הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

39.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51751

⸱

8 בספטמבר 2014

 ,  , 
1CNRS, UMR-5203, Institut de Génomique Fonctionnelle, Montpellier, 2Inserm, U661, Montpellier, 3Universités de Montpellier

במאמר זה

סיכום

נוירונים דופמינרגיים ממלאים תפקיד ויסות חיוני במוח. אובדן שלהם קשור למחלת פרקינסון. בסרטון זה, אנו מראים כיצד ליצור תרביות ראשוניות של נוירונים דופמינרגיים מרכזיים ממזנספלון של עכברים עובריים. תרבויות כאלה שימושיות לחקר הפגיעות הקיצונית של נוירונים אלה ללחצים שונים.

תקציר

נוירונים דופאמין מהווים פחות מ -1% מהמספר הכולל של תאי עצב במוח. סכום זה נמוך של תאי עצב מווסת את תפקודי מוח חשובים כגון שליטה מוטורית, מוטיבציה, וזיכרון עבודה. נוירונים דופאמין Nigrostriatal להידרדר באופן סלקטיבי במחלת פרקינסון (PD). איבוד עצבי מתקדם זה קשור באופן חד משמעי עם הסימפטומים מנועים של פתולוגיה (bradykinesia, רעד במנוחה, נוקשות שרירים ו). הסוכן העיקרי האחראי לניוון תא עצב דופאמין הוא עדיין לא ידוע. עם זאת, נוירונים אלה מופיעים להיות מאוד פגיעים בתנאים מגוונים. תרבויות עיקריות מהוות אחד המודלים הרלוונטיים ביותר לחקור תכונות ומאפיינים של נוירונים דופאמין. ניתן להגיש תרבויות אלה לסוכני מתח שונים המחקים פתולוגיה PD ותרכובות הגנה עצביות על מנת לעצור או להאט את הניוון עצבי. מודלים רבים מהונדסים העכבר של PD כי כבר generated בעשור האחרון גדל עוד יותר את האינטרס של חוקרים לתרבויות נוירון דופאמין. הנה, פרוטוקול הווידאו מתמקד בנתיחה העדינה של מוח עכבר העוברי. כריתה מדויקת של mesencephalon הגחון היא חיונית כדי להשיג תרבויות עצביות מספיק עשירות בתאי דופאמין כדי לאפשר מחקרים עוקבים. פרוטוקול זה יכול להתממש עם עכברים הטרנסגניים עובריים ומתאים לצביעת immunofluorescence, PCR כמותי, כימות שליח שני, או הערכת מוות / הישרדות עצבית.

מבוא

דופמין, אחד מהמוליכים העצביים במוח החיוני 1,2, בעיקר שפורסם על ידי דופאמין המוח התיכון הנוירונים (DA). רוב הנוירונים DA מתגוררים בחלק הגחוני של mesencephalon 2-6. סכמטי, ניתן לחלק את תאי עצב DA המוח התיכון בשלוש מבחינה אנטומית ותפקודי של מערכות שונות הקרנה: mesostriatal, mesolimbic, ומסלולי mesocortical 2,5. מסלול nigrostriatal מעורב במנוע התנהגות, מסלולי mesolimbic לשחק תפקיד חשוב בחיזוק, מוטיבציה, ולמידה, ואילו מסלולי דופאמין מקרינים לקליפת מוח הקדם חזיתית הם מעורבים בקוגניציה 2.

נוירונים DA מעורבים בכמה הפרעות נוירולוגיות אדם כמו סכיזופרניה, קשב וריכוז, הפרעת פעילות יתר, והמחלה (PD) פרקינסון 2,4. PD מתאפיין בניוון מתקדם וסלקטיבי של תאי עצב DA חיבור nigra substantiacompacta Pars (SNC) לסטריאטום. הפסד של תוצאות נוירונים DA Nigro-striatal בדלדול הדופמין החמור בסטריאטום, כי הוא אחראי לתסמינים המוטוריים של מחלת הפרקינסון (bradykinesia, רעד במנוחה, נוקשות) 7. הגורם הראשוני לPD אידיופטית לא הוקם והטיפולים הנוכחיים הם רק סימפטום, במטרה להחזיר את רמת הדופמין בסטריאטום. התרופה המומלצת ביותר היא L-דופא (Levodopa), המבשר הטבעי של דופמין. למרות שהממשל של Levodopa מפצה על האובדן של דופאמין למשך פרק זמן מסוים, סיבוכים מוטוריים להתרחש לאחר טיפולים ארוכי טווח (dyskinesia והפעלה / כיבוי מדינות) 8,9.

