Transplantation av pulmonell ventil med hjälp av en musmodell av Heterotopisk hjärttransplantation

Summary

För att förstå de cellulära och molekylära mekanismer som ligger bakom neotissue bildning och stenos utveckling inom vävnadstekniska hjärtklaffar, var en murin modell av heterotopisk hjärtklaffen transplantation utvecklas. En pulmonell hjärtklaff transplanterades till mottagare med hjälp av heterotopisk hjärttransplantation teknik.

Abstract

Vävnadstekniska hjärtklaffar, speciellt decellularized ventiler, börjar ta fart i klinisk användning av rekonstruktiv kirurgi med blandade resultat. Men de cellulära och molekylära mekanismerna i neotissue utveckling, ventil förtjockning, och stenos utveckling inte forskat utförligt. För att besvara ovanstående frågor, vi utvecklat en mus heterotop hjärtklaff transplantation modell. En hjärtklaff skördades från en ventil donator mus och transplanteras till en hjärt donator mus. Hjärtat med en ny ventil transplanterades heterotopiskt till en mottagare mus. Den transplanterade hjärta visade sin egna hjärtslag, oberoende av mottagarens hjärtslag. Blodflödet kvantifierades med hjälp av högfrekvent ultraljudssystem med en pulsad doppler. Flödet genom implanterade lungventilen visade fram flöde med minimal uppstötningar och toppflödet till nära 100 mm / sek. Denna musmodell av hjärtklaff transplantation är highly mångsidiga, så att den kan modifieras och anpassas för att ge olika hemodynamiska miljöer och / eller kan användas med olika transgena möss för att studera neotissue utveckling i en vävnadsteknisk hjärtklaff.

Introduction

Medfödda kardiovaskulära defekter är en av de främsta orsakerna till barnadödligheten i västvärlden ^1,2. Bland dem, lungklaffen stenos och bicuspid aortaklaffdefekter är en ofta förekommande form ^3. Hjärtklaff ersätta kirurgi är ett rutin val av rekonstruktiv kirurgi; Men komplikationer inklusive stenos och förkalkning av hjärtklaffen, och livslångt beroende av antikoagulantia är en betydande källa till kronisk ohälsa och död ^4-7. Dessutom är bristen på tillväxtpotentialen kräver översyn operationer, vilket ytterligare ökar dödligheten för dessa unga patienter ^4,8,9.

I ett försök att utveckla en funktionell ersättning hjärtklaff med tillväxtpotential, Shinoka et al. Ympade autologa celler på en bionedbrytbar syntetisk hjärtklaff ^8. Den syntetiska ventil omvandlas till en infödd hjärtklaff liknande struktur med tillväxt potentioal. Preliminära stora djurstudier visat att det är möjligt att använda denna metod för att skapa en fungerande hjärtklaff ^10. Men långtids implantation studier visade dålig hållbarhet på grund av progressiv förtjockning av ventil neotissue vilket resulterar i förträngning av hjärtklaffen. Arbeta från Sodian et al. Använde Shinoka metoden, men till slut ersatte matrisen PGA med en biologiskt nedbrytbar elastomer, som gav de biomekaniska egenskaperna hos vävnadstekniska ventil konstruera en mer fysiologisk profil ^9,11,12. I in vivo-studie, trots en framgångsrik implantation, ett sammanflytande endotelcell foder bildades inte som skulle kunna begränsa den långsiktiga framgången för denna byggnadsställning ^12.

För att rationellt utforma en förbättrad andra generationens syntetiska hjärtklaff, var en musmodell av hjärtklaff transplantation skapats för att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer underlying neotissue bildning, ventil förtjockning, och stenos utveckling. Murina modeller erbjuder ett brett spektrum av molekylära reagenser, inklusive transgena, vilket inte är lätt tillgängliga i annan art ^7. I detta hjärtklaff transplantation modell, var en ex vivo syngena pulmonell hjärtklaff ersättning utförs först; och sedan hjärtat med den implanterade hjärtklaffen implanterades heterotopiskt in en syngent värd med hjälp av en mikrokirurgisk teknik. Modellen gör det möjligt att byta ut klaffen hjärta utan behov av hjärt-bypass.

I detta papper, en detaljerad förklaring av en hjärtklaff skörd, är donator hjärtpreparat, hjärtklaffstransplantation och heterotop hjärttransplantation beskriven. Resultaten visade en kontinuerlig hjärtslag från donatorn hjärtat, som var oberoende av mottagarens hjärtslag. Blodflödet genom den implanterade lungventilen mättes med användning av en högfrekvent ultraljudssystem med en pulsad våg Görppler.

