Abstract
נוירונים דופאמין מהווים פחות מ -1% מהמספר הכולל של תאי עצב במוח. סכום זה נמוך של תאי עצב מווסת את תפקודי מוח חשובים כגון שליטה מוטורית, מוטיבציה, וזיכרון עבודה. נוירונים דופאמין Nigrostriatal להידרדר באופן סלקטיבי במחלת פרקינסון (PD). איבוד עצבי מתקדם זה קשור באופן חד משמעי עם הסימפטומים מנועים של פתולוגיה (bradykinesia, רעד במנוחה, נוקשות שרירים ו). הסוכן העיקרי האחראי לניוון תא עצב דופאמין הוא עדיין לא ידוע. עם זאת, נוירונים אלה מופיעים להיות מאוד פגיעים בתנאים מגוונים. תרבויות עיקריות מהוות אחד המודלים הרלוונטיים ביותר לחקור תכונות ומאפיינים של נוירונים דופאמין. ניתן להגיש תרבויות אלה לסוכני מתח שונים המחקים פתולוגיה PD ותרכובות הגנה עצביות על מנת לעצור או להאט את הניוון עצבי. מודלים רבים מהונדסים העכבר של PD כי כבר generated בעשור האחרון גדל עוד יותר את האינטרס של חוקרים לתרבויות נוירון דופאמין. הנה, פרוטוקול הווידאו מתמקד בנתיחה העדינה של מוח עכבר העוברי. כריתה מדויקת של mesencephalon הגחון היא חיונית כדי להשיג תרבויות עצביות מספיק עשירות בתאי דופאמין כדי לאפשר מחקרים עוקבים. פרוטוקול זה יכול להתממש עם עכברים הטרנסגניים עובריים ומתאים לצביעת immunofluorescence, PCR כמותי, כימות שליח שני, או הערכת מוות / הישרדות עצבית.
Introduction
דופמין, אחד מהמוליכים העצביים במוח החיוני 1,2, בעיקר שפורסם על ידי דופאמין המוח התיכון הנוירונים (DA). רוב הנוירונים DA מתגוררים בחלק הגחוני של mesencephalon 2-6. סכמטי, ניתן לחלק את תאי עצב DA המוח התיכון בשלוש מבחינה אנטומית ותפקודי של מערכות שונות הקרנה: mesostriatal, mesolimbic, ומסלולי mesocortical 2,5. מסלול nigrostriatal מעורב במנוע התנהגות, מסלולי mesolimbic לשחק תפקיד חשוב בחיזוק, מוטיבציה, ולמידה, ואילו מסלולי דופאמין מקרינים לקליפת מוח הקדם חזיתית הם מעורבים בקוגניציה 2.
נוירונים DA מעורבים בכמה הפרעות נוירולוגיות אדם כמו סכיזופרניה, קשב וריכוז, הפרעת פעילות יתר, והמחלה (PD) פרקינסון 2,4. PD מתאפיין בניוון מתקדם וסלקטיבי של תאי עצב DA חיבור nigra substantiacompacta Pars (SNC) לסטריאטום. הפסד של תוצאות נוירונים DA Nigro-striatal בדלדול הדופמין החמור בסטריאטום, כי הוא אחראי לתסמינים המוטוריים של מחלת הפרקינסון (bradykinesia, רעד במנוחה, נוקשות) 7. הגורם הראשוני לPD אידיופטית לא הוקם והטיפולים הנוכחיים הם רק סימפטום, במטרה להחזיר את רמת הדופמין בסטריאטום. התרופה המומלצת ביותר היא L-דופא (Levodopa), המבשר הטבעי של דופמין. למרות שהממשל של Levodopa מפצה על האובדן של דופאמין למשך פרק זמן מסוים, סיבוכים מוטוריים להתרחש לאחר טיפולים ארוכי טווח (dyskinesia והפעלה / כיבוי מדינות) 8,9.
