Summary
Doku mühendisliği kalp kapakçıklarında neotissue oluşumu ve darlık gelişimi altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için, heterotopik kalp kapakçığı nakli bir fare modeli geliştirilmiştir. Bir pulmoner kalp kapak heterotopik kalp nakli tekniği kullanılarak alıcıya nakil oldu.
Abstract
Doku mühendisliği kalp kapakçıkları, özellikle decellularized vanalar, karışık sonuçlar rekonstrüktif cerrahi klinik kullanımda ivme kazanmaya başlıyor. Bununla birlikte, neotissue geliştirme, valf kalınlaşma ve stenoz gelişme hücresel ve moleküler mekanizmalar kapsamlı araştırılmış değildir. Yukarıdaki soruları cevaplamak için, biz bir kemirgen heterotopik kalp kapakçığı nakli modeli geliştirdi. Kalp valfi bir valf verici fareden toplanmış ve bir kalp verici fareye transplante edildi. Yeni bir vana ile kalp bir alıcı fareye heterotopically nakil oldu. Nakledilen kalp alıcının kalp atışı bağımsız, kendi kalp atışlarını gösterdi. Kan akışı, atımlı bir dalga Doppler ile yüksek frekanslı bir ultrason sistemi kullanılarak ölçülmüştür. Implante pulmoner valf üzerinden akış minimal yetersizliği akışını ileri gösterdi ve pik akım 100 mm / sn yakın oldu. Kalp kapağı nakli Bu fare modeli olan Highlçok yönlü y, değiştirilmiş ve bu nedenle farklı hemodinamik ortamlar sağlamak için ve / veya bir doku mühendisliği kalp valf neotissue gelişimini incelemek için çeşitli transgenik fareler ile birlikte kullanılabilir uyarlanabilir.
Introduction
Konjenital kalp kusurları batı dünyası 1,2 bebek ölümlerinin önde gelen nedenlerinden biridir. Bunlar arasında, pulmoner kapak darlığı ve aort kapağı kusurları sık görülen şeklidir 3 vardır. Kalp kapak değiştirme ameliyatı rekonstrüktif cerrahi rutin bir seçimdir; Ancak, darlık ve kireçlenmeye kalp kapakçığı ve antikoagülan ömür boyu bağımlılık dahil komplikasyonlar, kronik hastalık ve ölüm 4-7 önemli bir kaynağıdır. Ayrıca, büyüme potansiyeli eksikliği daha genç hastalarda, 4,8,9 ve mortaliteyi artırır, revizyon ameliyatları gerektirir.
Biyolojik olarak parçalanabilir bir sentetik kalp kapakçığı 8 üzerine büyüme potansiyeli, Shinoka et al. Tohumlanmış otolog hücreler olan fonksiyonel değiştirme kalp valfi geliştirmek için bir girişim olarak. Büyüme potansiyeli olan bir yapı gibi yerli kalp kapakçığı dönüştü sentetik valfal. Ön büyük hayvan çalışmaları fonksiyonel bir kalp valfini 10 oluşturmak için bu yöntemi kullanarak fizibilite göstermiştir. Bununla birlikte, uzun süreli implantasyon çalışmaları nedeniyle, kalp valfinin daralması ile sonuçlanan valf neotissue ilerleyici kalınlaşmasına kötü dayanıklılığı göstermiştir. Sodian ikinci çalışma ark. Shinoka yöntem kullanılır, ancak sonuçta daha fizyolojik bir profil oluşturmak 9,11,12 doku mühendisliği vananın biyomekanik özelliklerini veren biyolojik olarak parçalanabilir bir elastomer ile PGA matris yerini aldı. In vivo çalışmada, implantasyon başarısı rağmen, birleşik endotel hücre astar bu iskele 12'nin uzun sürede başarısını sınırı düşüren oluşmuş değildi.
Rasyonel geliştirilmiş ikinci nesil sentetik kalp kapağı tasarlamak amacıyla, kalp kapakçığı nakli bir fare modeli hücresel ve moleküler mekanizmaları underlyin araştırmak için kuruldug neotissue oluşumu, valf kalınlaşma ve darlık gelişimi. Fare modelleri diğer türlerde 7 hazır değildir transgenikleri dahil olmak üzere moleküler belirteçlerin geniş bir dizi, sunuyoruz. Bu kalp kapakçığı nakli modelinde, ex vivo singenik pulmoner kalp kapak replasmanı ilk gerçekleştirilmiştir; ve daha sonra implante edilen kalp kapağı ile kalp bir mikrocerrahi tekniği kullanılarak bir konakçıya genetik olarak özdeş heterotopically implante edildi. Bu model, kardiyopulmoner baypas için gerek kalmadan kalp kapağı değişimi sağlar.
