Summary
前十字靭帯（ACL）の部分的な涙を修復するためのパッチなど、将来のアプリケーションでは、人間のACL由来の細胞をin vitroで増殖し、組織工学足場上に成長させ、再建手続きの際に得られた組織から単離した。細胞接着および形態は、その後、足場表面上に生体適合性を確認した。
Abstract
ACLに損傷がアクティブの個体において一般的に発生する問題です。機能性と安定性を損なう生体力学的な欠陥は、この関節膝靭帯リードのさえ部分的な涙。熱修正、シングルバンドルの修復、完全な復興、およびネイティブ靭帯の損傷部分の再構築：部分的なACLの涙の治療のための現在のオプションは保存療法、保守的な経営陣からのような複数の外科オプションの範囲。いくつかの研究は、もしあれば、一貫して優れていると管理のための任意の単一の方法を実証しており、多くの場合、患者は、永続的な不安定性および他の併存疾患を実証し続ける。
本研究の目的は、部分的に引き裂かれたACLの修復に実施することができる組織工学パッチの開発に利用するための潜在的な細胞源を同定することである。新規プロトコルはpatieに由来する細胞の拡大のために開発されましたACL再建を受けてNTS。細胞を単離するために、ACL再建中に得られたミンチHACL組織をコラゲナーゼ溶液中で消化した。膨張は、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したDMEM/F12培地および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を用いて行った。次いで、細胞をDMSO、FBSおよび拡張培地からなる凍結培地中に-80℃で、または液体窒素中で保存した。解凍後、HACL由来細胞は、次いで、組織工学的足場、PLAGA（ポリ乳酸 - コ - グリコール酸）および対照組織培養ポリスチレン（TCPS）上に播種した。 7日後、SEMを制御TCPSに対するPLAGAに対する細胞接着性を比較した。細胞形態は、免疫蛍光染色を用いて評価した。 SEM（走査型電子顕微鏡）顕微鏡写真は、細胞が成長し、PLAGAおよびTCPS両面に付着し、7日目で全面にコンフルエントことを明らかにした。免疫蛍光染色は、通常、非ストレス形態学を示した両面にアルミニウムパターン。この手法は、ACLの再生·復興への応用が期待されている。
Introduction
前十字靱帯（ACL）は膝の一般負傷した関節内靭帯である。約20万（ACL）の傷害は、米国で毎年報告されています。整形外科再建手術1,2,3,4のACL損傷OPTを経験した患者の75％以上。外科的介入は、しばしば本質的に治癒不良の可能性3に示されている。 ACL再建は、典型的には、自家移植片又は同種移植腱によって達成される。自家移植と同種移植片は、高い成功率を誇るように復興のためのゴールドスタンダードを表し、一次縫合の修理、他の治療オプションは、最大で94％で5,6,7の故障率を示している。
ACLの部分的な涙はすべてのACLの涙8の28％、10％に相当する。プロスペクティブ研究では、ノイスら 、よりACLの半分以上の部分に影響を与える涙を有する患者の50％が後、非ACL不全を完了するために進行していると推定手術治療9。他の研究では、持続的な不安定性を報告し、その損傷前の活動レベル9,10,11,12,13に戻ることができた患者の30％未満で機能の低下。治療の選択肢は限られており、保守的な様式、残りのACLの熱収縮、またはACL再建が含まれています。最近では、拡張現実、一次修理に対する関心が高まっています。これらの技術は、一次縫合糸修復14を強化するために生物学的製剤を使用しています。最近の研究では、間葉系様HACLを収穫しようとした31,32、移植の制限を回避するために幹細胞を誘導されたが、これらの細胞の妥当性と有効性はまだ不明です。組織工学用途のための理想的な細胞源は、非mesechymal HACLは、線維芽細胞に由来すると思われる。
現在の研究は、適切なマトリックス材料および操作された足場のための細胞源の同定に焦点を当てている。引き裂かれたACLは、suとして廃棄されることが標準的な手順である再建手術中rgical廃棄物は、しかし、この損傷を受けた靭帯は、ACL置換を設計し、理想的な組織を開発し、強化するために必要な細胞の取得質源であってもよい。私たちの研究室では、これらを採取HACL由来細胞のin vitroでの拡大のためのプロトコルを開発しました。 HACL由来細胞を注入された設計の2Dマトリックスを使用して、我々は潜在的に部分的なACLの修復を増強し、引き裂かれた靭帯を強化する可能性がパッチを設計しました。
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Protocol
1。手術検索
注：IRB承認がACL再建手術中にACL断端を収集するために得た。使用するACL断端は一般外科廃棄物として廃棄されたように、IRBの免除が与えられた。 20人の患者は、ACL断端を収集するために使用された。
- 患者への金融機関のプロトコールに従って、全身麻酔や手術前の抗生物質を管理します。
- 止血帯を適用し、収縮期血圧が上100ミリグラムを膨らませる。
- 仰臥位で患者を置く。 5ミリメートルポータルの30〜45°の屈曲で膝水平前外側切開を行い、30℃で膝蓋上パウチに関節鏡トロカールとカメラを挿入します。
- 日常的な診断関節鏡検査を実行します。
- ノッチを入力して、引き裂かれたACLより膜性滑膜を創面切除。
- ACL断を識別するために、4.5ミリメートルのシェーバーとアブレータを使用してください。
- 複数のSPEを収集するためにまっすぐに苦いダックビルを使用残りのACL断からcimens。
- 滅菌容器に生理食塩水のサンプルを維持する。
