Transplantasjon av Pulmonary Valve Bruke en mus modell av Heterotop hjertetransplantasjon

Summary

For å forstå de cellulære og molekylære mekanismene bak neotissue dannelse og stenose utvikling i vev konstruert hjerteklaffer, ble en murine modell av heterotop hjerteklafftransplantasjon utviklet. En lunge hjerteventil ble transplantert til mottaker ved hjelp av heterotop hjertetransplantasjon teknikk.

Abstract

Tissue konstruert hjerteklaffer, spesielt decellularized ventiler, er begynt å skyte fart i klinisk bruk av rekonstruktiv kirurgi med blandede resultater. Imidlertid er de cellulære og molekylære mekanismer av neotissue utvikling, ventil jevning, og stenose utviklingen ikke forsket mye. For å svare på spørsmålene ovenfor, har vi utviklet en murine heterotop hjerteklaff transplantasjon modell. En hjerteventil ble høstet fra en ventil donor mus og transplantert til et hjerte donor mus. Hjertet til en ny ventil ble transplantert heterotopically til en mottaker mus. Den transplanterte hjertet viste sin egen hjerterytme, uavhengig av mottakerens hjerterytme. Blodstrømmen ble kvantifisert ved hjelp av en høyfrekvent ultralydsystem med en pulset doppler. Strømmen gjennom den implanterte pulmonalklaff viste frem strømmen med minimal oppstøt og toppstrømmen var tilnærmet 100 mm / sek. Denne murine modell av hjerteklafftransplantasjon er highly allsidig, slik at den kan modifiseres og tilpasses for å tilveiebringe forskjellige hemodynamiske miljøer og / eller kan brukes sammen med forskjellige transgene mus for å studere neotissue utvikling i et vev konstruert hjerteklaff.

Introduction

Medfødte kardiovaskulære defekter er en av de viktigste årsakene til spedbarnsdødelighet i den vestlige verden ^1,2. Blant dem, pulmonalklaffen stenose og bicuspid aortaklaffen defekter er en hyppig forekommende form ^tre. Hjerte ventil erstatning kirurgi er en rutinemessig utvalg av rekonstruktiv kirurgi; imidlertid komplikasjoner inkludert stenose og forkalkning av hjerteventilen, og livslang avhengighet av antikoagulanter er en betydelig kilde av kronisk sykdom og død ^4-7. Videre mangel på vekstpotensialet krever revisjon operasjoner, noe som ytterligere øker dødeligheten av de unge pasientene ^4,8,9.

I et forsøk på å utvikle en funksjonell erstatning hjerteklaff med vekstpotensial, Shinoka et al. Seeded autologe celler inn på en biologisk nedbrytbar syntetisk hjerteklaff ^8.. Den syntetiske ventil forvandlet til en innfødt hjerteklaff som struktur med vekst potenal. Foreløpige store dyrestudier vist gjennomførbarheten av å bruke denne metoden for å lage en funksjonell hjerteklaff ^10.. Imidlertid langtids implantasjon studier vist dårlig holdbarhet på grunn av progressiv fortykning av ventil neotissue resulterer i innsnevring av hjerteklaffen. Arbeid fra Sodian et al. Brukte Shinoka metodikk, men til slutt erstattet PGA matrise med et biologisk nedbrytbart elastomer, som ga de biomekaniske egenskapene til vevet konstruert ventil konstruere en mer fysiologisk profil ^9,11,12. I in vivo-studie, til tross for suksessen med implantering, en konfluent endotelcelle foring ble ikke dannet noe som kan begrense den langsiktige suksess for denne stillaset ^12..

For å rasjonelt designe en forbedret andre generasjon syntetisk hjerteklaff, ble en murine modell av hjerteklafftransplantasjon opprettet for å undersøke de cellulære og molekylære mekanismer underlying neotissue formasjon, ventil jevning, og stenose utvikling. Murine modellene har et stort utvalg av molekylære reagenser, inkludert transgenics, som ikke er lett tilgjengelig i andre arter ^7. I denne hjerteklafftransplantasjon modell, ble en ex vivo syngene pulmonal hjerteklaff erstatning utført første; og deretter hjertet med den implanterte hjerteklaff ble implantert heterotopically inn i en syngene vert ved hjelp av et mikrokirurgisk teknikk. Denne modellen gjør at hjertet ventil erstatning uten behov for hjerte-bypass.

I dette papiret, en detaljert forklaring av en hjerteklaff høst, donor hjerte forberedelser, hjerteklafftransplantasjon, og heterotop hjertetransplantasjon er beskrevet. Resultatene viste en kontinuerlig hjerteslag fra donor hjertet, som var uavhengig av mottakeren hjerteslag. Blodstrømmen gjennom den implanterte pulmonalklaff ble målt ved hjelp av en høyfrekvent ultralydsystem med en pulset gjøreppler.

