBS שיש 0.05% טריטון X-100 עבור 20 דקות.
  4. לטבול את הדגימות בTween 1% בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
  5. הוסף נוגדן חד שבטי עכבר Anti-β-אקטין (1:400) ודגירת התאים overnighלא ב 4 ° C.
  6. לשטוף את התאים עם Tween 0.05%. הוספת נוגדנים משני (עז אנטי העכבר F (ab ') 2 שבר של IgG מצומדות עם בדיקה הקרינה, 1:400) לתאי דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
  7. לשטוף את התאים עם PBS. כתם התאים עם כתם גרעיני והר באמצעות 80% גליצרול.
  8. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ confocal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מודל העבודה לאחזור כירורגית, עיכול רקמה ובידוד של הקדמית הצולבת הרצועה האנושית (hACL) תאי שמקורם מוצג באיור 1. התאים הגרו מexplants ודבקו בחולצת 25 צלוחיות. תאים אלה היו בתרבית במשך 3 ימים ולאחר מכן היו דמיינו תחת מיקרוסקופ אור (איור 2). Monolayer מחוברות הושג ביום 7. נוכחותם של תאים בריאים ובת קיימא הצביעה על שליפה והתרבות המוצלחות של תאי hACL נגזרים.

קובץ מצורף נייד אל פני השטח של PLAGA וTCPS נקבע באופן איכותי באמצעות SEM. איור 3 מוצגי דבקות והתפשטות של תאי hACL נגזרו על כל משטח פולימרים. מפגש סלולארי נצפה עבור PLAGA וTCPS.

מורפולוגיה תאית וניתוח הידבקות נקבעה באמצעות מכתים immunofluorescence. מכתים β-אקטין הוכיח כי תאי hACL נגזרו לדבוקד ולהתרבה ​​על פני השטח של שניהם PLAGA וTCPS. איור דבקות פולימריים 4 מיצגים וextenuates המראה הרגיל, שאינו לחוץ מתאי hACL.

איור 1
איור 1. ייצוג סכמטי של שלבים כרוכים באחזור כירורגית, העיכול והבידוד של תאים מקדמיים צולבת רצועה נפצעה (ACL) עבור יישומי הנדסת רקמות. במהלך ניתוח שחזור ACL רקמות, גדם (הפסולת כירורגית) שנותרה ACL נאסף ו מאוחסן בתמיסת מלח. גדם ACL נאסף טחון ל1-2 מ"מ 3 חתיכות ושטף עם מי מלח. ACL הטחון מתעכל עם 0.4% פתרון Collagenase במדיום DMEM/F-12. לאחר מכן תאי centrifuged, resuspended ותרביתבינוני DMEM/F-12 על 37 ° C.

איור 2
תאי איור 2. אדם קדמי צולבת רצועה נגזרים נתפסו באמצעות מיקרוסקופ אור (ב10X ו20X זום). הכישור או מוארך תאים בצורה נראו גובר על פני השטח של T-25 צלוחיות לאחר 3 ימים של התרבות.

איור 3
איור 3. Micrographs SEM של תאים קדמי צולבת רצועת אדם נגזרים בתרבית על TCPS שליטה וPLAGA (ב100X, 300X ו -1,000 הגדלה X). התאים דבקים, גדלו והיו מחוברות על כל פני השטח של PLAGA והדואר לשלוט TCPS.

איור 4
איור 4. תמונות מכתים Immunofluorescence נתפסו באמצעות מיקרוסקופ confocal (ב10X זום 3.1). תאי שמקורם אנושי הקדמית צולבת רצועה הוכתמו β-אקטין (ירוק) וגרעין צבע (כחול). התאים דבקים, גדלו והציגו מורפולוגיה נורמלית, שאינו הדגישה בשני הניסויים (PLAGA) והבקרה (TCPS) משטחים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המטרה העיקרית של מחקר פיגום hACL/2D זה הייתה להשתמש בתאים שהתקבלו בתיקון כדי להגדיל את התיקון עיקרי של דמעות ACL חלקיות. ניהול שמרני של דמעות ACL חלקיות עשוי לכלול תקופה קצרה של חוסר תנועה, מחזק אותו, תכנית שיקום מתקדמת, והערכות מעקב קבועות 13,16,17. עם זאת, מחקרים רבים מראים כי טיפול שמרני בספורטאים נקשר עם תוצאות וכישלון עניים. באקלי et al. העריך 25 חולים עם דמעות ACL חלקיות במעקב ביניים ומצא כי רק 44% מהחולים התחדשו ספורט ברמה שלפני הפציעה שלהם, ו72% דיווחו על תסמינים הקשורים לפעילות 8. בק ואח'. אחרי 56 חולים עם דמעות ACL חלקיות מבודדות לתקופה ממוצעת של 5.3 שנים ורק 30% מהחולים המשיכו בפעילות שלפני פציעה 10. Fritschy et al. מצא כי 18 של 43 חולים עם דמעות ACL חלקיות התקדמו כדי להשלים את הקרע על ידי מעקב של 5 שנים11. מחקרים אלה להדגים צורך בטכניקות חדשניות לטיפול ותיקון קרע ACL חלקי.