Protocol

OBS: Alla animaliska förfaranden godkändes av Nationwide barnsjukhuset Institutional Animal Care och användning kommittén.

1. Lung hjärtklaff Harvest från en hjärtklaff Donator Mouse

1. Autoklavera alla kirurgiska verktyg innan operationen: 1x fina saxar, 3x mikro pincett, 2x mikrokärlklämmor, 1x klämma tillämpar pincett, 1x micro nål, 1x våren sax, 1x upprullningsdon.
2. En 6-8 veckor gamla C57BL / 6 mus används som ett lunghjärtklaffdonator. Ta bort musen från sin bur och väga den, sedan avliva med ketamin / xylazin cocktail (ketamin, 200 mg / kg och xylazin, 20 mg / kg, IP) överdos.
3. Clip bröstet och placera musen i en ryggbakåtlutad kroppsställning ställning på ett block. Gör sedan torakotomi. Exponera hjärta, gör ett litet snitt i höger förmak, och BEGJUTA den vänstra hjärtkammaren med iskall saltlösning.
4. Rakt på sak dissekera lungartären (PA) från stigande aOrta. Klipp ut pulmonary ventil (PV) tillsammans med 2 mm manschett av lungartären. Kassera resten av hjärtat.
5. Förvara PV i kallt heparin och koksaltlösning (100 enheter / ml). Anm: PV kan hållas i lösningen under två timmar före transplantation till donatorhjärtat.

2. Donator Heart Förberedelse

1. En 6-8 veckor gamla C57BL / 6 mus används som ett hjärta donator. Ta bort musen från sin bur och väga den, sedan avliva med ketamin / xylazin cocktail (ketamin, 200 mg / kg och xylazin, 20 mg / kg, IP) överdos. Detta är en terminal förfarande.
2. Clip bröstet och placera musen i en ryggbakåtlutad kroppsställning ställning på ett block. Gör sedan torakotomi. Rakt på sak separera hjärtat, nedre hålvenen (IVC), vena cava superior (SVC), aorta ascendens, PA, och lungvenen. BEGJUTA IVC med iskall steril koksaltlösning.
3. Ligera IVC, SVC, och pulmonell ven med 6-0 silke sutur klipp överlägsen denligaturer.
4. Skär aorta och PA med 2 mm manschetten.
5. Klipp ut PV och kassera den.

3. Hjärtklaff Transplantation på en donator hjärta

1. Omedelbart efter steg 2,5, placera hjärtklaff från steg 1,5 till donatorhjärtat och orientera hjärtklaff.
2. Säkra PV med en söm på den högra sidan av ventilen med hjälp av 10-0 monofilamentsuturer på avsmalnande kanyler och börja sutur kontinuerligt med 5-6 stygn från den andra sidan av PV.
3. Efter att ha avslutat den främre sidan, rotera hjärtat vågrätt och börjar sutur baksidan av PV på donatorhjärtat.
4. Förvara hjärtat i en kall steril heparin / saltlösning. Obs: donatorhjärtat kan hållas i lösningen under två timmar före implantering till mottagaren mus.