Protocol

Merk: Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Nationwide Children Hospital Institutional Animal Care og bruk komité.

En. Lungehjerteklaff innhøsting fra en hjerteklaff Donor Mouse

1. Autoklav alle kirurgiske verktøy før operasjonen: 1x gode saks, 3x mikro tang, 2x mikro vaskulære klemmer, 1x klemme søker tang, 1x mikro nål holder, 1x våren saks, 1x beltesnellen.
2. A 6-8 ukers gamle hunn C57BL / 6 mus blir brukt som en pulmonal hjerteklaff donor. Fjern musen fra buret sitt og veie det, så avlive med en ketamin / xylazin cocktail (Ketamin, 200 mg / kg og xylazin, 20 mg / kg, IP) overdose.
3. Clip brystet området og plassere musen i en rygg recumbence posisjon på en pute. Deretter gjør Thoracotomi. Expose hjertet, lage et lite snitt på høyre atrium, og perfuse venstre ventrikkel med iskaldt saltvann.
4. Omsvøp dissekere lungearterien (PA) fra stigende enOrta. Skjær ut lunge ventilen (PV) sammen med 2 mm mansjett av lungearterien. Kvitt deg med resten av hjertet.
5. Oppbevar PV i kaldt heparin og saltoppløsning (100 enheter / ml). Merk: PV kan holdes i oppløsningen i to timer før transplantasjon til donorhjerte.

2. Donor Hjerte Forberedelse

1. A 6-8 ukers gamle hunn C57BL / 6 mus blir brukt som en hjerte donor. Fjern musen fra buret sitt og veie det, så avlive med en ketamin / xylazin cocktail (ketamin, 200 mg / kg og xylazin, 20 mg / kg, IP) overdose. Dette er en terminal prosedyre.
2. Clip brystet området og plassere musen i en rygg recumbence posisjon på en pute. Deretter gjør Thoracotomi. Bluntly skille hjertet, inferior vena cava (IVC), superior vena cava (SVC), stigende aorta, PA, og lungevene. Perfuse IVC med iskald sterilt saltvann.
3. Ligate den IVC, SVC, og lungevene med 6-0 silke sutur deretter klippe overlegen tilligaturer.
4. Skjær aorta og PA med 2 mm mansjett.
5. Skjær ut PV og kast den.

Tre. Hjerteklaff Transplantasjon på en donor hjerte

1. Umiddelbart etter trinn 2.5, plasseres hjerteklaff fra trinn 1.5 inn i donorhjerte og orientere hjerteklaffen.
2. Fest PV med et sting på høyre side av ventilen med 10-0 monofilament sting på koniske nåler og begynner å sy kontinuerlig med 5-6 masker fra den andre siden av PV.
3. Etter å ha fullført den fremre side, dreier hjertet horisontalt og begynne å sy baksiden av PV på donorhjerte.
4. Oppbevar hjertet i en kald steril heparin / saltvann. Merk: donorhjerte kan holdes i oppløsningen i to timer før implantering til mottakeren mus.