מחקר על נוירונים דופאמין ופ"ד הוא בהתקדמות מתמדת ומאמצים אינטנסיביים נעשים כדי לפתח טיפולים הבוסס על השתלת תאים, ריפוי גנטי, או סוכני הגנה עצביים 10,11. עם זאת, נושא מרכזי נשאר לא הובהר: מה הוא הגורם של vulnerab הקיצוניility של נוירונים DA? ניתן למצוא חלק מהתשובה בפעילות של תאי עצב DA. נראית ירידה בפעילות החשמלית ושל הרגישות של תאי עצב DA כדי להגדיל את נטייתם להידרדר 12. אף על פי כן, את המורכבות של הפתוגנזה פ"ד דורשים מחקרים נוספים על מנת לזהות את המנגנונים מעורבים בDA נוירונים ניוון 13-15.

תרבויות עיקריות רלוונטיות במיוחד ללמוד תכונות תא עצב DA 16-19 ולקרוא תיגר על הנוירונים האלה ללחצים שונים להערכה של סוכני הגנה עצביים 20-24. מודלים תרבות עכברוש משמשים בתדירות הגבוהה ביותר, כפי שהנתיחה של mesencephalon עובר עכברוש היא קלה יותר, בהשוואה לעכבר, וניתן לקבל כמויות גדולות יותר של תאי עצב בחולדות. עם זאת, דור של דגמי עכבר מהונדסים של המחלה 25 יש מידה ניכרת הגדיל את האינטרס של קהילת מדען המוח לתרבויות עיקריות מהעכבר 26-29. למרות שתרבויות יחסי ציבורepared מבעלי חיים שזה עתה נולדו יכול לשמש, עדיף להכין אותם מעוברים בשלב שלאחר mitotic (E13.5 לנוירונים mesencephalon), כאשר נוירונים שמרו היכולת שלהם להבחין. הפרוטוקול הבא מציג נוירונים mesencephalon מבודדים בתרבות העיקרית מעוברי עכברים (E13.5), שהם קשים ביותר להכנה. יש לציין, אנו מספקים פרוטוקול באמצעות מדיום סרום ללא תרבות לשחזור טוב יותר. שני השלבים הקריטיים ביותר בהכנת התרבות (לנתיחה וניתוק מכאני) שיפורטו בזהירות בווידאו קשור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

העכברים המשמשים בעבודה זו טופלו ויטופלו בהתאם להנחיות של מועצת האיחוד האירופית (86/609 / איחוד אירופי) לשימוש בחיות מעבדה.

