Culture primaire de souris dopaminergiques neurones
Summary
Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.
Abstract
Les neurones dopaminergiques représentent moins de 1% du nombre total de neurones dans le cerveau. Cette faible quantité de neurones du cerveau régule les fonctions importantes telles que le contrôle moteur, la motivation et la mémoire de travail. Neurones dopaminergiques nigro-strié sélectivement dégénèrent dans la maladie de Parkinson (MP). Cette perte neuronale progressive est sans équivoque associée aux moteurs symptômes de la pathologie (bradykinésie, tremblement de repos, et une rigidité musculaire). Le principal agent responsable de la dégénérescence des neurones dopaminergiques est encore inconnue. Cependant, ces neurones semblent être extrêmement vulnérables dans diverses conditions. Les cultures primaires constituent l'un des modèles les plus pertinents pour étudier les propriétés et les caractéristiques des neurones dopaminergiques. Ces cultures peuvent être soumis à différents agents de stress qui imitent PD pathologie et de composés neuroprotecteurs pour arrêter ou ralentir la dégénérescence neuronale. Les nombreux modèles de souris transgéniques de la MP qui ont été généATED au cours de la dernière décennie a encore augmenté l'intérêt des chercheurs pour les cultures neuronales dopaminergiques. Ici, le protocole vidéo met l'accent sur la dissection fine de cerveaux de souris embryonnaires. Excision précise de mésencéphale ventral est crucial d'obtenir des cultures de neurones suffisamment riches en cellules dopaminergiques pour permettre des études ultérieures. Ce protocole peut être réalisée avec des souris transgéniques embryonnaires et est approprié pour la coloration par immunofluorescence, de PCR quantitative, la quantification de second messager, ou mort neuronale évaluation / de survie.
Introduction
La dopamine, un des neurotransmetteurs du cerveau essentielles 1,2, est surtout rejeté par dopaminergiques du mésencéphale (DA) des neurones. La majorité des neurones dopaminergiques de séjourner dans la partie ventrale du mésencéphale 6.2. Schématiquement, les neurones dopaminergiques du mésencéphale peuvent être divisés en trois anatomiquement et fonctionnellement distinctes des systèmes de projection: mesostriatal, mésolimbique et les voies mésocorticales 2,5. La voie nigro est impliqué dans le comportement moteur, les voies mésolimbiques jouent un rôle important dans le renforcement, la motivation et l'apprentissage, alors que les voies dopaminergiques projetant vers le cortex préfrontal sont impliquées dans la cognition 2.
Neurones dopaminergiques sont impliqués dans plusieurs troubles neurologiques humains tels que la schizophrénie, déficit de l'attention, trouble de l'hyperactivité, et la maladie (le PD) de Parkinson 2,4. PD est caractérisée par une dégénérescence progressive et sélective des neurones dopaminergiques de la substance noire de liaisonpars compacta (SNC) dans le striatum. La perte de nigro-striée DA neurones entraîne un grave appauvrissement de la dopamine dans le striatum qui est responsable des symptômes moteurs de la maladie (bradykinésie, tremblement de repos, et la rigidité) 7. La cause initiale de la MP idiopathique n'a pas été établie et les traitements actuels ne sont symptomatiques, visant à restaurer le niveau de dopamine dans le striatum. Le médicament le plus prescrit est la L-Dopa (lévodopa), le précurseur naturel de la dopamine. Bien que l'administration de lévodopa compense la perte de dopamine pendant un certain temps, des complications motrices surviennent après un traitement de longue durée (dyskinésie et états ON / OFF) 8,9.
La recherche sur les neurones dopaminergiques et PD est en constante progression et les efforts intenses sont déployés pour développer des traitements basés sur la transplantation de cellules, la thérapie génique, ou agents neuroprotecteurs 10,11. Cependant, reste un problème majeur non élucidé: quelle est la cause de l'extrême vulnerabilité des neurones DA? Une partie de la réponse peut être trouvée dans l'activité des neurones dopaminergiques. Une réduction de l'activité électrique et de l'excitabilité des neurones dopaminergiques semblent augmenter leur propension à dégénérer 12. Néanmoins, la complexité du PD pathogénie nécessite d'autres études pour identifier les mécanismes impliqués dans la dégénérescence des neurones DA 13-15.
Les cultures primaires sont particulièrement pertinentes pour l'étude des propriétés des neurones DA 16-19 et de contester ces neurones à différentes contraintes pour l'évaluation des agents neuroprotecteurs 20-24. des modèles de culture de Rat sont le plus souvent utilisés, comme la dissection du mésencéphale embryonnaire de rat est plus facile, par rapport à la souris, et des quantités plus élevées de neurones peuvent être obtenus chez le rat. Toutefois, la production de modèles de souris transgéniques de la maladie 25 a considérablement augmenté l'intérêt de la communauté neuroscientifique pour des cultures primaires de la souris 26-29. Bien que les cultures prepared des animaux nouveau-nés peuvent être utilisés, il est préférable de les préparer à partir d'embryons au stade post-mitotique (E13.5 pour les neurones de mésencéphale), lorsque les neurones ont conservé leur capacité de se différencier. Le protocole ci-dessous présente les neurones de mésencéphale en culture primaire isolés à partir d'embryons de souris (de E13.5), qui sont les plus difficiles à préparer. En particulier, nous fournissons un protocole utilisant un milieu de culture sans sérum pour une meilleure reproductibilité. Les deux étapes les plus critiques dans la préparation de la culture (dissection et dissociation mécanique) seront soigneusement détaillés dans la vidéo associée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole présente les procédures et les réactifs nécessaires à la préparation d'une culture primaire de neurones mésencéphaliques de la souris embryonnaire et la procédure d'immunofluorescence pour détecter les neurones dopaminergiques. Les étapes critiques de la procédure sont la dissection des embryons et la dissociation mécanique des fragments de cerveau prélevés. Instruments de dissection de haute qualité contribue à maîtriser la technique de dissection. Neurones dopaminergiques constit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.
Materials
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-glutamine, 200 mM Solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water – Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri Dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
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