4. Heterotopisk Hjärttransplantation på till en mottagare mus

1. En 6-8 veckor gamla C57BL / 6 mus användes som en recitagaren. Ta bort musen från sin bur och väga den, då bedövades med ketamin / xylazin cocktail (ketamin, 100 mg / kg och xylazin 10 mg / kg). Ketoprofen (5 mg / kg) används som preanesthesia analgetikum.
2. Efter kontroll av graden av sedering med svans nypa, klippa buken och bröstet hår. Smörj ögonen med steril oftalmologiska salva, och placera musen i en ryggbakåtlutad kroppsställning ställning på ett block. Desinficera buken med Betadine och spritsuddar. Täck sedan musen med en steril duk och exponera snittet enda område.
3. Gör en mittlinjen laparotomi snitt underifrån xyphoid till suprapubisk regionen, och sätt en självhållande upprullningsdon. Linda tarmarna i saltlösning fuktad gasväv. Rakt på sak definiera den infrarenala aortan och hålvenen.
4. Placera två 6-0 silke suturer proximalt och distalt runt aorta och IVC att hindra blodcirkulationen.
5. Placera givaren hjärtat på den högra sidan av bukaorta och täck den med steril gauze. Återfukta den med saltlösning.
6. Lägg ett aortotomy i bukaortan genom att använda en 30 G nål och utvidga öppningen med en sax för att storleken på donatoraorta.
7. Utför en end-to sida anastomos med sterila 10-0 monofilamentsuturer på koniska nålar. Säkra donatoraorta med en söm på den proximala änden av öppningen i den abdominala aortan och börja sutur kontinuerligt med 4-5 stygn från den distala änden av den abdominala aortan.
8. Vänd hjärtat till vänster sida, täck den med saltlösning infunderas gasbinda, och börja sy kontinuerligt med 4-5 stygn från den distala änden av bukaorta.
9. Gör en venotomy i IVC med användning av en 30 G nål och utvidga öppningen till storleken på donatorlungartären.
10. Gör slut på sido anastomos med sterila 10-0 monofilamentsuturer på koniska nålar. Säkra givaren PA med en söm på den proximala änden av öppningen i IVC och börja att sy kontinuerligt med 4-5 stygn frånden distala änden av den nedre hålvenen. Den här gången, på grund av att stora kroppspulsådern är i vägen, se till att suturering av den vänstra väggen i givarens PA på insidan av IVC.
11. Spola IVC lumen med heparin och koksaltlösning (100 enheter / ml). Stäng den högra väggen hos donator PA och mottagare IVC genom att sy dem kontinuerligt till den distala änden.
12. Ta bort den distala ligatur och kontrollera blödning genom att tillämpa en aktuell absorber steril hemostat agent. När blödningen stoppas helt, ta bort den proximala sutur och kontrollera blödning på samma sätt.
13. Avkastning tarmarna och stäng bukmuskulaturen och huden i två lager med hjälp av en 6-0 svart polyamid monofilamentsutur.
14. Injicera 0,5 ml koksaltlösning subkutant och placera musen i en återhämtning bur på en uppvärmning pad tills musen är helt mobil. Vid återhämtning, tillbaka musen till en ny bur med papper strö. Ge smärtstillande (Ibuprofen, 30 mg / kg, dricksvattnet) under 48 timmar. Görinte tillbaka ett djur som har genomgått en operation för att företaget av andra djur förrän återhämtat sig helt.

Representative Results

Figur 1 illustrerar schemabild av ventilen transplantationsmodell hjärtat med hjälp av heterotopisk hjärttransplantation. Den hjärtklaff skördades från en donator hjärta och implanteras på ett hjärta från en andra donator mus. Då hjärtat med den nya hjärtklaff implanterades på buken av en mottagare mus. Figur 2 visar en illustration av det implanterade hjärtat på bukhålan (A), direkt efter hjärttransplantation (B), och 5 min efter transplantation. Efter avlägsnande av suturer på båda sidor av aorta och IVC, börjar hjärtat att slå 1-2 min senare och blir mer rosa med mer blodcirkulation. Observera att det högra förmaket är mer vidgade i (C) än (B). Hjärtat gradvis slår starkare och är stabil efter 24 tim.

Blodflödet genom den implanterade lungventilen mättes perkutant 10 dagar efter implantation med hjälp aven högfrekvent ultraljudssystem med pulsad våg Doppler-läge (fig. 3). Placeringarna av aortan, höger ventrikel (RV), implanterade lungventil (PV) och lungartären (PA) i B-läget var som visas i figur 3 (A). Den gula prowolym overlay ligger på den implanterade PV figur. 3 (B) visar ett diagram av anatomin och placeringen av prowolymen överlägget. Såsom visas i fig. 3 (C), var donatorhjärtat QRS-våg detekteras rytmiskt och oberoende av mottagarens hjärta vågen. Den uppmätta systoliska och diastoliska blodvolymen hos den implanterade PV matchade donator hjärta vågen. Topphastigheten var omkring 100 mm / sek.

Figur 1.60, Schematisk av hjärtklaff transplantation En pulmonell hjärtklaff skördades från en första donator mus och implanteras i ett hjärta från en andra donator mus.. Då hjärtat med den nya ventilen implanterades heterotopiskt in en mottagare mus.

Figur 2. Den transplanterade hjärtat. A) Ett diagram av ett hjärta med ny hjärtklaff inopererad i bukhålan (B) direkt efter implantationen, och (C) 5 min efter implantation.

Mätning Figur 3. Blodflödet i implanted lungventilen. A) B-modbild som indikerar placeringen av aorta, höger ventrikel (RV), implanterade lungventil (PV) och lungartären (PA). B) Ett diagram av anatomin och placering av prowolymen överlägget. C) Hastighet mätning vid den implanterade PV med EKG-kurvan.