.1 הכנת פתרונות הנדרשים

  1. פתרונות מניות
    1. פתרון 10x פולי-L-ornithine (אש"ף): לשקול את 10 מ"ג hydrobromide אש"ף (משקל מולקולרי = 30,000-70,000) ולפזר ב70 מ"ל של מים סטריליים. סנן את הפתרון באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן מזרק, aliquot, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    2. 30% פתרון גלוקוז: לשקול את 30 גרם של D (+) - גלוקוז ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ"ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C..
    3. בינוני של 5x השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) / תערובת מזין F-12 חם: לשקול את 6 גרם של אבקת DMEM / F-12 חם ומתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ"ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C..
    4. 7.5% סודיום ביקרבונט (NaHCO 3) Solutiב: לשקול את 7.5 גרם של NaHCO 3 ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ"ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C..
    5. 1 M HEPES פתרון: לשקול את 23.8 גרם של HEPES ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ"ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C..
    6. אתנול 70% (v / v): לדלל 70 מ"ל של אתנול מוחלט עם 30 מ"ל של מים סטריליים.
  2. בופר פוספט עם גלוקוז ואנטיביוטיקה (PBS-GAB): להוסיף 10 מ"ל של 30% פתרון גלוקוז ו5 מ"ל של תמיסת פניצילין, סטרפטומיצין 500 מ"ל של בופר פוספט של Dulbecco. חנות ב 4 ° C..
  3. מומת בסרום שור עוברי (iFBS): להפשיר בסרום שור הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס ולהשבית ב56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. Aliquot לתוך 50 מ"ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
  4. תרבות בינונית: במים סטריליים, לערבב ברציפות 40 מ"ל של 5x DMEM / F12-שינקין, 1 מ"ל של 1 M HEPES, 2 מ"ל של 200 מ"מ L-גלוטמין, 2 מ"ל של פניצילין, סטרפטומיצין, 4 מ"ל של 30% גלוקוזnd 3 מ"ל של .7.5% NaHCO 3 עד נפח סופי של 180 מ"ל. לסנן ולהשתמש באותו היום.
  5. ההורמון Mix
    1. הכן 180 מ"ל של מדיום התרבות. לפזר 200 מ"ג של apo-transferrin במדיום זה.
    2. לשקול את 50 מ"ג של אינסולין ולהתמוסס ב2 מ"ל של 0.1 M HCl. לאט להוסיף 8 מ"ל של מים סטריליים תוך ערבוב בעדינות. לדלל את הפתרון הזה במדיום התרבות.
    3. לשקול את 19.3 מ"ג של Putrescine dihydrochloride ולהתמוסס ב10 מ"ל של מים סטריליים. מוסיף את הפתרון 10 מ"ל לתערובת ההורמון.
    4. הכן פתרון 3 מ"מ selenite נתרן במים סטריליים ופתרון פרוגסטרון 2 מ"מ באתנול מוחלט. הוסף 20 μl של כל פתרון לתערובת ההורמון.
    5. סנן את תערובת ההורמון, aliquot לתוך 10 מ"ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

2 הכנת פלטות תרבות ומכשירים

  1. FBS ציפוי של צלחות התרבות: היום לפני הנתיחה, להכין 180 מ"ל של מדיום התרבות. הוסף 10 מ"ל שלiFBS 90 מ"ל של מדיום התרבות. הוסף 300 μl / גם של מדיום התרבות / 10 iFBS% ל24 גם צלחות Precoated פולי-D-ליזין. דגירה הלילה בשעה 37 C °. אחסן את המדיה שנותרה (עם ובלי iFBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
  2. לעקר את המכשירים וטפטפות פסטר. אסוף את הציוד מפורט בטבלת חומרים, כמו גם זרימה למינרית Class II וCO 2 באינקובטור.

.3 Dissection של העכבר mesencephalon

  1. להקריב את העכבר בהריון E13.5 (על פי הנחיות מוסדיות). נקה את הבטן של העכבר עם 70% אתנול ולפתוח את קיר הבטן. לאסוף את קרן הרחם, לפתוח אותם באמצעות מספריים עדינים, לנתח כל עובר מקרני הרחם, ולהסיר את הקרומים מי השפיר. מניחים את העוברים בצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה PBS-GAB סטרילי ולשטוף אותם על ידי העברה ב3 אמבטיות זהות רצופות באמצעות מלקחיים. לנתיחה, למקם את העוברים על ידי 3 בצלחת פטרי סטרילית 60 מ"מ.
  2. Movדואר צלחת פטרי הסופי תחת סטראו. אל לערוף את העוברים. בעזרת המספריים Vannas, תחתוך את המוח.
    1. מוציא בזהירות ולבטל את האזורים הקדמיים והמוח אחוריים. לצד מקורי, לחתוך קרוב לאזור התלמוס, לצד קיצוץ הזנב באזור המצר, להסיר את colliculus מעולה.
    2. ברגע שמוח תיכון הגחון מבודד, להסיר בזהירות קרומי המוח באמצעות מלקחיים יפים במיוחד. לאסוף קטעים גזורים, ללא קרומי המוח, בצינור 13 מ"ל סטרילי המלא PBS-GAB.
  3. נקה את הצינור המכיל mesencephala ביסודיות עם אתנול 70% ולהביא אותו מתחת למכסת המנוע.