מחקר על נוירונים דופאמין ופ"ד הוא בהתקדמות מתמדת ומאמצים אינטנסיביים נעשים כדי לפתח טיפולים הבוסס על השתלת תאים, ריפוי גנטי, או סוכני הגנה עצביים 10,11. עם זאת, נושא מרכזי נשאר לא הובהר: מה הוא הגורם של vulnerab הקיצוניility של נוירונים DA? ניתן למצוא חלק מהתשובה בפעילות של תאי עצב DA. נראית ירידה בפעילות החשמלית ושל הרגישות של תאי עצב DA כדי להגדיל את נטייתם להידרדר 12. אף על פי כן, את המורכבות של הפתוגנזה פ"ד דורשים מחקרים נוספים על מנת לזהות את המנגנונים מעורבים בDA נוירונים ניוון 13-15.
תרבויות עיקריות רלוונטיות במיוחד ללמוד תכונות תא עצב DA 16-19 ולקרוא תיגר על הנוירונים האלה ללחצים שונים להערכה של סוכני הגנה עצביים 20-24. מודלים תרבות עכברוש משמשים בתדירות הגבוהה ביותר, כפי שהנתיחה של mesencephalon עובר עכברוש היא קלה יותר, בהשוואה לעכבר, וניתן לקבל כמויות גדולות יותר של תאי עצב בחולדות. עם זאת, דור של דגמי עכבר מהונדסים של המחלה 25 יש מידה ניכרת הגדיל את האינטרס של קהילת מדען המוח לתרבויות עיקריות מהעכבר 26-29. למרות שתרבויות יחסי ציבורepared מבעלי חיים שזה עתה נולדו יכול לשמש, עדיף להכין אותם מעוברים בשלב שלאחר mitotic (E13.5 לנוירונים mesencephalon), כאשר נוירונים שמרו היכולת שלהם להבחין. הפרוטוקול הבא מציג נוירונים mesencephalon מבודדים בתרבות העיקרית מעוברי עכברים (E13.5), שהם קשים ביותר להכנה. יש לציין, אנו מספקים פרוטוקול באמצעות מדיום סרום ללא תרבות לשחזור טוב יותר. שני השלבים הקריטיים ביותר בהכנת התרבות (לנתיחה וניתוק מכאני) שיפורטו בזהירות בווידאו קשור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
העכברים המשמשים בעבודה זו טופלו ויטופלו בהתאם להנחיות של מועצת האיחוד האירופית (86/609 / איחוד אירופי) לשימוש בחיות מעבדה.
.1 הכנת פתרונות הנדרשים
- פתרונות מניות
- פתרון 10x פולי-L-ornithine (אש"ף): לשקול את 10 מ"ג hydrobromide אש"ף (משקל מולקולרי = 30,000-70,000) ולפזר ב70 מ"ל של מים סטריליים. סנן את הפתרון באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן מזרק, aliquot, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
- 30% פתרון גלוקוז: לשקול את 30 גרם של D (+) - גלוקוז ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ"ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C..
- בינוני של 5x השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) / תערובת מזין F-12 חם: לשקול את 6 גרם של אבקת DMEM / F-12 חם ומתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ"ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C..
- 7.5% סודיום ביקרבונט (NaHCO 3) Solutiב: לשקול את 7.5 גרם של NaHCO 3 ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ"ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C..
- 1 M HEPES פתרון: לשקול את 23.8 גרם של HEPES ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ"ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C..
- אתנול 70% (v / v): לדלל 70 מ"ל של אתנול מוחלט עם 30 מ"ל של מים סטריליים.
- בופר פוספט עם גלוקוז ואנטיביוטיקה (PBS-GAB): להוסיף 10 מ"ל של 30% פתרון גלוקוז ו5 מ"ל של תמיסת פניצילין, סטרפטומיצין 500 מ"ל של בופר פוספט של Dulbecco. חנות ב 4 ° C..
- מומת בסרום שור עוברי (iFBS): להפשיר בסרום שור הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס ולהשבית ב56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. Aliquot לתוך 50 מ"ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
- תרבות בינונית: במים סטריליים, לערבב ברציפות 40 מ"ל של 5x DMEM / F12-שינקין, 1 מ"ל של 1 M HEPES, 2 מ"ל של 200 מ"מ L-גלוטמין, 2 מ"ל של פניצילין, סטרפטומיצין, 4 מ"ל של 30% גלוקוזnd 3 מ"ל של .7.5% NaHCO 3 עד נפח סופי של 180 מ"ל. לסנן ולהשתמש באותו היום.