Bu yazıda, bir kalp kapakçığı hasat ayrıntılı bir açıklama, donör kalp preparatları, kalp kapakçığı nakli ve heterotopik kalp nakli tarif edilir. Sonuçlar alıcı atışı bağımsız olduğu donör kalp, sürekli bir kalp atışı gösterdi. Implante pulmoner valf kan akışı, atımlı bir dalga fazlası ile yüksek frekanslı ultrason sistemi kullanılarak ölçüldüppler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bütün hayvan prosedürleri Nationwide Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
Kalp Vana Donör Fare 1. Pulmoner Kalp Vana Hasat
- Ameliyat öncesi tüm cerrahi aletler otoklava sokun: ince makas, 3x mikro forseps, 2x mikro vasküler kelepçeler, 1x kelepçe uygulayarak forseps, 1x mikro iğne tutucu, 1x yaylı makas, 1x ekartörünü 1x.
- A 6-8 haftalık dişi C57BL / 6 fare, akciğer kalp kapak verici olarak kullanılmaktadır. Kafesinden fareyi çıkarın ve bunu tartmak, sonra bir ketamin / ksilazin kokteyl (ketamin, 200 mg / kg ve ksilizin, 20 mg / kg, IP) doz aşımı ile euthanize.
- Göğüs alanı Klip ve bir yastık üzerinde bir dorsal recumbence pozisyonda fare yerleştirin. Sonra torakotomi yapmak. , Kalp maruz sağ atrium üzerinde küçük bir kesim yapmak ve buz soğuk tuzlu su ile sol ventrikül serpmek.
- Açık açık artan a gelen pulmoner arter (PA) teşrihOrta. Pulmoner arter 2 mm manşet ile birlikte pulmoner kapak (PV) kesip. Kalbin kalan atınız.
- Soğuk heparin ve tuzlu su çözeltisi (100 birim / ml) 'de PV saklayın. Not: PV verici kalp nakli önce iki saat boyunca çözelti içinde tutulabilir.
2.. Donör Kalp Hazırlık
- A 6-8 haftalık dişi C57BL / 6 fare kalp verici olarak kullanılır. Kafesinden fareyi çıkarın ve bunu tartmak, sonra bir ketamin / ksilazin kokteyl (ketamin, 200 mg / kg ve ksilizin, 20 mg / kg, IP) doz aşımı ile euthanize. Bu, bir terminal işlemdir.
- Göğüs alanı Klip ve bir yastık üzerinde bir dorsal recumbence pozisyonda fare yerleştirin. Sonra torakotomi yapmak. Açık açık kalp, inferior vena kava (IVC), vena kava (SVK), çıkan aort, PA, ve pulmoner ven ayrı. Buz soğuk steril serum fizyolojik ile IVC serpmek.
- IVC, SVC, ve daha sonra üstün kesti 6-0 ipek sütür ile pulmoner ven ligasyonubitişik harfler.
- 2 mm manşeti ile aorta ve PA kesti.
- PV kesip atın.
Donör Kalp üzerine 3. Kalp Kapağı Nakli
- Hemen adım 2.5 sonra, donör kalbine 1.5 adım kalp kapakçığı yerleştirin ve kalp kapakçığı yönlendirin.
- Konik iğne 10-0 monofilament dikiş kullanarak vananın sağ tarafında bir dikiş ile PV elde edin ve PV diğer taraftan 5-6 stiches sürekli dikiş başlar.
- Ön tarafı bitirdikten sonra, yatay kalp döndürmek ve donör kalbin üzerine PV arka tarafını dikmek başlar.
- Soğuk bir steril heparin / tuzlu su çözeltisi içinde kalp saklayın. Not: Donor kalp alıcı fareye implantasyondan önce iki saat boyunca çözelti içinde tutulabilir.