דיסוציאציה .4 הסלולרי

  1. לשטוף mesencephala 3x עם PBS-GAB סטרילי. לאפשר שברי המוח ליישב בין כל שטיפה ולהימנע מלשבש את הרקמה. לאחר לשטוף האחרון, להסיר בזהירות רב כפתרון שאפשר לדגור מגזרי מוח ב 3 מ"ל של טריפסין / EDTA ל15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור.
  2. אש פולנית טפטפות פסטר על מנת למקסם את ההישרדות של תאי העצב כמו הסוף של pipet זכוכית שאינה מלוטשת היא חד ויכולה לגרום נזק לתאים במהלך שלבי הניתוק. מעט להפחית את קוטר הגפיים (עד 0.5 מ"מ) של פיפטה פסטר תוך אש וליטוש לזה.
  3. מוציא בזהירות כמה שפתרון / EDTA טריפסין ככל האפשר ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום התרבות / 10 iFBS%. מגזרי המוח לשטוף 3x עם iFBS מדיום התרבות / 10%.
  4. באמצעות פיפטה פסטר האש מלוטשת, מתחיל ניתוק של mesencephala ב6 מ"ל של מדיום התרבות / 10 iFBS%. Triturate 10x (למנוע בועות אוויר), לאפשר לנתחים להתיישב, ואז לאסוף את המדיום בצינור מ"ל 13 סטרילי חדש.
  5. להוסיף 6 מ"ל של מדיום התרבות, חזור על השלב הקודם פעם אחת ולאסוף את המדיום המכיל תאים ניתקו באותו הצינור 13 מ"ל.
  6. תאי צנטריפוגה ב160 גרם במשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend התאים במדיום התרבות בתוספת10% תמהיל הורמון.

.5 נייד ציפוי

  1. ספירת תאים בתרחיף בתא Malassez ולהתאים את עוצמת הקול של מדיום לריכוז של 600,000 תאים / מ"ל. ניתן להשיג בסביבות 1,700,000 תאים מmesencephalon עכבר אחד.
  2. הסר FBS המכיל מדיום ציפוי מ24 גם צלחות ולהוסיף בכל טוב 1 מ"ל של השעיה תא (600,000 תאים / היטב, 2-4% מTH + תאים).
  3. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2/95% אוויר. אין שינוי מדיום הוא הכרחי. נוירונים דופאמין בשלים לאחר סביב 5-7 ימים במבחנה (ביטוי עקבי של טרנספורטר דופאמין). שמור את התאים בתרבית עד 15 ימים ללא החלפה בינונית.