- ההורמון Mix
- הכן 180 מ"ל של מדיום התרבות. לפזר 200 מ"ג של apo-transferrin במדיום זה.
- לשקול את 50 מ"ג של אינסולין ולהתמוסס ב2 מ"ל של 0.1 M HCl. לאט להוסיף 8 מ"ל של מים סטריליים תוך ערבוב בעדינות. לדלל את הפתרון הזה במדיום התרבות.
- לשקול את 19.3 מ"ג של Putrescine dihydrochloride ולהתמוסס ב10 מ"ל של מים סטריליים. מוסיף את הפתרון 10 מ"ל לתערובת ההורמון.
- הכן פתרון 3 מ"מ selenite נתרן במים סטריליים ופתרון פרוגסטרון 2 מ"מ באתנול מוחלט. הוסף 20 μl של כל פתרון לתערובת ההורמון.
- סנן את תערובת ההורמון, aliquot לתוך 10 מ"ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
2 הכנת פלטות תרבות ומכשירים
- FBS ציפוי של צלחות התרבות: היום לפני הנתיחה, להכין 180 מ"ל של מדיום התרבות. הוסף 10 מ"ל שלiFBS 90 מ"ל של מדיום התרבות. הוסף 300 μl / גם של מדיום התרבות / 10 iFBS% ל24 גם צלחות Precoated פולי-D-ליזין. דגירה הלילה בשעה 37 C °. אחסן את המדיה שנותרה (עם ובלי iFBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
- לעקר את המכשירים וטפטפות פסטר. אסוף את הציוד מפורט בטבלת חומרים, כמו גם זרימה למינרית Class II וCO 2 באינקובטור.
.3 Dissection של העכבר mesencephalon
- להקריב את העכבר בהריון E13.5 (על פי הנחיות מוסדיות). נקה את הבטן של העכבר עם 70% אתנול ולפתוח את קיר הבטן. לאסוף את קרן הרחם, לפתוח אותם באמצעות מספריים עדינים, לנתח כל עובר מקרני הרחם, ולהסיר את הקרומים מי השפיר. מניחים את העוברים בצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה PBS-GAB סטרילי ולשטוף אותם על ידי העברה ב3 אמבטיות זהות רצופות באמצעות מלקחיים. לנתיחה, למקם את העוברים על ידי 3 בצלחת פטרי סטרילית 60 מ"מ.
- Movדואר צלחת פטרי הסופי תחת סטראו. אל לערוף את העוברים. בעזרת המספריים Vannas, תחתוך את המוח.
- מוציא בזהירות ולבטל את האזורים הקדמיים והמוח אחוריים. לצד מקורי, לחתוך קרוב לאזור התלמוס, לצד קיצוץ הזנב באזור המצר, להסיר את colliculus מעולה.
- ברגע שמוח תיכון הגחון מבודד, להסיר בזהירות קרומי המוח באמצעות מלקחיים יפים במיוחד. לאסוף קטעים גזורים, ללא קרומי המוח, בצינור 13 מ"ל סטרילי המלא PBS-GAB.
- נקה את הצינור המכיל mesencephala ביסודיות עם אתנול 70% ולהביא אותו מתחת למכסת המנוע.
דיסוציאציה .4 הסלולרי
- לשטוף mesencephala 3x עם PBS-GAB סטרילי. לאפשר שברי המוח ליישב בין כל שטיפה ולהימנע מלשבש את הרקמה. לאחר לשטוף האחרון, להסיר בזהירות רב כפתרון שאפשר לדגור מגזרי מוח ב 3 מ"ל של טריפסין / EDTA ל15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור.
- אש פולנית טפטפות פסטר על מנת למקסם את ההישרדות של תאי העצב כמו הסוף של pipet זכוכית שאינה מלוטשת היא חד ויכולה לגרום נזק לתאים במהלך שלבי הניתוק. מעט להפחית את קוטר הגפיים (עד 0.5 מ"מ) של פיפטה פסטר תוך אש וליטוש לזה.
- מוציא בזהירות כמה שפתרון / EDTA טריפסין ככל האפשר ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום התרבות / 10 iFBS%. מגזרי המוח לשטוף 3x עם iFBS מדיום התרבות / 10%.