Bir Alıcı Fare 4. Heterotopik Kalp Nakli
- Bir 6-8 haftalık dişi C57BL / 6 fare bir rezidüsünden olarak kullanılmıştırpient. Kafesinden fareyi çıkarın ve sonra ketamin / ksilazin kokteyl (ketamin, 100 mg / kg ve ksilizin 10 mg / kg) ile anestezi, tartılır. Ketoprofen (5 mg / kg) Anestezi öncesi analjesik olarak kullanılır.
- Kısma kuyruk tarafından sedasyon düzeyini kontrol ettikten sonra, karın ve göğüs saç klibi. Steril Oftalmik merhem ile gözleri yağlayın ve bir yastık üzerinde bir dorsal recumbence pozisyonda fare yerleştirin. Betadine ve alkol pedleri ile karın dezenfekte edin. Daha sonra steril bir örtü ile fare kapak ve sadece kesik alana maruz kalmaktadır.
- Suprapubik bölgeye xiphoid aşağıdan bir orta hat laparotomi kesi yapmak ve kendini tutma ekartörünü yerleştirin. Tuzlu çözelti ile nemlendirilmiş gazlı bez bağırsakları sarın. Açık açık infrarenal aorta ve vena kava tanımlar.
- Kan dolaşımını dizginlemek aorta ve IVC etrafında proksimal ve distalde iki 6-0 ipek sütür koyun.
- Abdominal aorta sağ tarafındaki donör kalbi yerleştirin ve steril GAÜ ile örtünze. Tuzlu su ile nemlendirmek.
- Bir 30 G iğne kullanılarak abdominal aortta aortotomy yapın ve verici aort boyutuna makas ile açıklığı uzanır.
- Konik iğne steril 10-0 monofilament sütür kullanarak bir tarafında uçtan anastomoz gerçekleştirin. Abdominal aortta açıklığın yakın ucunda bir tane dikiş ile verici aort elde edin ve abdominal aortun uzak ucundan 4-5 stiches sürekli dikiş başlar.
- , Sol tarafa kalp çevirmek serum vermek gazlı bez ile örtün ve abdominal aorta uzak ucundan 4-5 stiches ile sürekli dikiş başlar.
- Bir 30 G iğne kullanılarak IVC bir venotomi yapın ve verici pulmoner arter boyutuna açıklığı uzanır.
- Konik iğne steril 10-0 monofilament sütür kullanarak yan anastomoz sona gerçekleştirin. IVC içinde açıklığın yakın ucunda bir tane dikiş ile verici PA elde edin ve 4-5 stiches sürekli dikiş başlarinferior vena kava uzak ucu. Aort şekilde, çünkü bu sefer, emin donörün PA sol duvarının sütür IVC iç olduğundan emin olun.
- Heparin ve tuzlu su çözeltisi (100 birim / ml) ile IVC lümen yıkayın. Uzak ucuna sürekli olarak onları dikiş ile PA verici ve alıcı IVC sağ duvar kapatın.
- Distal ligatürün çıkarın ve bir topikal emilebilir steril hemostat ajanı uygulayarak kanamayı kontrol. Kanama tamamen durduğunda, proksimal sütür kaldırmak ve kanama aynı şekilde kontrol.
- Bağırsakları İade ve 6-0 siyah poliamid monofilament sütür kullanılarak iki kat karın kas ve deri kapatın.
- 0.5 ml serum fizyolojik subkutan enjekte edilir ve fare tamamen mobil kadar bir ısınma pad üzerinde bir kurtarma kafes fare yerleştirin. Kurtarma üzerine, kağıt yatak ile yeni kafesine fareyi dönmek. 48 saat boyunca ağrı ilaç (ibuprofen, 30 mg / kg, içme suyu) ver. Dotamamen iyileşti kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan döndürmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 heterotopik kalp nakli kullanarak kalp kapakçığı nakli modelinin şemaları göstermektedir. Kalp kapakçığı, bir donör kalbi hasat ve bir ikinci verici fareden alınan bir kalp üzerine yerleştirildi. Ardından yeni kalp kapak ile kalp bir alıcı fare karın implante edildi. 2. sağ kalp transplantasyonu (B) sonrasında, karın boşluğu (A) implante kalp bir örnek gösterir ve nakilden sonra 5 dk Şekil. Aort ve IVC her iki tarafta dikiş kaldırılması üzerine, kalp, daha sonra 1-2 dk yenmek için başlar ve daha fazla kan dolaşımı ile pinker olur. Sağ atrium fazla (B) 'den (C) dilate unutmayın. Kalp atım kademeli olarak daha güçlü ve 24 saat sonra stabildir.