פרוטוקול .6 Immunofluorescence

  1. ניקוי של Coverslips
    1. היום לפני הנתיחה, להוסיף 10 מ"ל של 1 M HCl לתוך צלחת פטרי. הנח על פני השטח של coverslips הזכוכית הנוזלי 12-15 ולחכות 15 דקות.
    2. לשקוע הכיסוילהחליק לתוך הנוזל והמתן 15 דקות.
    3. הסר HCl ולשטוף 3x עם מים.
    4. שטוף את coverslips במהירות עם אתנול טהור פעם אחת, ולאחר מכן להוסיף אתנול טהור למאכל ולחכות 30 דקות.
    5. מתחת למכסה המנוע, להסיר coverslips ניקה מאתנול ולהוסיף coverslip 1 לכל טוב של צלחת תרבית תאי 12 גם באמצעות מלקחיים מעוקרים.
    6. לשטוף coverslips פעמיים עם מים סטריליים (1 מ"ל / טוב). לאחר מכן, לשטוף אותם פעם עם PBS סטרילי.
  2. ציפוי של Coverslips
    1. הסר PBS ולהוסיף 500 μl / גם של 2x אש"ף (בדילול מלא PBS). דגירה של 4 שעות ב 37 ° C בחממת CO 2.
    2. הסר את פתרון אש"ף ולשטוף 3x עם PBS סטרילי.
    3. הסר PBS ולהוסיף 500 μl / גם של 20 iFBS% / 1 גר '/ מ"ל ​​Laminin. דגירה הלילה בשעה 37 ° C בחממת CO 2.
  3. ציפוי התאים לImmunofluorescence
    1. הסר בינוני ציפוי מ12 גם צלחות.
    2. הוספת 900,000 תאים / היטב ב2 מ"ל נפח ולגדל את התאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה. יכולים להיות כל הזמן תאים בתרבית עד 15 ימים ללא החלפה בינונית.
  4. Immunostaining
    1. הסר בינוני מ12 גם צלחות ולשטוף עם 500 μl / גם DMEM שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס.
    2. הוסף 500 μl / גם של DMEM שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף paraformaldehyde עדינות 160 μl / גם של 8% (PFA, 2% ריכוז סופי) ודגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
    3. הסר PFA ולשטוף 3x עם PBS / 0.1 M גליצין עבור 10 דקות.
    4. הסר PBS, להוסיף / טוב של PBS / 0.05% טריטון X-100/20% בסרום עיזים 300 μl ודגירת 30 דקות בטמפרטורת חדר.
    5. הסר בינוני, להוסיף טריטון X-100/1% בסרום עיזים 300 μl / גם של נוגדן הראשוני מדולל PBS / 0.05% ודגירה של 2 שעות בטמפרטורת חדר. נוגדנים עיקריים שיכול לשמש לזיהוי של נוירונים דופאמין ואפיון של התרבות מצוינים בטבלת חומרים. שמור1 גם בלי נוגדן ראשוני על מנת להעריך לרקע של הנוגדנים משני השונים.
    6. הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS / 0.2% ג'לטין עבור 10 דקות.
    7. הסר בינוני, להוסיף טריטון X-100/1% בסרום עיזים 300 μl / גם של נוגדנים משני בדילול המלא PBS / 0.05% ודגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, בחושך. נוגדנים משני המשמשים מצוינים בטבלת חומרים.
    8. הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS / 0.2% ג'לטין עבור 10 דקות.
    9. הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS.
    10. הר coverslips בצד תא שקופיות זכוכית למטה בירידה של Vectashield. שמור את השקופיות בלילה טמפרטורת חדר כדי לתת לי בינונית יבש ההרכבה, לאחר מכן לאחסן אותם ב 4 ° C..
    11. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal או מיקרוסקופ שלב בניגוד מצויד לepifluorescence. נציג תמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ confocal לייקה SP2 UV.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תרשים זרימה מאוירת של צעדי תרבות mesencephalon מוצג באיור 1. בקצרה, לאחר איסוף עוברי E13.5 מעכבר שוויצרי בהריון, mesencephalon הגחון הוא גזור מכל העובר. שברי המוח המבודדים הם ברציפות שהוגשו לעיכול אנזימטי וניתוק מכאני. תאים ניתקים הם pelleted על ידי צנטריפוגה, resuspended במדיום התרבות ומצופה בלוחות 12- או 24 גם מצופה מראש. תאים נשמרים עד 15 ימים ללא החלפה בינונית.

תרשים מפורט זרימה של נתיחת mese...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מציג את הנהלים וחומרים כימיים הדרושים כדי להכין את התרבות העיקרית של נוירונים mesencephalic מהעכבר העוברי והליך immunofluorescence לזהות נוירונים דופאמין. שלבים קריטיים של ההליך הם לנתיחה של העוברים והניתוק המכני של שברי המוח שנאספו. מכשירים לנתיחה באיכות גבוהים מסייע להשתלט על הטכניקה לנתיחה. נוירונים DA מהווים חלק קטן מmesencephalon. בהתאם לכך, איסוף החלק הימני של mesencephalon הגחון הוא חיוני להשגת תרבות המכילה 2-4% מתאי עצב DA. ניתוק מכאני צריך להתבצע בזהירות ובעדי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