- デコードや実験施設への最終的な配信のために病理学にサンプルを送る。
- 患者を回復し、金融機関のプロトコールに従って術後ケアを行う。
2。組織消化とHACLの分離
- 人間のACL組織は、（リン酸緩衝生理食塩水）滅菌生理食塩水/ PBSでシャーレに病理から受信した転送。
- 1〜2ミリメートル3個に、滅菌ハサミで組織をミンチし、少なくとも3回の生理食塩水でみじん切り組織を洗う。
- DMEM/F-12中の0.4％コラゲナーゼで37℃で4-6時間、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した（50/50、1×）培地で細分化した組織を消化
- 5分間の千×gで細胞を遠心分離した後、培地中で細胞を再懸濁。
- Sそれから2〜3回培地で細胞を洗浄し、EED / 2〜3日のT-25フラスコ内の培養。
3。細胞拡大、凍結融解
- T-25フラスコ内で2〜3日間培養した細胞を可視化するために光学顕微鏡を使用しています。
- 10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を補充したDMEM/F-12（50/50、1×）培地中37℃で細胞を維持する。
注意：細胞が接着および標準形態を示すときに、メディアを変更します。細胞を観察するために光学顕微鏡を使用しています。 - 7日目（〜1.3×10 6細胞/フラスコ）にPBSでコンフルエントの細胞を洗浄します。トリプシン（0.5グラム/ L）を添加し、5分間37℃で細胞をインキュベートする。トリプシンを中和するために懸濁された細胞にメディアを追加。 3、T-25フラスコの間のメディア細胞の混合物を分割します。
- PBSでコンフルエントの細胞を洗浄し、トリプシン（0.5グラム/ L）を追加し、DMSO、FBSおよび完全培地（DMEM/F-12培地+、10％FBS +1％P / S）を含む凍結培地で再懸濁します比率午前1時02分07秒。
- 店細胞は、より長い時間保存される場合に細胞はヶ月以内に使用され、液体窒素中で説明する場合は-80℃での低温バイアル。
- 再利用のために37℃の水浴中でバイアルを解凍する。
注：通常90から95パーセントの細胞が生存。
4。2-Dポリ乳酸 - コ - グリコール酸（PLAGA）組織工学的足場の作製
- 20ミリリットルのシンチレーションバイアル中の12ミリリットルのジクロロメタンにPLAGAの1グラムを溶解し、一定速度（800 rpm）で8時間のためのソリューションをボルテックスする。
注意：グプタら詳細な説明15。 - フッ素系保護紙を敷いたガラスシャーレに溶解した溶液を転送します。
- 30分間真空フードの下にペトリ皿を置きます。室温で一晩、その後-20℃でペトリ皿のままにしておきます。ポリマーの薄膜を得るために、溶媒を完全に蒸発を確実にするために凍結乾燥機中でペトリ皿を置きます。
- ポリマーFIを配置します24時間デシケーター中LMS。
- 直径12mmの円形ディスクにポリマーフィルムをカットし、必要になるまでデシケーターに保管してください。
5。走査型電子顕微鏡（SEM）
- 細胞（50,000細胞/ディスク）を洗って播種7日以降のPBSで制御TCPSとPLAGA足場に播種。
- 細胞を固定し、後固定のための0.1M酸緩衝液中で2.5％のOsO 4を0.1M酸緩衝液中で1.5％のグルタルアルデヒドを使用してください。
- 0.1Mの酸緩衝液で固定した細胞を洗浄します。それぞれ15分、そして一晩ヘキサメチルジシラザン（HMDS）中でさらに乾燥シリアルエタノール脱水（50％、70％、80％、90％及び100％）を用いて固定した細胞を乾燥させる。
- ボタンバルブを、SEMスパッタコーティングシステムのチャンバーをベントし、天板を上げる。
- 室内で乾燥させた試料を配置します。天板を下げます。
- チャンバを排気開始するために圧送するコントロールノブを切り替えます。
- オープンアルゴンリーク弁。待つ真空は0.05ミリバールまで低下させるには。
- 金/パラジウムの薄い層（0.13ナノメートル）でコーティング乾燥した試料。
- その閉じた位置にアルゴンリーク弁を返します。
- オフにコントロールノブを切り替えます。
- ボタンバルブとチャンバーベント天板を上げる。
- サンプルを取り出して、24時間デシケーターに保管してください。
- 走査型電子顕微鏡でサンプルを観察します。
6。免疫蛍光染色
- 細胞（50,000細胞/ディスク）を洗って播種7日以降のPBSで制御TCPSとPLAGA足場に播種。
- 10分間、70％エタノール（コールド）を用いて細胞を固定します。
- PBSで20分間、0.05％トリトンX-100を有する中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）を用いて室温で固定した細胞をインキュベートする。
- 20分間室温で1％Tween中のサンプルを浸す。
- モノクローナルマウス抗β-アクチン抗体（1:400）を追加し、overnigh細胞をインキュベート4℃でのT
- 0.05％のTweenで細胞を洗浄。細胞への二次抗体（抗マウスF（ab 'ヤギ）蛍光プローブ、1:400と結合したIgGの2断片）を添加し、室温で1時間インキュベートする。
- PBSで細胞を洗浄。核染色で細胞を染色し、80％グリセロールを使用してマウントします。
- 共焦点顕微鏡で細胞を観察します。
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Representative Results
外科用回収、組織消化し 、ヒト前十字靭帯（HACL）由来細胞の単離のためのワーキングモデルを図1に示す。外植片から移行し、T-25フラスコに付着した細胞を。これらの細胞を3日間培養し、光学顕微鏡（ 図2）の下で可視化した。コンフルエントな単層を、7日目までに得た。健康な、生存細胞の存在はHACL由来細胞の正常な取得および培養を示す。