מטרתו של מחקר זה הייתה לפתח פרוטוקול שהפגין טכניקה חדשנית שבי ACL אדם תאים (hACL) נקצרו, דבקות תרבותית והציגה לפיגום מהונדס. טכניקה זו היא דרך לשחזור ואמינה כדי לספק מקור תא פוטנציאל למגוון רחב של חקירות בעתיד לשחזור ACL. ייחודי למחקרים קודמים 31,32, תאי hACL נגזרו התקבלו מהפסולת כירורגית ולייצג את הלא mesenchymal hACL נגזר תאי פיברובלסטים.

במחקר זה, תאי hACL נגזר שאינו mesenchymal בודדו מרקמות שהושגו במהלך הליכים שיקומיים, הרחיבו במבחנה וגדלו על פיגומי רקמה מהונדסת. הידבקות ומורפולוגיה תאיות הייתה אז מבוצעים כדי לאשר התאמה ביולוגית על פני פיגום. מחקרים עתידיים חייבים להציע קואה נוספתניתוח ntitative התפשטות, כגון תגובה בזמן אמת פולימראז שרשרת (PCR) ותא הקרינה המופעל מיון (FACS), כדי לאפיין את התאים המבודדים. בנוסף, יש להשתמש בניתוח התפשטות כמותית על מנת לקבוע איזה סוג של חומרים ביולוגיים בתאי hACL המבודדים לגדול הטובים ביותר עליו.

חוסר ניתוח כמותי של תאי hACL אלה הוא מגבלה העיקרית של מחקר זה. עם זאת, מדובר במחקר ראשוני והמטרה של מחקר זה הייתה רק לבודד ולהרחיב את תאי hACL הנגזרים. מחקרים עתידיים יהיו כרוכים בלימודי התפשטות תאים ואפיון של תאים אלה באמצעות PCR בזמן אמת וFACS. מגבלה נוספת של מחקר זה היא כי משך זמן הנדרש לתרבות התאים ולשלב אותם לתוך התיקון יחייב את המטופל לעבור שני ניתוחים. יתר על כן, היכולת של תאי ACL אדם נגזר אלה כדי לשרוד בנוזל סינוביאלי לא הוקמה. מחקרים עתידייםחייב להעריך את היכולת של hACL להתרבות במבנה רקמה מהונדסת בנוכחות של נוזל הסינוביאלי.