Discussion

Dödligheten i denna procedur är nära 20%, vilket till största delen berodde på blödning vid transplantation platsen PV och anastomos på givarens aorta till mottagaren bukaorta. I de flesta fall minskar dödligheten signifikant 48 h efter kirurgi. Överlevnads möss visade kraftiga hjärtslag och blodflödet genom implanterade PV. Hela processen tar fyra timmar för en erfaren mikro kirurg. Det kommer att ta ungefär 250 möss för att behärska tekniken. Den heterotopisk hjärttransplantation är relativt enkelt jämfört med PV implantation till donatorhjärtat. En av de mest kritiska stegen för en lyckad HV transplantation är skörden av PV strukturen från en donator mus. PV strukturen bör transected cirka 1-2 mm under ventilen. Om den återstående vävnaden är för kort, kommer anastomos vara utmanande. Om vävnaden under PV är för lång (dvs.. PA kommer att vara för lång i förhållande till den stigaing aorta efter implantation), kan den implanterade PA vrida eller kink. Ett annat viktigt steg är anastomos mellan den implanterade PA och mottagare IVC. Eftersom IVC är mycket tunn, är det extremt lätt att riva under suturering.

I denna modell kommer aorta blod genom aorta, flyter genom kranskärlen, sedan går ut genom sinus coronarius till donatorn RA. Så blodvolymen att passera genom den implanterade PV är 5% av den totala blodvolymen vid uppskattning, som är den mest betydande begränsning av denna modell för att studera TEHV. För att öka blodflödet om PV har ytterligare tre modeller skapas. Först framställdes en tredje anastomos skapades från donatorn RV till mottagaren IVC. Den tredje anastomos kan öka blodflödet med 10% till 50% av den totala blodvolymen. För det andra, för att ytterligare öka blodflödet, efter att placera den tredje anastomos var IVC ligerades proximalt till den tredje anastomos. Denna metod försäkrad 50% av blodflödet genomimplanteras PV. För det tredje, för att öka flödet genom den implanterade PV och upprätthålla mer fysiologisk cirkulation ades hjärtat transplanterats med lungorna. Denna metod skulle kunna öka flödet upp till 50% av den totala blodflödet och ännu viktigare, vänster kammare och vänster förmak behålla sin cirkulation. Dessa olika fysiologiska flödesmodeller möjligt för oss att studera hur skillnaden i fysiologiska flödesförhållanden påverkar utvecklingen av neotissue och stenos i ett transplanterat hjärta ventil.

Nyligen genomförde vi en pilotstudie för att transplantation decellulariseras HV utan cellsådd med den beskrivna tekniken i detta dokument. Den implanterade PV visade liknande blodflödesegenskaper som kontroll, predecellularized transplanterade PV. I framtiden kommer olika typer av celler ympas att studera neotissue bildning och stenos utveckling av transplanterade HV. Dessutom, med hjälp av transgena möss, såsom grönt fluorescerande protein (GFP)-möss eller en mouse modell av HV sjukdom, kan studeras processen för neotissue bildning mekanistiskt genom att studera källan till celler befolka decellulariserad eller sjuka hjärtventilen med immunohistokemi, vilket kommer att bidra till utvecklingen av ett mer rationellt utformade, andra generationens vävnadstekniska hjärtklaffar. Möjligheten att använda olika fysiologiska flödesbetingelser, transgena möss, decellulariserade PV implantationer och möjliga kombinationer av alla tre visar mångsidigheten och potentiellt viktig preklinisk användbarheten av denna HV transplantationsmodell.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14190-144
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine Sterile Solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (Sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Sientific	23-400-118
Fine Scissor	FST	14028-10
Micro-Adson Forcep	FST	11018-12
Clamp Applying Forcep	FST	00072-14
S&T Vascular Clamp	FST	00396-01
Spring Scissors	FST	15008-08
Colibri Retractors	FST	17000-04
Dumont #5 Forcep	FST	11251-20
Dumont #7 - Fine Forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 Forceps	FST	11251-35
Tish Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For sutureing the graft
Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non Woven Sponges	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18 G 1 1/2 in, Needle	BD	305190
25 G 1 in., Needle	BD	305125
30 G 1 in., Needle	BD	305106
Warm Water Recircultor	Gaymar	TP-700
Warming Pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500
VEVO2100 High Frequency Ultrasound	VisualSonics	http://www.visualsonics.com/vevo2100	The catalog number and pricing can be acquired from the sales representatives.
Ultrasound transmission gel	Parker Laboratories, INC.	01-02
Table Top Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip, INC.	901806
Isoflurane	Baxter	1001936060