Implante pulmoner valf üzerinden kan akımı ile 10 gün sonra, deri altından implantasyondan ölçüldüdarbeli dalga Doppler modu (Şekil 3) ile yüksek frekanslı ultrason sistemi. Aort yerleri, sağ ventrikül (RV), pulmoner valf (PV) yerleştirildi ve B modunda pulmoner arter (PA), Şekil 3 (A) gösterildi. Sarı örnek hacmi katlamalı implante PV üzerinde yer almaktadır. Şekil 3 (B) anatomi ve örnek hacmi bindirmenin konumu bir diyagramını göstermektedir. Şekil 3 (C) 'de gösterildiği gibi, verici kalp QRS dalga ritmik olarak algılanır ve alıcı kalp dalga bağımsız edildi. Implante PV ölçülen sistolik ve diyastolik kan hacmi donör kalp dalga eşleşti. Zirve hızı 100 mm / sn civarında oldu.
Şekil 1.60, kalp kapak naklinin şematik bir akciğer kalp kapak bir birinci verici fareden toplanmış ve bir ikinci verici fareden alınan bir kalp içine yerleştirildi.. Ardından yeni vana ile kalp bir alıcı fare içine heterotopically implante edildi.
Şekil 2. Nakledilen kalp. A) Yeni bir kalp kapak ile bir kalbin bir diyagram sağ implantasyon sonrası karın boşluğunda (B) implante ve (C) 5 dakika implantasyon sonrası.
I Şekil 3. Kan akımı ölçümüAort yerleri, sağ ventrikül (RV), implante pulmoner kapak (PV) ve pulmoner arter (PA). B) örnek hacmi bindirme anatomisi ve konumu şeması gösteren mplanted pulmoner kapak. A) B-mod görüntü. EKG dalga ile implante PV C) Hız ölçümü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu prosedürün ölüm oranı çoğunlukla alıcı abdominal aorta donör aort PV nakli site ve anastomoz de kanama neden oldu% 20, yakındır. Pek çok durumda, ölüm oranı önemli ölçüde 48 saat ameliyat sonrasında azalır. Sağkalım fareler implante PV yoluyla güçlü kalp atışlarını ve kan akışını gösterdi. Bütün bu süreç, deneyimli bir mikro cerrah için dört saat sürer. Bu tekniği ana kabaca 250 fareler alacaktır. Heterotopik kalp nakli donör kalbe PV implantasyon kıyasla öne nispeten düzdür. Başarılı bir HV nakli için en kritik adımlardan biri donör fare PV yapısının hasat olduğunu. PV yapısı valf altında 1-2 mm civarında transeksiyon olmalıdır. Kalan doku çok kısa ise, anastomoz zor olacaktır. PV altındaki doku, yani (çok uzunsa. PA yükselmek karşılaştırıldığında çok uzun olacak) implantasyon sonrası aort ing, implante PA büküm veya ilginçlik olabilir. Diğer önemli adım implante ÖİB ve alıcı IVC'ye arasındaki anastomoz olduğunu. IVC çok ince olduğundan, dikiş atma sırasında gözyaşı son derece kolaydır.
Bu modelde, aortik kan, aort yoluyla gelir koroner damar yoluyla akar, o zaman verici RA koroner sinüs üzerinden çıkar. Bu yüzden, implante PV geçmesine kan hacmi TEHV inceleyerek bu modelin en önemli bir sınırlama oluşturmaktadır tahmininde toplam kan hacmi, 5% 'dir. PV olsa kan akışını artırmak için, üç ek model oluşturuldu. İlk olarak, üçüncü bir anastomoz alıcıya IVC için donör RV oluşturuldu. Üçüncü anastomoz toplam kan hacminin% 50% 10 oranında kan akışını artırabilir. İkinci olarak, bundan başka, üçüncü anastomoz yerleştirdikten sonra, IVC üçüncü anastomoz yakın şekilde bağlanmıştır, kan akışını artırmak için. Bu yöntem sayesinde kan akışının% 50 sigortalıimplante PV. Üçüncü olarak, implante PV boyunca akışı artırmak ve daha fizyolojik bir şekilde beslenmesini sağlamak için, kalp, akciğer ile transplante edildi. Bu yöntem, toplam kan akışının% 50 akışını arttırabilir ve daha da önemlisi, sol ventrikül ve sol atriyum dolaşımlarının korumak. Bu farklı fizyolojik akış modelleri fizyolojik akım koşullarında fark nakledilen kalp kapakçığı olarak neotissue ve darlık gelişimini nasıl etkilediğini incelemek için bize sağlar.