- באמצעות פיפטה פסטר האש מלוטשת, מתחיל ניתוק של mesencephala ב6 מ"ל של מדיום התרבות / 10 iFBS%. Triturate 10x (למנוע בועות אוויר), לאפשר לנתחים להתיישב, ואז לאסוף את המדיום בצינור מ"ל 13 סטרילי חדש.
- להוסיף 6 מ"ל של מדיום התרבות, חזור על השלב הקודם פעם אחת ולאסוף את המדיום המכיל תאים ניתקו באותו הצינור 13 מ"ל.
- תאי צנטריפוגה ב160 גרם במשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend התאים במדיום התרבות בתוספת10% תמהיל הורמון.
.5 נייד ציפוי
- ספירת תאים בתרחיף בתא Malassez ולהתאים את עוצמת הקול של מדיום לריכוז של 600,000 תאים / מ"ל. ניתן להשיג בסביבות 1,700,000 תאים מmesencephalon עכבר אחד.
- הסר FBS המכיל מדיום ציפוי מ24 גם צלחות ולהוסיף בכל טוב 1 מ"ל של השעיה תא (600,000 תאים / היטב, 2-4% מTH + תאים).
- דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2/95% אוויר. אין שינוי מדיום הוא הכרחי. נוירונים דופאמין בשלים לאחר סביב 5-7 ימים במבחנה (ביטוי עקבי של טרנספורטר דופאמין). שמור את התאים בתרבית עד 15 ימים ללא החלפה בינונית.
פרוטוקול .6 Immunofluorescence
- ניקוי של Coverslips
- היום לפני הנתיחה, להוסיף 10 מ"ל של 1 M HCl לתוך צלחת פטרי. הנח על פני השטח של coverslips הזכוכית הנוזלי 12-15 ולחכות 15 דקות.
- לשקוע הכיסוילהחליק לתוך הנוזל והמתן 15 דקות.
- הסר HCl ולשטוף 3x עם מים.
- שטוף את coverslips במהירות עם אתנול טהור פעם אחת, ולאחר מכן להוסיף אתנול טהור למאכל ולחכות 30 דקות.
- מתחת למכסה המנוע, להסיר coverslips ניקה מאתנול ולהוסיף coverslip 1 לכל טוב של צלחת תרבית תאי 12 גם באמצעות מלקחיים מעוקרים.
- לשטוף coverslips פעמיים עם מים סטריליים (1 מ"ל / טוב). לאחר מכן, לשטוף אותם פעם עם PBS סטרילי.
- ציפוי של Coverslips
- הסר PBS ולהוסיף 500 μl / גם של 2x אש"ף (בדילול מלא PBS). דגירה של 4 שעות ב 37 ° C בחממת CO 2.
- הסר את פתרון אש"ף ולשטוף 3x עם PBS סטרילי.
- הסר PBS ולהוסיף 500 μl / גם של 20 iFBS% / 1 גר '/ מ"ל Laminin. דגירה הלילה בשעה 37 ° C בחממת CO 2.
- ציפוי התאים לImmunofluorescence
- הסר בינוני ציפוי מ12 גם צלחות.
- הוספת 900,000 תאים / היטב ב2 מ"ל נפח ולגדל את התאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה. יכולים להיות כל הזמן תאים בתרבית עד 15 ימים ללא החלפה בינונית.
- Immunostaining
- הסר בינוני מ12 גם צלחות ולשטוף עם 500 μl / גם DMEM שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף 500 μl / גם של DMEM שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף paraformaldehyde עדינות 160 μl / גם של 8% (PFA, 2% ריכוז סופי) ודגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- הסר PFA ולשטוף 3x עם PBS / 0.1 M גליצין עבור 10 דקות.
- הסר PBS, להוסיף / טוב של PBS / 0.05% טריטון X-100/20% בסרום עיזים 300 μl ודגירת 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- הסר בינוני, להוסיף טריטון X-100/1% בסרום עיזים 300 μl / גם של נוגדן הראשוני מדולל PBS / 0.05% ודגירה של 2 שעות בטמפרטורת חדר. נוגדנים עיקריים שיכול לשמש לזיהוי של נוירונים דופאמין ואפיון של התרבות מצוינים בטבלת חומרים. שמור1 גם בלי נוגדן ראשוני על מנת להעריך לרקע של הנוגדנים משני השונים.
- הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS / 0.2% ג'לטין עבור 10 דקות.
- הסר בינוני, להוסיף טריטון X-100/1% בסרום עיזים 300 μl / גם של נוגדנים משני בדילול המלא PBS / 0.05% ודגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, בחושך. נוגדנים משני המשמשים מצוינים בטבלת חומרים.
- הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS / 0.2% ג'לטין עבור 10 דקות.
- הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS.
- הר coverslips בצד תא שקופיות זכוכית למטה בירידה של Vectashield. שמור את השקופיות בלילה טמפרטורת חדר כדי לתת לי בינונית יבש ההרכבה, לאחר מכן לאחסן אותם ב 4 ° C..
- לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal או מיקרוסקופ שלב בניגוד מצויד לepifluorescence. נציג תמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ confocal לייקה SP2 UV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרשים זרימה מאוירת של צעדי תרבות mesencephalon מוצג באיור 1. בקצרה, לאחר איסוף עוברי E13.5 מעכבר שוויצרי בהריון, mesencephalon הגחון הוא גזור מכל העובר. שברי המוח המבודדים הם ברציפות שהוגשו לעיכול אנזימטי וניתוק מכאני. תאים ניתקים הם pelleted על ידי צנטריפוגה, resuspended במדיום התרבות ומצופה בלוחות 12- או 24 גם מצופה מראש. תאים נשמרים עד 15 ימים ללא החלפה בינונית.
תרשים מפורט זרימה של נתיחת mesencephalon הגחון, המתאים לצעד 3.2, מוצג באיור 2. קווים אדומים מקווקווים מציינים 3 קווי החיתוך עיקריים בייצוג סכמטי של מוח עכבר E13.5 (עיבוד et Prestoz אל. 30) ו צעדי קיצוץ מומחשים.
בניגוד שלב תמונות של התרבות לאחר 1, 4, ו -7 ימים בvitro (DIV) מוצג באיור 3. נוירונים לפתח במהירות הרחבות ו( איור 3 א) הנבטה. מסעף והשלכות יותר מורחבות בDIV4 וDIV7 (איורים 3 ב-C3).
נוירונים דופאמין מזוהים על ידי immunocytochemistry באמצעות נוגדן anti-TH (איור 4 א). מספר TH + התאים בא לידי ביטוי לכל 2.5 סנטימטר 2 coverslip (איור 4). אין אנו מחווים מספר TH + תאים לכל גם את הצפיפות של תאים היא הרבה יותר גבוהה בגבולות של הפלסטיק המצופה היטב מאשר על coverslip הזכוכית המצופה, שנמצא במרכז בבאר. נוירונים DA (תאי TH +) מייצגים 2-4% מכלל אוכלוסיית התא על coverslip. TH-חיובי תאים (TH +) מופיעים כבר בDIV1 ומספרם עולה במהירות כדי להגיע למקסימום בDIV6.
חלקם היחסי של התאים נבחנים על ידי תיוג immunofluorescence של שנינות תאי DAh נוגדן אנטי DAT (איור 5 א) או נוגדן אנטי-TH (איור 5) והכתמה קשורה של תאים עצביים עם נוגדן אנטי MAP2. immunostaining נציג של כמה אוכלוסיות נוירונים קיימים בתרבות הוא גם מוצג באיור 5. נוירונים GABAergic מוכתמים באמצעות נוגדן אנטי GAD67 (איור 5 ג) ומייצגים 50 סביב% מהתאים. נוירונים serotonergic מזוהים עם נוגדן אנטי סרוטונין (איור 5D) ומהווים פחות מ -1% מהתאים בתרבות. תרבית תאי mesencephalon מכילה גם תאי עצב glutamatergic (40% מהתרבות), נוירונים הכולינרגית, ותאים נדירים גליה (סביב 2-3%). חלקם של תאי גליה נקבע באמצעות מכתים fibrillary גליה חלבון חומצי (GFAP) (איור 5E). זיהוי חד משמעי של נוירונים דופאמין mesencephalon גם יכול להיות מושגת באמצעות סמנים ספציפיים כגון Pitx3 או Foxa2 31,32.