PLAGAおよびTCPSの表面への細胞付着を、SEMを介して定性的に測定した。各ポリマー表面上HACL由来細胞の3呈する付着および増殖を図 。携帯コンフルエンスPLAGAおよびTCPS観察された。
細胞形態および接着分析は免疫蛍光染色によって測定した。 β-アクチン染色はHACL由来細胞が接着していることを実証DへとPLAGAとTCPSの両方の表面に増殖した。4展示図 、ポリマー付着 およびHACL細胞の正常な、非ストレス負荷外観をextenuates。
図1の外科手術用回収に伴うステップの概略図で、組織工学用途のための損傷した前十字靭帯（ACL）からの細胞の組織消化および分離。ACL再建術の間に、残りの（外科的廃棄物）ACL断端が収集されると生理食塩水中に保存した。収集されたACL断1-2 mm 3の断片に切り刻み、生理食塩水で洗浄する。ミンチACLは、DMEM/F-12培地中の0.4％コラゲナーゼ溶液で消化する。次いで、細胞を、遠心分離し、再懸濁し、中で培養される37時DMEM/F-12培地 ℃、
図2。（10×と20倍ズーム時）光学顕微鏡を用いて撮影し、ヒト前十字靭帯由来細胞は、スピンドルまたは細長い形の細胞が培養3日後に、T-25フラスコの表面上に成長が見られた。
図3。制御TCPSと（100X、300X、お よび千倍の倍率で）PLAGA上で培養したヒト前十字靭帯由来細胞のSEM写真。付着した細胞は、PLAGAおよび目の表面全体に成長し、コンフルエントe制御TCPS。
図4（10×3.1ズーム時）共焦点顕微鏡を使用してキャプチャ免疫蛍光染色画像。ヒト前十字靭帯由来細胞を、β-アクチン（緑）および核（青）色素を用いて染色した。接着した細胞は、成長した実験（PLAGA）とコントロール（TCPS）両面に正常な、非ストレス負荷形態を示した。
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Discussion
このhACL/2D足場研究の主な目的は、部分的なACLの涙の主要な修理を強化するために、パッチで得られた細胞を使用することでした。部分的なACLの涙の非手術管理が固定化、ブレーシング、進歩的リハビリテーションプログラム、および定期的なフォローアップの評価13,16,17の短期間を含むことができる。しかし、多くの研究がスポーツ選手での保存的治療が不十分な結果、失敗と関連していることを示している。バックリーらは、中間フォローアップにおける部分のACL涙で25人の患者を評価し、患者のわずか44％が自分の前の傷害レベルでスポーツを再開し、72％が活動に関連した症状の8を報告したことがわかった。 BAK らは、5.3年の平均のために孤立した部分のACL涙で56人の患者を追跡し、患者のわずか30％が損傷前の活動10を再開した。 Fritschy らは、部分的なACLの涙で43人の患者の18は、5年間の追跡によって破裂を完了するために進んでいることがわかっ11。これらの研究は、部分的なACLの涙を治療し、修復するための革新的な技術の必要性を示しています。
本研究の目的は、人間のACL（HACL）細胞を回収された新規な技術、エンジニアリング足場に培養し、展示遵守を証明したプロトコルを開発することであった。この手法は、ACL再建のための将来の調査の広い配列のための潜在的な細胞源を提供するために、再現性と信頼性の高い方法です。これまでの研究31,32に固有の、HACL由来細胞は、外科的な廃棄物から得られ、非間葉HACLは線維芽細胞を派生表す。
本研究では、非HACL間葉由来の細胞は、 インビトロで増殖し、組織工学足場上に成長させた再建手順中に得られた組織から単離した。細胞接着および形態は、その後、足場表面上に生体適合性を確認した。今後の研究では、さらに資格でを提供しなければなりません単離された細胞を特徴づける、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および蛍光活性化細胞選別（FACS）などのntitative増殖分析、。さらに、定量的な増殖分析は、単離されたHACL細胞が成長する時に最善の生体材料のクラスを決定するために使用されるべきである。
これらHACL細胞の定量分析の欠如は、この研究の主要な制限である。しかし、これは予備的研究であり、この研究の目的は、HACL由来細胞を分離し、拡大することでした。今後の研究では、リアルタイムPCRおよびFACSを用いて、これらの細胞の細胞増殖研究および特性を伴う。この研究の別の制限は、時間の量は、培養細胞に必要な二つの外科的処置を受ける患者を必要とするパッチに組み込むことである。さらに、関節液の中で生き残るためにこれらのヒト派生ACL細胞の能力が確立されていない。今後の研究滑液の存在下での組織工学構築物上に増殖するHACLの能力を評価する必要があります。
このプロトコルは、縫合糸と2D足場を用いて部分的に引き裂かれたACLの修理を可能にする。このプロトコルは、創傷部位にHACL線維芽細胞のためのデリバリーシステムを提供し、同時に滑液から細胞を保護します。これはACL再建に関連する併存疾患を避け、ACLに部分的な涙の機能的修復および治癒される可能性があります。この手法は、有望な結果を示し、今後の調査では、ACLの修復と再建のためのこの技術の可能性を表示します。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、サザンイリノイ大学医学部から手術研究助成金のスタートアップ資金や部署を承認したいと思います。メモリアル医療財団補助金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | Store at 4 °C |
| DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082 | Store at -80 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | Store at 4 °C |
| Centrifuge Tubes- 15 ml | Corning | 430790 | |
| T-25 flasks | BD Falcon | 3013 | |
| Trypsin-Versene mixture | Lonza | 17-161E | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation. |
| Cryogenic vials | Corning | 430489 | |
| PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | Store at -80 °C |
| TCPS disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC36423-0010 | Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place. |
| Bytac paper | Saint gobin performance plastics | 1420652 | |
| Scintillation vial | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Store at 4 °C |
| Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| mouse Anti-β-actin antibody (1° Ab) | Sigma Aldrich | A5441 | Store at -20 °C |
| goat-anti-mouse antibody (2° Ab) | Cell Signaling | 4408 | Store at -20 °C |
| Hoechst dye | Sigma Aldrich | 14530 | Store at -20 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | BP2547-1 | Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes. |
| Hexamethyldisilazane | Fisher Scientific | AC43085-1000 | Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes. |
| Sterile Scissors | McKesson | 25-716 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Light Microscope | Olympus | CK40 | |
| Water Bath | Thermo scientific | 2845 | |
| Vortex | Labnet | VX-200 | |
| Glass Petri plates | fisher Scientific | S31473 | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch was used to cut 12 mm disks |
| Cacodylate buffer | Sigma Aldrich | 97068 | Flammable liquid, carcinogen and irritant. |
| Osmium tetraoxide | Sigma Aldrich | 201030 | Highly toxic |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Harmful if swallowed |
| Ethanol | Decon Labs | 2705 | Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition. |
| General/regional Anesthesia | Amphastar pharmaceuticals | 1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance | |
| Antibiotics | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1 g i.v. |
| Arthroscopy trocar | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopy Camera | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopic grasper and bitter | Arthrex | ||
| 4.5 mm shaver | Arthrex | ||
| Interference Screws | Arthrex | stainless steel screws | |
| Sputter Coater | Polaron | E5400 |
References
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