4. Heterotop hjertetransplantasjon på til en mottaker Mouse

1. A 6-8 ukers gamle hunn C57BL / 6 mus ble brukt som en recipient. Fjern musen fra sitt bur og veie den, så bedøvet med ketamin / xylazin cocktail (ketamin 100 mg / kg og xylazin 10 mg / kg). Ketoprofen (5 mg / kg) blir benyttet som preanesthesia analgetikum.
2. Etter å ha sjekket nivået av sedasjon ved hale klemming, klipp mage-og hår på brystet. Smøre øynene med sterilt ophthalmic salve, og plasserer muse i en rygg recumbence posisjon på en pute. Desinfiser magen med Betadine og alkohol pads. Deretter dekker musen med en steril tildekking og utsett innsnitt området bare.
3. Lag en midtlinjen laparotomi snitt fra under xyphoid til suprapubisk regionen, og sette inn en selvholde retractor. Pakk tarmen i saltvann fuktet kompress. Bluntly definere infrarenale aorta og vena cava.
4. Plasser to 6-0 silke sting proksimalt og distalt rundt aorta og IVC å holde blodsirkulasjonen.
5. Plasser donor hjertet på høyre side av magepulsåren og dekke den med steril gauze. Fukte det med saltvann.
6. Gjør et aortotomy i abdominal aorta ved hjelp av en 30 G nål og forlenge åpningen med saks til størrelsen av donor aorta.
7. Utfør en ende-til side anastomose med sterile 10-0 monofilament sting på koniske nåler. Sikre donor aorta med en maske på proksimale ende av åpningen i den abdominale aorta og begynne å sy kontinuerlig med 4-5 masker fra den distale ende av den abdominale aorta.
8. Flip hjertet til venstre side, dekker den med saltvann infusert gasbind, og begynne å sy kontinuerlig med 4-5 masker fra den distale ende av den abdominale aorta.
9. Gjør en venotomy i IVC ved hjelp av en 30 G nål og forlenge åpningen til størrelsen av donor lungearterien.
10. Utfør en slutt på side anastomose med sterile 10-0 monofilament sting på koniske nåler. Sikre donor PA med en maske på den proksimale ende av åpningen i IVC og begynne å sy kontinuerlig med 4-5 masker fraden distale enden av den nedre vena cava. Denne tid, fordi aorta er i veien, være sikker suturering av den venstre veggen av donor PA er på innsiden av IVC.
11. Skyll de IVC lumen med heparin og saltoppløsning (100 enheter / ml). Lukk høyre vegg av donor-PA og mottaker IVC ved å sy dem kontinuerlig til den distale enden.
12. Fjern det distale ligatur og kontrollere blødning ved å påføre en topisk absorberbare hemostat sterilt middel. Når blødningen stopper helt, fjerne den proksimale sutur og kontrollere blødning på samme måte.
13. Returner tarmen og lukke abdominalmusku og hud i to lag ved hjelp av en 6-0 sort polyamid monofilament sutur.
14. Injisere 0,5 ml saltvann subkutant og plassere musen i en recovery bur på en varmepute til musen er fullt mobil. Ved utvinning, returnere musen til et nytt bur med papir sengetøy. Gi smertestillende medikamenter (Ibuprofen, 30 mg / kg, drikkevann) i 48 timer. Gjørikke returnere et dyr som har gjennomgått kirurgi for å selskap av andre dyr inntil fullt restituert.

Representative Results

Figur 1 illustrerer skjematisk av hjerteklaffen transplantasjon modellen ved hjelp heterotop hjertetransplantasjon. Hjerteventilen ble høstet fra en donor hjerte og implantert på et hjerte fra en annen donor mus. Deretter hjertet med den nye hjerteklaff ble implantert i bukhulen til et mottaker mus. Figur 2 viser en illustrasjon av den implanterte hjerte på mage mellomrom (A), rett etter hjertetransplantasjon (B), og 5 minutter etter transplantasjon. Ved fjerning av suturer på begge sider av aorta og IVC, begynner hjertet til å slå på 1-2 min senere og blir pinker med flere blodsirkulasjon. Legg merke til at den høyre forkammer er mer utvidet i (C) enn (B). Hjertet etter hvert slår sterkere og er stabil etter 24 timer.

Blodstrømmen gjennom den implanterte pulmonalklaff ble målt perkutant 10 dager etter implantering ved hjelpen høyfrekvent ultralydsystem med pulset Doppler-bølgemodus (Fig. 3). Lokaliseringen av aorta, høyre ventrikkel (RV), implantert pulmonalklaff (PV) og lungearterien (PA) i B-modus er vist i figur 3 (A). Den gule prøvevolum overlegg er plassert på den implanterte PV. Figur 3 (B) viser en skjematisk fremstilling av anatomien og plasseringen av prøvevolumet overlegget. Som vist i figur 3 (c), ble donorhjerte QRS bølge detektert rytmisk og uavhengig av mottakeren hjerte bølgen. Den målte systoliske og diastoliske blodvolum ved den implanterte PV matchet donorhjerte bølgen. Den topphastighet var rundt 100 mm / sek.

Figur 1.60; Skjematisk av hjerteklafftransplantasjon En lunge hjerteklaff ble høstet fra en første donor mus og implantert i et hjerte fra en annen donor mus.. Deretter hjertet med den nye ventil ble implantert heterotopically inn i en mottaker mus.

Figur 2. Det transplanterte hjertet. A) Et diagram av et hjerte med ny hjerteklaff implantert i abdominal mellomrom (B) rett etter implantering, og (C) 5 min etter implantasjon.

Måling Fig. 3. Blodstrømmen i implanted pulmonalklaff. A) B-mode bilde som angir plasseringen av aorta, høyre ventrikkel (RV), implantert pulmonalklaff (PV) og lungearterien (PA). B) Et diagram av anatomien og plassering av prøvevolumet overlegget. C) Velocity måling ved implantert PV med EKG bølge.