Son zamanlarda, biz bu yazıda anlatılan tekniği kullanarak hücre tohumlama olmadan nakli decellularized HV için bir pilot çalışma yapılmıştır. İmplante PV, bir kontrol olarak predecellularized nakledilen BD benzer kan akış özellikleri gösterdi. Gelecekte, farklı hücre türleri nakledilen HV neotissue stenoz oluşumu ve gelişimini incelemek için ekildi olacaktır. Ayrıca, bu tür yeşil floresan protein (GFP) veya bir farenin dağla olarak, transgenik fareler kullanılarakHV hastalık se modeli, neotissue oluşum süreci daha rasyonel olarak tasarlanmış, ikinci nesil doku mühendisliği kalp kapakçıklarının gelişimine yardımcı olacak immunohistokimyasını decellularized veya hastalıklı kalp kapağı, doldurma hücrelerin kaynağını inceleyerek mekanik olarak ele alınabilir. Farklı fizyolojik akış koşulları, transgenik fare, decellularized PV implantasyonu ve her üç olası kombinasyonları kullanılarak olasılığı çok yönlü ve bu HV transplantasyon modeli, potansiyel olarak önemli klinik öncesi yarar göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma CKB için NIH (RO1 HL098228) bir hibe, kısmen desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine Sterile Solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (Sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Fine Scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-Adson Forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp Applying Forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular Clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring Scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri Retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For sutureing the graft |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non Woven Sponges | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18 G 1 1/2 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25 G 1 in., Needle | BD | 305125 | |
| 30 G 1 in., Needle | BD | 305106 | |
| Warm Water Recircultor | Gaymar | TP-700 | |
| Warming Pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| VEVO2100 High Frequency Ultrasound | VisualSonics | http://www.visualsonics.com/vevo2100 | The catalog number and pricing can be acquired from the sales representatives. |
| Ultrasound transmission gel | Parker Laboratories, INC. |
01-02 | |
| Table Top Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip, INC. | 901806 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 |
References
- Polito, A., et al. Increased morbidity and mortality in very preterm VLBW infants with congenital heart disease. Intens Care Med. 39, 1104-1112 (2013).
- Wren, C., Reinhardt, Z., Khawaja, K. Twenty year trends in diagnosis of life threatening neonatal cardiovascular malformations. Arch Dis Child Fetal. 93, F33-F35 (2008).
- Vacanti, J. P. Beyond transplantation Third annual Samuel Jason Mixter lecture. Archives of surgery. 123, Chicago Ill. 545-549 (1960).
- Tudorache, I., et al. Orthotopic replacement of aortic heart valves with tissue-engineered grafts. Tissue engineering Part A. 19, 1686-1694 (2013).
- van Geldorp, M. W., et al. Patient outcome after aortic valve replacement with a mechanical or biological prosthesis weighing lifetime anticoagulant related event risk against reoperation risk. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 137, 881-886 (2009).
- El Oakley, R., Kleine, P., Bach, D. S. Choice of prosthetic heart valve in today's practice. Circulation. 117, 253-256 (2008).
- Quinn, R. W. Animal Models for Bench to Bedside Translation of Regenerative Cardiac Constructs. Progress in Pediatric cardiology. 35, (2013).
- Shinoka, T., et al. Tissue engineering heart valves valve leaflet replacement study in a lamb model. The Annals of thoracic surgery. 60, S513-S516 (1995).
- Sodian, R., et al. Tissue engineering of heart valves in vitro experiences. The Annals of thoracic surgery. 70, 140-144 (2000).
- Shinoka, T., et al. Tissue engineered heart valves. Autologous valve leaflet replacement study in a lamb model. Circulation. 94, II164-II168 (1996).
- Sodian, R., et al. Evaluation of biodegradable three dimensional matrices for tissue engineering of heart valves. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs. 46, 107-110 (1992).
- Sodian, R., et al. Early in vivo experience with tissue-engineered trileaflet heart valves). Circulation. 102, III22-III29 (2000).