immunostaining הגדלה הגבוה של כמה אוכלוסיות נוירונים קיימים בתרבות מוצג באיור 6. נוירונים דופאמין מזוהים באמצעות נוגדן anti-DAT (איור 6 א). צביעת DAT משקפת מצב הבשלת נוירון DA. DAT ביטוי מתחיל בDIV3-4. נוירונים GABAergic ונוירונים serotonergic מוכתמים באמצעות נוגדן אנטי GAD67 (איור 6) או נוגדן אנטי סרוטונין (איור 6 ג), בהתאמה.
תרשים איור 1 מאויר זרימה של תרבות mesencephalon. צעדי תרבות עיקריים שצוינו. () להקריב עכבר שוויצרי בהריון, לאסוף עובר E13.5 בצלחות פטרי ולשטוף אותם באמבטיות PBS רצופות. (BC) תחת מיקרוסקופ לנתיחה, דissect הגחון mesencephalon מכל העוברים ומניח אותם בצינור. (D) הוסף טריפסין- EDTA לברי המוח גזור ולעכל על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. (E) הסרת טריפסין, להוסיף סרום בינוני המכילה תרבות ולבצע ניתוק תא מכאני (10 תנועות טחינה דקה, חוזרות ונשנות פעמיים). (F) גלולה התא, resuspend אותם במדיום סרום ללא תוספת הורמונים וצלחת אותם ב12- או 24 גם צלחות precoated. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.
תרשים איור 2 זרימה מפורטת של נתיחת mesencephalon. צעדים לנתיחה ראשי מצוינים. () עובר עכבר בE13.5 לאחר מחדשmoval מקרני הרחם. (ב) בלי עריפת העובר, תחתוך את המוח. ייצוג סכמטי של מוח עכבר העוברי בE13.5 (C). אדום קווים מקווקווים מציינים היכן המוח יש לחתוך לבודד את mesencephalon הגחון (R, קיצוץ מקורי; C, לחתוך זנב; D, חתך הגבי). שלפוחית cephalic telencephalon, diencephalon, mesencephalon, וrhombencephalon מתוחם בכחול, סגול, ורוד, ואפור, בהתאמה. Aq, אמת מים; Hypoth, ההיפותלמוס; LGE, רוממות ganglionic לרוחב; LV, חדר לרוחב; MFB, צרור מוח קדמי המדיאלי; MGE, רוממות ganglionic המדיאלי; sc, colliculus מעולה; Thal, התלמוס; VM, mesencephalon הגחון; 4V, החדר הרביעי (עיבוד 30). (ד ') לקיצוץ קווים מסומנים על ידי קווים מקווקווים אדומים במוח עכבר E13.5. מוח (E) עכבר לאחר הסרת האזורים הקדמיים והמוח אחוריים (כלומר, לאחר R החתך). מוח (F) עכבר לאחר הסרת superior colliculus (כלומר, לאחר R החתכים וD). (G) יכול לצפות בגחון של mesencephalon מבודד (כלומר, לאחר חותך R, C, D). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 ניגוד שלב תמונות של התרבות בשלבים שונים של פיתוח. () DIV1, (ב) DIV4, ותמונות (C) DIV7 של אותה התרבות מוצגים. תמונות נרכשו על תאי חיים עם מיקרוסקופ הפוכה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
צביעת איור 4 טירוזין hydroxylase של נוירונים דופאמין. (א) בDIV8, תאי עצב DA התגלו באמצעות נוגדן אנטי-TH. התגלות בוצעה באמצעות ערכה 3,3'-diaminobenzidine (DAB). התמונה נרכשה עם מיקרוסקופ הפוכה. מספר (B) של TH + הנוירונים בתרביות mesencephalon כפונקציה של הגיל של התרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 שיעור נציג של נוירונים והאסטרוציטים בתרבות. בDIV4, תאי עצב DA (במגנט) התגלה באמצעות אנטי DAT (A) או אנטי-Tנוגדן H (B) ונוירונים GABAergic, נוירונים serotonergic והאסטרוציטים (במגנט) התגלו באמצעות אנטי GAD67 (C), אנטי סרוטונין (ד '), ונוגדנים נגד GFAP (E), בהתאמה. תאים עצביים (בציאן) הוכתמו נוגדן אנטי MAP2 (AE). תמונות נרכשו במיקרוסקופ הפוכה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6 מכתים נציג של כמה אוכלוסיות תאים של תרבות mesencephalon. נוירון דופאמין () זוהה על ידי צביעת DAT בDIV9 (באדום). (ב) נוירונים GABAergic דמיינו ידי GAD-67 צביעה בDIV9 (בירוק).