Discussion

Dødeligheten av denne fremgangsmåten er i nærheten av 20%, som var for det meste forårsaket av blødning ved PV transplantasjon området og anastomose på donor aorta til mottakeren abdominal aorta. I de fleste tilfellene, dødeligheten reduseres betydelig 48 timer etter inngrepet. Overlevelses mus viste sterke hjerteslag og blodstrøm gjennom implantert PV. Hele prosessen tar fire timer for en erfaren kirurg micro. Det vil ta omtrent 250 mus for å mestre teknikken. Den heterotop hjertetransplantasjon er forholdsvis rett frem i forhold til PV implantasjon til donorhjerte. Et av de mest kritiske trinn for en vellykket HV Transplantasjon er innhøsting av PV-struktur fra en donor mus. PV struktur bør transektert rundt 1-2 mm under ventilen. Hvis gjenværende vev er for kort, vil anastomose være utfordrende. Hvis vevet under PV er for lang (dvs.. PA vil bli for langt i forhold til stigeing aorta etter implantasjon), kan den implanterte PA vri eller kink. Et annet kritisk punkt er anastomose mellom implantert PA og mottaker IVC. Siden IVC er meget tynn, er det svært lett å rive ved suturering.

I denne modellen blir den aortiske blod gjennom aorta, strømmer gjennom koronararteriene, går så ut gjennom koronare sinus til donor RA. Så blodvolum å passere gjennom den implanterte PV er 5% av det totale blodvolum i beregningen, som er den mest signifikante begrensning av denne modell for å studere TEHV. For å øke blodstrømmen om PV ble tre ytterligere modeller opprettet. Først ble en tredje anastomose opprettet fra donor RV til mottakeren IVC. Den tredje anastomose kan øke blodstrømmen med 10% til 50% av det totale blodvolum. For det andre, for ytterligere å øke blodstrømmen, etter å ha plassert den tredje anastomose ble IVC ligert proksimalt til den tredje anastomose. Denne metoden forsikret 50% av blodstrømmen gjennomimplantert PV. For det tredje, for å øke strømningen gjennom den implanterte PV og opprettholde flere fysiologisk sirkulasjon, ble hjertet transplantert med lungene. Denne metoden kunne øke strømmen opp til 50% av den totale blodstrøm, og enda viktigere, den venstre ventrikkel og venstre atrium opprettholde sin sirkulasjon. Disse ulike fysiologiske strømningsmodeller gjør oss i stand til å studere hvordan forskjellen i fysiologiske strømningsforhold påvirker utviklingen av neotissue og stenose i et transplantert hjerte ventil.

Nylig gjennomførte vi en pilotstudie til transplantasjon decellularized HV uten celle seeding å bruke den beskrevne teknikken i dette papiret. Den implantert PV viste lignende blodstrømningsegenskaper som kontroll, predecellularized transplantert PV. I fremtiden vil ulike typer celler bli seedet å studere neotissue dannelse og stenose utvikling av det transplanterte HV. Videre bruker transgene mus, for eksempel grønt fluorescerende protein (GFP) mus eller en mouse-modell av HV sykdom, kan prosessen med neotissue dannelse studeres mechanistically ved å studere kilde av celler som fyller den decellularized eller syke hjerteklaff ved hjelp av immunhistokjemi, som vil bidra til utviklingen av mer rasjonelt utformede, andre generasjons vev konstruert for hjerteklaffer. Muligheten for å bruke ulike fysiologiske strømningsforhold, transgene mus, decellularized PV implantasjoner, og mulige kombinasjoner av alle tre viser allsidighet og potensielt viktig preklinisk nytten av denne HV transplantasjon modell.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14190-144
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine Sterile Solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (Sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Sientific	23-400-118
Fine Scissor	FST	14028-10
Micro-Adson Forcep	FST	11018-12
Clamp Applying Forcep	FST	00072-14
S&T Vascular Clamp	FST	00396-01
Spring Scissors	FST	15008-08
Colibri Retractors	FST	17000-04
Dumont #5 Forcep	FST	11251-20
Dumont #7 - Fine Forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 Forceps	FST	11251-35
Tish Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For sutureing the graft
Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non Woven Sponges	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18 G 1 1/2 in, Needle	BD	305190
25 G 1 in., Needle	BD	305125
30 G 1 in., Needle	BD	305106
Warm Water Recircultor	Gaymar	TP-700
Warming Pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500
VEVO2100 High Frequency Ultrasound	VisualSonics	http://www.visualsonics.com/vevo2100	The catalog number and pricing can be acquired from the sales representatives.
Ultrasound transmission gel	Parker Laboratories, INC.	01-02
Table Top Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip, INC.	901806
Isoflurane	Baxter	1001936060