נתמך על ידי מענקים מ-CNRS ו-INSERM. ראש הממשלה מכיר בתמיכת הקרן למחקר רפואי בצרפת (Equipe FRM 2009). SC מודה על תמיכתה של הקרן הצרפתית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סרום בקר עוברילונזה14-801F
DMEM 4.5 גרם/ליטר גלוקוז עם L-גלוטמיןלונזהBE12-604F
0.05% טריפסין-EDTA (1x), פנול אדוםLife Technologies25300-054
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)Life Technologies15140122
L-גלוטמין, תמיסה של 200 מ"מLife Technologies
Dulbecco' s פוספט חוצץ מלחSigma-Aldrich D8537
דולבקו s Modified Eagle' s תערובת בינונית/תזונתית F-12 חזירסיגמא-אולדריץ' D0547אבקת
למינין - 1 מ"ג/מ"ל ב-Tris buffered NaClSigma-Aldrich L2020
פולי-L-אורניתין הידרוברומידסיגמא-אולדריץ' P3655
אינסולין מלבלב חזירSigma-Aldrich I5523
apo-Transferrin HumanSigma-Aldrich T1147
פוטרסין דיהידרוכלורידסיגמא-אולדריץ' P5780
פרוגסטרוןסיגמא-אולדריץ' P8783
נתרן סלניטסיגמא-אולדריץ' S5261
HEPESסיגמא-אולדריץ' H4034 
גליציןסיגמא-אולדריץ' G7126תמיסת מלאי 1 M במים
ג'לטיןסיגמא-אולדריץ' G9391תמיסת מלאי 2% (w/v) במים
Triton X-100Sigma-Aldrich T8532
Paraformaldehyde 16% במיםמדעי מיקרוסקופ אלקטרוניםRT 15710-S
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)Merck Millipore106329
D(+)-גלוקוז, מונוהידראטMerck Millipore4074-2
חומצה הידרוכלורית - c(HCl) = 1 מול/ליטר (1 N) TitripurMerck Millipore109057
מים סטריליים - Aqua B.Braun
אתנול מוחלט NORMAPUR מגיב אנליטיVWR20821.321
צלחות פטרי סטריליותVWR82050-566
פיפטות פסטר זכוכית רגילה - Wilhem Ulbrich GdbR.VWR612-2297
תא ספירה MalassezVWR631-0975
מסנן מזרק Acrodisc סרום עם קרום Supor, סטרילי, GF/0.2 ומיקרו; m, 37 מ"מPALL Life science4525
מספריים כירורגיים - ישרים, חדים-חדים, באורך 14.5 ס"מFine Science Tools14002-14לפתיחת דופן הבטן
מספריים - ישרים, מחודדים, עדינים, באורך 10 ס"מMORIA4877Aלפתיחת דופן הרחם
מלקחיים - לסתות מעוקלות, רגילות, משוננות 1 מ"מMORIA2183למניפולציה של עוברים
Vannas מספריים - מעוגלים, מחודדים, 7 מ"מMORIAMC50להוצאת מלקחיים עדינים במיוחד של mesencephalon
- מעוקל, עדין, באורך 13 ס"מMORIA9987להסרת קרומי המוח
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell PlatesBD Bioscience356414
BD Falcon 12 בארות צלחת תרבית תאים, תחתית שטוחה עם מכסהBD Bioscience353043
שקופיות מיקרוסקופ SuperFrost, קצוות קרקע 90ºמנזל-GL ואומל; משקפי כיסוי מדויק SERAG00008032E
עובי מס' 1.5H עגול 18 מ"מ ØMARIENFELD117580
ארנב פוליקלונלי חלבון הקשור למיקרו-צינוריות 2 (MAP2) נוגדןChemicon MilliporeAB56221/200
נוגדן חד-שבטי נגד גלוטמט דקרבוקסילאז (GAD67), שיבוט 1G10.2Chemicon MilliporeMAB54061/400
נוגדן נגד טרנספורטר נגד דופמין (DAT) חולדה חד-שבטית, שיבוט DAT-Nt Chemicon MilliporeMAB3691/500
נוגדןעכבר 1/8,000 - מתנה נדיבה מאיב צ'רניי (שוויץ, Yves.Charnay@hcuge.ch)
סרום עיזים, ניו זילנד OriginLife Technologies16210-064
Alexa Fluor 405 עיזים נגד ארנב IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA-315561/200
Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA-110011/1,000
Alexa Fluor 594 עז נגד חולדות IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA-110071/1,000
VECTASHIELD HardSet הרכבה MediumVector LaboratoriesH-1400
סטריאומיקרוסקופקרל זייס מיקרוסקופיהStemi-2000C
מבער בונסן FIREBOYפולקסווגן451-0136
25030123 להבים חד-שבטי נגד 5-HT

מקורות

  1. Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
  2. Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
  3. Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
  4. Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
  5. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  6. Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
  7. Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson's disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
  8. Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
  9. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
  10. Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
  11. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
  12. Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
  13. Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
  14. Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
  15. Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson's disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
  16. di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
  17. Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
  18. Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
  19. Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
  20. Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
  21. Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
  22. Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
  23. Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
  24. Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
  25. Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
  26. Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
  27. Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
  28. Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
  29. Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
  30. Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  31. Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
  32. Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
  33. Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
  34. Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
  35. Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
  36. Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מוח עכבר עוברידיסקציה של המוח האמצעי (Mesencephalon)פירוק אנזימטיפירוק מכניצביעה אימונופלואורסצנטיתטירוזין הידרוקסילאזזריעת תאיםמצע תרבית
יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.