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מציג את הנהלים וחומרים כימיים הדרושים כדי להכין את התרבות העיקרית של נוירונים mesencephalic מהעכבר העוברי והליך immunofluorescence לזהות נוירונים דופאמין. שלבים קריטיים של ההליך הם לנתיחה של העוברים והניתוק המכני של שברי המוח שנאספו. מכשירים לנתיחה באיכות גבוהים מסייע להשתלט על הטכניקה לנתיחה. נוירונים DA מהווים חלק קטן מmesencephalon. בהתאם לכך, איסוף החלק הימני של mesencephalon הגחון הוא חיוני להשגת תרבות המכילה 2-4% מתאי עצב DA. ניתוק מכאני צריך להתבצע בזהירות ובעדינות. אם התרבות מכילה צבירים של תאי עצב ניתק שאינם, להוסיף עוד צעדי טחינה דקה או שניים.
פרוטוקול זה משתמש בינוני סרום ללא לתרבות נוירון. עם זאת, ציפוי עם סרום יש צורך לשפר את הקובץ המצורף של התאים. תמהיל הורמון, המחליף את serאממ, מוגדר כדי לאפשר צמיחת נוירון וכדי למזער את הישרדות תאי גלייה ושגשוגם. כתוצאה מכך, תאים שאינם עצביים מייצגים סביב 2-3% מהתרבות (כימות באמצעות GFAP מכתים). לחלופין, ניתן לגדל התרבויות בנוכחות הסרום עם התוספת, שני ימים לאחר הזריעה, של ציטוזין-β-D-arabinofuranoside (Ara-C, 5-8 מיקרומטר) כדי לדכא את ההתפשטות של תאי גליה 26. חלופה נוספת לתערובת ההורמון היא השימוש באמצעי תקשורת ותוספים 29 מוגדרים.
טכניקה זו מתאימה לביצוע מכתים immunofluorescence, PCR כמותי, כימות שליח שני וסוגים שונים של מסכי רעלים / הישרדות. זה צריך להיות גם אפשרי לבצע מחקרי אלקטרו בהכנות אלה 33,34. תרבויות אלה יכולים לזהות מולקולות הגנה עצביות מראש מועמד ולעזור לאפיין תכונות תאי עצב DA, תוך מזעור מספר בעלי החיים המשמשים. עם זאת, fiאישור סופי באמצעות מודלי vivo מתבקש, כנוירונים בתרבית אינם מקבלים תשומות מאזורים אחרים במוח, אשר עשוי מאוד להשפיע ההתבגרות שלהם.
לא נעשה שימוש בטכניקה זו באופן נרחב, בהשוואה למודלי תרבות חולדה, למרות התיאורים הראשונים שלה בתחילת שנות השמונים 16,17. חוסר תמונות המציגות את הנתיחה העדינה עשוי לרסן את החוקרים לפתח מודל תרבות העכבר הזה. עם זאת, בשל הדור של דגמי עכבר מהונדסים רבים של הפרעות ניווניות 25 עם פסילת גן ספציפית או תיוג של סוגים ספציפיים של תאי עצב, תרבויות נוירון DA מעכבר נמצאות כעת עניין רב.
מאסטרינג טכניקה זו מאפשר למחקר של תאי עצב DA המבודדים מכל סוג של עכבר מהונדס ולחקור את ההפרעות הנגרמות על ידי שינוי גן. יתר על כן, ניתן להשתמש בתרבויות אלה כמודלים התייחסות להשוואה לתאי עצב DA נגזרים מגזע העכברתאים 35 או מתאי גזע pluripotent מושרה 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1 M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water - Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1,000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L.
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K.
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R.
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S.
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