פרוטוקול זה יאפשר לתיקון ACL קרוע באופן חלקי באמצעות תפר ופיגום 2D. פרוטוקול זה מציע מערכת מסירה עבור fibroblasts hACL לאתר הפצע ובו זמנית מגן על התאים מהנוזל הסינוביאלי. זו עלולה לאפשר תיקון וריפוי תפקודיים של קרע חלקי לACL, הימנעות מחלות רקע הקשורות לשחזור ACL. טכניקה זו מדגימה תוצאות מבטיחות, וחקירה בעתיד תציג את הפוטנציאל של טכניקה זו לתיקון ACL ובנייה מחדש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לקרן ומחלקה למענק מחקר ניתוח מדרום אוניברסיטת אילינוי, בית הספר לרפואה של סטארט אפ; ומענק הקרן רפואית לזכר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Petri dish Fisher Scientific 08-757-103C
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3994
Collagenase Gibco 17018-029 Store at 4 °C
DMEM/F-12 Cellgro 10-092-CV Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10082 Store at -80 °C
Penicillin/Streptomycin Lonza 17-602E Store at 4 °C
Centrifuge Tubes- 15 ml Corning 430790
T-25 flasks BD Falcon 3013
Trypsin-Versene mixture Lonza 17-161E Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
DMSO Fisher Scientific BP231-100 Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation.
Cryogenic vials Corning 430489
PLAGA Purac Biomaterials Purasorb PLG8523 Store at -80 °C
TCPS disks Fisher Scientific 12-545-82
Dichloromethane Fisher Scientific AC36423-0010 Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place.
Bytac paper Saint gobin performance plastics 1420652
Scintillation vial Fisher Scientific 03-339-21G
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A7906 Store at 4 °C
Tween Fisher Scientific BP337-500
mouse Anti-β-actin antibody (1° Ab) Sigma Aldrich A5441 Store at -20 °C
goat-anti-mouse antibody (2° Ab) Cell Signaling 4408 Store at -20 °C
Hoechst dye Sigma Aldrich 14530 Store at -20 °C
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Glutaraldehyde Fisher Scientific BP2547-1 Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes.
Hexamethyldisilazane Fisher Scientific AC43085-1000 Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes.
Sterile Scissors McKesson 25-716
Centrifuge Eppendorf 5804R
Light Microscope Olympus CK40
Water Bath Thermo scientific 2845
Vortex Labnet VX-200
Glass Petri plates fisher Scientific S31473
Acu-Punch Acuderm Inc. P1225 Acu-Punch was used to cut 12 mm disks
Cacodylate buffer Sigma Aldrich 97068 Flammable liquid, carcinogen and irritant.
Osmium tetraoxide Sigma Aldrich 201030 Highly toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 Harmful if swallowed
Ethanol Decon Labs 2705 Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition.
General/regional Anesthesia Amphastar pharmaceuticals 1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance
Antibiotics Hospira 0409-0805-01 Ancef 1 g i.v.
Arthroscopy trocar Smith and Nephew
Arthroscopy Camera Smith and Nephew
Arthroscopic grasper and bitter Arthrex
4.5 mm shaver Arthrex
Interference Screws Arthrex stainless steel screws
Sputter Coater Polaron E5400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, R. J. The anterior cruciate ligament: A dilemma in sports medicine. Int J Sports Med. 3, 71-79 (1982).
  2. Owings, M. F., Kozak, L. F. Ambulatory and inpatient procedures in the United States, 1996. Vital Health Stats. 13, 1-119 (1998).
  3. Frank, C. B., Jackson, D. W. The science of reconstruction of the anterior cruciate ligament. J Bone Joint Surg Am. 79, 1556-1576 (1997).
  4. Miyasaka, K. C., Daniel, D. M., Stone, M. L., Hirshman, P. The incidence of knee ligament injuries in the general population. Am J Knee Surg. 4, 3-8 (1991).
  5. Taylor, D. C., Posner, M., Curl, W. W., Feagin, J. A. Isolated tears of the anterior cruciate ligament: over 30 year follow-up of patients treated with arthrotomy and primary repair. Am J Sports Med. 37 (1), 65-71 (2009).
  6. Liljedahl, S. O., Lindvall, N., Wetterfors, J. Early diagnosis and treatment of acute ruptures of the anterior cruciate ligament: a clinical and arthrographic study of forty-eight cases. J Bone Joint Surg Am. 47, 1503-1513 (1965).
  7. Oensten, M., Lysholdm, J., Gillquist, J. Suture of fresh ruptures of the anterior cruciate ligament: A 5 year follow up. Acta Orthop Scan. 55, 270 (1984).
  8. Buckley, S. L., Barrack, R. L., Alexander, A. H. The natural history of conservatively treated partial anterior cruciate ligament tears. Am J Sports Med. 17 (2), 221-225 (1989).
  9. Noyes, F. R., Mooar, L. A., Moorman, C. T. 3rd, McGinnis, H. G. Partial tears of the anterior cruciate ligament. Progression to complete ligament deficiency. J Bone Joint Surg Br. 71 (5), 825-833 (1989).
  10. Bak, K., Scavenius, M., Hansen, S., Norring, K., Jensen, K. H., Jorgensen, U. Isolated partial rupture of the anterior cruciate ligament. Long term followup of 56 cases. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 5 (2), 66-71 (1997).
  11. Fritschy, D., Panoussopoulos, A., Wallensten, R., Peter, R. Can we predict the outcome of a partial rupture of the anterior cruciate ligament? A prospective study of 43 cases. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 5 (1), 2-5 (1997).
  12. Sommerlath, K., Odensten, M., Lysholm, J. The late course of acute partial anterior cruciate ligament tears. A nine to 15 year follow-up evaluation. Clin Orthop. , 281-2152 (1992).
  13. Barrack, R. L., Buckley, S. L., Bruckner, J. D., Kneisl, J. S., Alexander, A. H. Partial versus complete acute anterior cruciate ligament tears: the results of nonoperative treatment. J Bone Joint Surg Br. 72 (4), 622-624 (1990).
  14. Murray, M. M. Current status and potential of primary ACL repair. Clin Sports Med. 28 (1), 51-61 (2009).
  15. Gupta, A., et al. Single walled carbon nanotube composites for bone tissue engineering. J Orthop Res. 9, 1374-1381 (2013).
  16. Fruensgaard, S., Johannsen, H. V. Incomplete ruptures of the anterior cruciate ligament. J Bone Joint Surg Br. 71, 526-530 (1989).
  17. Sandberg, R., Balkfors, B., Nilsson, B., Westlin, N. Operative versus non-operative treatment of recent injuries to the ligaments of the knee. A prospective randomized study. J Bone Joint Surg Am. 69, 1120-1126 (1987).
  18. Lamar, D. S., Bartolozzi, A. R., Freedman, K. B., Nagda, S. H., Fawcett, C. Thermal modification of partial tears of the anterior cruciate ligament. Arthroscopy. 21 (7), 809-814 (2005).
  19. Indelli, P. F., Dillingham, M. F., Fanton, G. S., Schurman, D. J. Monopolar thermal treatment of symptomatic anterior cruciate ligament instability. Clin Orthop. 407, 138-147 (2003).
  20. Smith, D. B., Carter, T. R., Johnson, D. H. High failure rate for electrothermal shrinkage of the lax anterior cruciate ligament: a multicenter follow-up past 2 years. Arthroscopy. 24 (6), 637-641 (2008).
  21. Buda, R., Ferruzzi, A., Vannini, F., Zambelli, L., Di Caprio, F. Augmentation technique with semitendinosus and gracilis tendons in chronic partial lesions of the ACL: clinical and arthrometric analysis. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 14 (11), 1101-1107 (2006).
  22. Sekiya, J. K., Golladay, G. J., Wojtys, E. M. Autodigestion of a hamstring anterior cruciate ligament autograft following thermal shrinkage: a case report and sentinel of concern. J Bone Joint Surg Am. 82 (10), 1454-1457 (2000).
  23. Farquharson-Roberts, M. A., Osborne, A. H. Partial rupture of the anterior cruciate ligament of the knee. J Bone Joint Surg Br. 65, 32-34 (1983).
  24. Rue, J. P., Ghodadra, N., Bach, B. R. Jr Femoral tunnel placement in single-bundle anterior cruciate ligament reconstruction: a cadaveric study relating transtibial lateralized femoral tunnel position to the anteromedial and posterolateral bundle femoral origins of the anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 36, 73-79 (2008).
  25. Carey, J. L., Dunn, W. R., Dahm, D. L., Zege, S. L., Spindler, K. P. A systematic review of anterior cruciate ligament reconstruction with autograft compared with allograft. J Bone Joint Surg. 91, 2242-2450 (2009).
  26. Murray, M. M., Martin, S. D., Martin, T. L., Spector, M. Histological changes in the human anterior cruciate ligament after rupture. J Bone Joint Surg Am. 82, 1387-1397 (2000).
  27. Andrish, J., Holmes, R. Effects of synovial fluid on fibroblasts in tissue culture. Clin Orthop Relat Res. (138), 279-283 (1979).
  28. Murray, M. M., Spindler, K. P., Ballard, P., et al. Enhanced histologic repair in a central wound in the anterior cruciate ligamentwith a collagen-platelet-rich plasma scaffold. J Orthop Res. 25, 1007-1017 (2007).
  29. Carter, T. R. Anterior cruciate ligament thermal shrinkage. Clin Sports Med. 21, 693-700 (2002).
  30. Perry, J. J., Higgins, L. D. Anterior and posterior cruciate ligament rupture after thermal treatment. Arthroscopy. 16, 732-736 (2000).
  31. Cheng, M. T., Yang, H. W., Chen, T. H., Lee, O. K. Isolation and characterization of multipotent stem cells from human cruciate ligaments. Cell Prolif. 42 (4), 448-460 (2009).
  32. Matsumoto, T., et al. Isolation and characterization of human anterior cruciate ligament-derived vascular stem cells. Stem Cells Dev. 21 (6), 859-872 (2012).

Tags

הנדסה ביוטכנולוגיה גיליון 86 קדמית צולבת רצועה הנדסת רקמות תאי שמקורם hACL PLAGA, דמעות חלקיות ACL
אחזור כירורגי, בידוד ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הרחבת תאים הצולבות קדמי אדם נגזרים רצועה עבור יישומי הנדסת רקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gupta, A., Sharif, K., Walters, M.,… More

Gupta, A., Sharif, K., Walters, M., Woods, M. D., Potty, A., Main, B. J., El-Amin III, S. F. Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (86), e51597, doi:10.3791/51597 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter