Abstract
Las neuronas dopaminérgicas representan menos del 1% del número total de neuronas en el cerebro. Esta baja cantidad de neuronas regula importantes funciones cerebrales como el control motor, la motivación y la memoria de trabajo. Las neuronas dopaminérgicas nigroestriatal selectivamente degeneran en la enfermedad de Parkinson (PD). Esta pérdida neuronal progresiva está inequívocamente asociada con los síntomas motores de la patología (bradicinesia, temblor en reposo, rigidez muscular y). El principal agente responsable de la degeneración de neuronas dopaminérgicas es aún desconocido. Sin embargo, estas neuronas parecen ser muy vulnerables en diversas condiciones. Los cultivos primarios constituyen uno de los modelos más relevantes para investigar las propiedades y características de las neuronas dopaminérgicas. Estas culturas se pueden enviar a varios agentes de estrés que imitan patología PD y para compuestos neuroprotectores para detener o ralentizar la degeneración neuronal. Los numerosos modelos de ratones transgénicos de PD que han sido generATED durante la última década se incrementó aún más el interés de los investigadores por cultivos de neuronas dopaminérgicas. En este caso, el protocolo de vídeo se centra en la delicada disección de cerebro de ratón embrionarias. La escisión precisa del mesencéfalo ventral es crucial para obtener cultivos neuronales suficientemente ricos en células dopaminérgicas para permitir estudios posteriores. Este protocolo puede ser realizado con ratones transgénicos embrionarias y es adecuado para la tinción de inmunofluorescencia, PCR cuantitativa, la cuantificación segundo mensajero, o la evaluación de la muerte / supervivencia neuronal.
Introduction
La dopamina, uno de los neurotransmisores cerebrales esenciales 1,2, se libera principalmente por dopaminérgicas del cerebro medio (DA), las neuronas. La mayoría de las neuronas DA residen en la parte ventral del mesencéfalo 2-6. Esquemáticamente, las neuronas dopaminérgicas del cerebro medio se pueden dividir en tres anatómica y funcionalmente distintos sistemas de proyección: mesostriatal, mesolímbico y vías mesocorticales 2,5. La vía nigroestriatal está implicado en el comportamiento motor, las vías mesolímbico juegan un papel importante en el refuerzo, la motivación y el aprendizaje, mientras que las vías dopaminérgicas que se proyectan hacia la corteza prefrontal están implicados en la cognición 2.
Neuronas DA están implicados en varios trastornos neurológicos humanos tales como la esquizofrenia, déficit de atención, trastorno de hiperactividad, y la enfermedad de Parkinson (PD) 2,4. PD se caracteriza por una degeneración progresiva y selectiva de las neuronas DA de conexión sustancia negrapars compacta (SNC) a el cuerpo estriado. La pérdida de nigro-estriatal neuronas DA resultados en grave agotamiento de la dopamina en el cuerpo estriado que es responsable de los síntomas motores de la EP (bradicinesia, temblor de reposo, y la rigidez) 7. La causa inicial de la idiopática PD no se ha establecido y los tratamientos actuales sólo son sintomáticos, con el objetivo de restauración del nivel de dopamina en el cuerpo estriado. El fármaco más prescrito es la L-Dopa (Levodopa), el precursor natural de la dopamina. Aunque la administración de levodopa compensa la pérdida de dopamina durante un cierto tiempo, las complicaciones motoras se producen después de los tratamientos a largo plazo (discinesia y estados activado / desactivado) 8,9.
La investigación sobre las neuronas dopaminérgicas y PD está en constante progresión y se están realizando intensos esfuerzos para desarrollar tratamientos basados en el trasplante de células, la terapia génica, o agentes neuroprotectores 10,11. Sin embargo, un problema importante sigue siendo no dilucidado: ¿cuál es la causa de la extrema Vulnerability de neuronas DA? Parte de la respuesta se puede encontrar en la actividad de las neuronas dopaminérgicas. Una reducción en la actividad eléctrica y de la excitabilidad de las neuronas DA parece aumentar su propensión a degenerar 12. Sin embargo, la complejidad de la EP patogénesis requiere más estudios para identificar los mecanismos implicados en la degeneración de neuronas DA 13-15.
Los cultivos primarios son especialmente relevantes para el estudio de las propiedades de las neuronas DA 16-19 y el de impugnar estas neuronas a varios tipos de estrés para la evaluación de agentes neuroprotectores 20-24. Se utilizan más a menudo modelos de cultivo de rata, como la disección de mesencéfalo de embriones de rata es más fácil, en comparación con el ratón, y cantidades más altas de las neuronas se pueden obtener en la rata. Sin embargo, la generación de modelos de ratones transgénicos de la enfermedad 25 ha aumentado considerablemente el interés de la comunidad neurocientífica para cultivos primarios de ratón 26-29. Aunque las culturas prepared de los animales recién nacidos puede ser utilizado, es mejor para prepararlos a partir de embriones en la etapa de post-mitótico (E13.5 para las neuronas de mesencéfalo), cuando las neuronas han conservado su capacidad de diferenciarse. El siguiente protocolo presenta mesencéfalo neuronas aisladas en cultivo primario a partir de embriones de ratón (E13.5), que son los más difíciles de preparar. En particular, se proporciona un protocolo de uso de medio de cultivo libre de suero para una mejor reproducibilidad. Los dos pasos más importantes en la preparación de la cultura (disección y disociación mecánica) se detallan cuidadosamente en el vídeo asociado.
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Protocol
Los ratones utilizados en este trabajo fueron atendidos y manejados de acuerdo con las directrices del Consejo de la Unión Europea (86/609 / UE) para el uso de animales de laboratorio.
1 Preparación de soluciones requeridas
- Soluciones de archivo
- 10x poli-L-ornitina (OLP) Solución: Pesar 10 mg de bromhidrato de PLO (peso molecular = 30,000-70,000) y disolver en 70 ml de agua estéril. Se filtra la solución con 0,2 micras filtro de jeringa, alícuota, y se almacenan a -20 ° C.
- 30% solución de glucosa: pesar 30 g de D (+) - Glucosa y disolver en agua estéril hasta un volumen total de 100 ml. Filtro, alícuota y almacena a 4 º C.
- Medio de Eagle Modificado de 5x Dulbecco (DMEM) / mezcla de nutrientes F-12 de Ham: Pesar de 6 g de polvo de DMEM / F-12 de jamón y disolver en agua estéril hasta un volumen total de 100 ml. Filtro, alícuota y almacena a 4 º C.
- 7,5% de bicarbonato de sodio (NaHCO3) Solutien: Pesar 7,5 g de NaHCO3 y se disuelven en agua estéril hasta un volumen total de 100 ml. Filtro, alícuota y almacena a 4 º C.
- 1 M HEPES Solución: Pesar 23,8 g de HEPES y disolver en agua estéril hasta un volumen total de 100 ml. Filtro, alícuota y almacena a 4 º C.
- 70% (v / v) de etanol: Diluir 70 ml de etanol absoluto con 30 ml de agua estéril.
- PBS con glucosa y antibióticos (PBS-GAB): añadir 10 ml de solución de glucosa al 30% y 5 ml de solución de penicilina-estreptomicina a 500 ml de fosfato de Dulbecco Buffered Saline. Almacenar a 4 ° C.
- Fetal inactivado de suero bovino (IFB): Descongelar de suero bovino durante la noche a 4 ° C e inactivar a 56 ° C durante 30 min. Alícuota en 50 ml y se almacena a -20 ° C.
- Medio de Cultivo: En agua estéril, se mezclan sucesivamente 40 ml de 5x DMEM / F12-Ham, 1 ml de HEPES 1 M, 2 ml de 200 mM de L-glutamina, 2 ml de penicilina-estreptomicina, 4 ml de 30% de glucosa unnd 3 ml de 7.5% de NaHCO3 a un volumen final de 180 ml. Filtrar y utilizar el mismo día.
- Hormona Mix
- Preparar 180 ml de medio de cultivo. Disolver 200 mg de apo-transferrina en este medio.
- Pesar 50 mg de insulina y disolver en 2 ml de HCl 0,1 M. Añadir lentamente 8 ml de agua estéril mientras se mezcla suavemente. Diluir esta solución en el medio de cultivo.
- Pesar 19,3 mg de dihidrocloruro de putrescina y disolver en 10 ml de agua estéril. Añadir la solución de 10 ml a la mezcla de la hormona.
- Preparar una solución de selenito de sodio 3 mM en agua estéril y una solución de progesterona 2 mM en etanol absoluto. Añadir 20 l de cada solución a la mezcla de la hormona.
- Se filtra la mezcla de hormonas, alícuota de 10 ml y se almacena a -20 ° C.
2 Preparación de las placas e instrumentos Cultura
- FBS Recubrimiento de las placas de cultivo: El día antes de la disección, preparar 180 ml de medio de cultivo. Añadir 10 ml deIFB a 90 ml de medio de cultivo. Añadir 300 l / pocillo de medio de cultivo / 10% IFB en precubiertas placas de 24 pocillos de poli-D-lisina. Incubar toda la noche a 37 ° C. Almacenar los residuos de medios (con y sin OFI) a 4 ° C.
- Esterilizar los instrumentos y pipetas Pasteur. Reúna el equipo listado en la tabla de materiales, así como una campana de flujo laminar clase II y una incubadora de CO 2.
3. Disección de Ratón Mesencéfalo
- Sacrificar un ratón embarazada E13.5 (según las directrices institucionales). Limpiar el abdomen del ratón con etanol al 70% y abrir la pared del abdomen. Recoge los cuernos uterinos, abrirlas con unas tijeras delicadas, diseccionar cada embrión de los cuernos uterinos, y quitar las membranas amnióticas. Coloca los embriones en una placa de Petri de 100 mm que contiene PBS estéril-GAB y lavarlos por transferencia en 3 baños idénticos sucesivos utilizando pinzas. Para la disección, colocar los embriones en un 3 en un 60 mm placa de Petri estéril.
- Move el plato final Petri bajo el microscopio estereoscópico. No decapitar a los embriones. Con unas tijeras Vannas, extirpar el cerebro.
- Retire con cuidado y deseche las regiones previsiones y cerebro posterior. Para el lado rostral, cortar cerca de la región talámica, a la corte lateral caudal en la región del istmo, retire el colículo superior.
- Una vez que el cerebro medio ventral está aislado, retire con cuidado meninges utilizando fórceps ultrafinas. Recoge los segmentos disecados, sin las meninges, en un tubo de 13 ml estéril llena de PBS-GAB.
- Limpie el tubo que contiene la mesencephala a fondo con etanol al 70% y ponerla bajo el capó.
Disociación 4. Cell
- Lave mesencephala 3x con PBS estéril-GAB. Permitir fragmentos cerebrales se asienten entre cada lavado y evitar la interrupción del tejido. Después del último lavado, eliminar cuidadosamente como cantidad posible de solución e incubar segmentos cerebrales en 3 ml de tripsina / EDTA durante 15 minutos a 37 ° C en unCO 2 incubadora.
- Fuego-pula las pipetas Pasteur para maximizar la supervivencia de las neuronas como el final de una pipeta de vidrio no pulida es fuerte y puede dañar las células durante las etapas de disociación. Ligeramente reducir el diámetro de la extremidad (hasta 0,5 mm) de la pipeta Pasteur, mientras que el fuego-pulirlo.
- Retire con cuidado tanto / EDTA solución tripsina como sea posible y añadir 10 ml de medio de cultivo / 10% IFB. Segmentos cerebrales Lave 3 veces con medio de cultivo / 10% IFB.
- Usando la pipeta Pasteur pulida al fuego, comience disociación de mesencephala en 6 ml de medio de cultivo / 10% IFB. Triturar 10x (evitar las burbujas de aire), permiten que los trozos se asienten, a continuación, recoger el medio en un nuevo tubo estéril 13 ml.
- Añadir 6 ml de medio de cultivo, repita el paso anterior una vez y recoger el medio que contiene células disociadas en el mismo tubo de 13 ml.
- Centrifugar las células a 160 g durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en medio de cultivo suplementado conMezcla de la hormona 10%.
5. Cell Plating
- Contar las células en suspensión en una célula de Malassez y ajustar el volumen del medio a una concentración de 600.000 células / ml. Alrededor de 1,7 millones de células se pueden obtener de un mesencéfalo ratón.
- Retire que contenía FBS medio de revestimiento de placas de 24 pocillos y añadir en cada pocillo 1 ml de la suspensión celular (600.000 células / pocillo, el 2-4% de las células TH +).
- Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO 2/95% de aire. No es necesario cambio de medio. Las neuronas dopaminérgicas son maduros después de unos 5-7 días in vitro (expresión coherente del transportador de dopamina). Mantener las células en cultivo hasta 15 días sin reemplazo medio.
Protocolo 6. inmunofluorescencia
- Limpieza de las Cubreobjetos
- El día antes de la disección, agregar 10 ml de HCl 1 M en una placa de Petri. Coloque en la superficie de las 12-15 cubreobjetos de vidrio líquido y esperar 15 min.
- Hunde la cubiertacaer en el líquido y esperar 15 min.
- Retire HCl y lavar 3 veces con agua.
- Lavar los cubreobjetos con etanol puro rápidamente una vez, a continuación, añadir etanol puro al plato y esperar 30 min.
- Bajo el capó, retire cubreobjetos limpios a partir de etanol y añadir 1 cubreobjetos por pocillo de una placa de cultivo celular de 12 pocillos usando fórceps esterilizados.
- Lavado cubreobjetos dos veces con agua estéril (1 ml / pocillo). A continuación, lavar una vez con PBS estéril.
- Recubrimiento de los cubreobjetos
- Retirar PBS y añadir 500 l / pocillo de 2x OLP (diluido en PBS). Incubar durante 4 horas a 37 ° C en la incubadora de CO 2.
- Eliminar la solución de la OLP y lavar 3 veces con PBS estéril.
- Retire PBS y añadir 500 l / pocillo de 20% IFB / 1 g / ml laminina. Incubar toda la noche a 37 ° C en la incubadora de CO 2.
- Plating las células para inmunofluorescencia
- Retire medio de revestimiento de placas de 12 pocillos.
- Añadir 900,000 células / pocillo en 2 ml de volumen y hacer crecer las células a 37 ° C en la incubadora. Las células se pueden mantener en cultivo de hasta 15 días sin reemplazo medio.
- La inmunotinción
- Retire medio de placas de 12 pocillos y lavar con 500 l / pocillo DMEM precalentado a 37 ° C.
- Añadir 500 l / pocillo de DMEM precalentado a 37 ° C, a continuación, añadir con cuidado 160 l / pocillo de 8% de paraformaldehído (PFA, concentración final del 2%) y se incuba durante 10 min a 37 ° C.
- Eliminar PFA y lavar 3 veces con PBS / 0,1 M de glicina durante 10 min.
- Retirar PBS, añadir 300 l / pocillo de PBS / 0,05% de Triton X-100/20% de suero de cabra y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
- Retire medio, añadir 300 l / pocillo de anticuerpo primario diluido en PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de suero de cabra y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios que se pueden utilizar para la detección de las neuronas dopaminérgicas y caracterización de la cultura se indican en la Tabla de Materiales. Mantenga1 bien sin anticuerpo primario para evaluar para el fondo de los diferentes anticuerpos secundarios.
- Retire medio y lavar 3 veces con PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos.
- Retire medio, añadir 300 l / pocillo de anticuerpo secundario diluido en PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de suero de cabra y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente, en la oscuridad. Secundaria anticuerpos utilizados se indican en la tabla de Materiales.
- Retire medio y lavar 3 veces con PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos.
- Retire medio y lavar 3 veces con PBS.
- Montar los cubreobjetos en el lado diapositivas celda de vidrio en una gota de VectaShield. Mantenga las diapositivas a temperatura ambiente durante la noche para permitir que el montaje medio seco, y luego almacenarlas a 4 ° C.
- Adquirir imágenes utilizando un microscopio confocal o un microscopio de contraste de fase equipado para epifluorescencia. Imágenes representativas fueron adquiridas con un microscopio confocal Leica SP2 UV.
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Representative Results
Un diagrama de flujo que ilustra los pasos de cultivo mesencéfalo se muestra en la Figura 1. Brevemente, después de la recolección de embriones E13.5 de un ratón suizo embarazada, mesencéfalo ventral se diseca de todo el embrión. Los fragmentos cerebrales aisladas se someten sucesivamente a la digestión enzimática y disociación mecánica. Las células disociadas se sedimentan por centrifugación, se resuspendieron en medio de cultivo y se sembraron en placas de 12 o 24 pocillos pre-revestido. Las células se mantuvieron hasta 15 días sin reemplazo medio.
Un diagrama de flujo detallado de la disección mesencéfalo ventral, que corresponde a la etapa 3.2, se muestra en la Figura 2. Líneas rojas discontinuas indican las principales líneas de corte 3 en una representación esquemática de cerebro de ratón E13.5 (adaptado de Prestoz et al. 30) y medidas de corte se ilustran.
Imágenes de contraste de fase de la cultura después de 1, 4 y 7 días en vitro (DIV) se muestran en la Figura 3. Neuronas desarrollar rápidamente las extensiones y el brote (Figura 3A). Crear ramas y ramificaciones son más extendida en DIV4 y DIV7 (Figuras 3B-3C).
Las neuronas dopaminérgicas son detectadas por inmunocitoquímica utilizando un anticuerpo anti-TH (Figura 4A). El número de células TH + se expresa por cada 2,5 cm 2 cubreobjetos (Figura 4B). No expresamos el número de células TH + así como por la densidad de las células es mucho mayor en las fronteras de la plástica recubierta así que en el portaobjetos de vidrio recubierto, que está en el centro en el pozo. Neuronas DA (células TH +) representan 2.4% del total de la población de células en el portaobjetos. TH-positivo células (TH +) aparecen ya en DIV1 y su número aumenta rápidamente hasta alcanzar un máximo en DIV6.
La proporción relativa de células se evalúa por medio del etiquetado de inmunofluorescencia de células DA ingenioh un anticuerpo anti-DAT (Figura 5A) o un anticuerpo anti-TH (Figura 5B) y la tinción concomitante de células neuronales con anticuerpo anti-MAP2. Inmunotinción Representante de varias poblaciones neuronales presentes en el cultivo también se muestra en la Figura 5. Neuronas GABAérgicas se tiñeron utilizando un anticuerpo anti-GAD67 (Figura 5C) y representan alrededor del 50% de las células. Las neuronas serotoninérgicas se detectan con un anticuerpo anti-serotonina (Figura 5D) y representan menos del 1% de las células en el cultivo. El cultivo de células de mesencéfalo también contiene neuronas glutamatérgicas (40% de la cultura), neuronas colinérgicas, y células gliales raras (alrededor de 2-3%). Proporción de las células gliales se determina utilizando la proteína ácida (GFAP) tinción glial fibrilar (Figura 5E). La identificación inequívoca de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo también se puede lograr utilizando marcadores específicos como Pitx3 o FOXA2 31,32.
Superior inmunotinción ampliación de varias poblaciones neuronales presentes en el cultivo se muestra en la Figura 6. Las neuronas dopaminérgicas se detectan usando un anticuerpo anti-DAT (Figura 6A). Tinción DAT refleja DA estado de maduración de las neuronas. DAT expresión comienza a DIV3-4. Neuronas GABAérgicas y las neuronas serotoninérgicas se tiñeron utilizando un anticuerpo anti-GAD67 (Figura 6B) o un anticuerpo anti-serotonina (Figura 6C), respectivamente.
Figura 1. Ilustrado diagrama de flujo de la cultura mesencéfalo. Pasos cultivo principal se indican. (A) Sacrificar un ratón suizo embarazada, recoger E13.5 embriones en placas de Petri y lavarlas por sucesivos baños de PBS. (BC) Bajo microscopio de disección, dissect ventral del mesencéfalo de la totalidad de los embriones y colocarlos en un tubo. (D) Añadir tripsina-EDTA a los fragmentos del cerebro disecado y digerir a 37 ° C durante 15 min. (E) Eliminar la tripsina, añadir el suero que contiene medio de cultivo y realizar disociación celular mecánica (10 movimientos de trituración, repiten dos veces). (F) sedimentar las células, resuspender en medio libre de suero suplementado con hormonas y placa en capa preliminar de 12 o 24 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. flujo gráfico detallado de la disección mesencéfalo. Pasos disección principales se indican. (A) Embrión de ratón en E13.5 después de reremoción de los cuernos uterinos. (B) Sin decapitar al embrión, extirpar el cerebro. (C) Representación esquemática de cerebro de ratón embrionario en E13.5. Red líneas discontinuas indican que el cerebro se debe cortar para aislar mesencéfalo ventral (R, corte rostral; C, corte caudal; D, corte dorsal). El vesículas cefálicas telencéfalo, diencéfalo, mesencéfalo, y rombencéfalo se delimitan en azul, púrpura, rosa y gris, respectivamente. Aq, acueducto; Hipótesis, el hipotálamo; LGE, eminencia ganglionar lateral; VI: ventrículo lateral; MFB, haz medial del cerebro anterior; MGE, eminencia ganglionar medial; sc, colículo superior; Thal, tálamo; VM, mesencéfalo ventral; 4V, cuarto ventrículo (adaptado de 30). (D) líneas de corte se indican con líneas rojas de guiones en un cerebro de ratón E13.5. (E) Ratón cerebro después de la eliminación de las regiones previsiones y cerebro posterior (es decir, después del corte R). (F) de cerebro de ratón después de la eliminación de la superior colículo (es decir, después de los recortes de I y D). (G) Vista ventral de un mesencéfalo aislado (es decir, después corta R, C, D). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. imágenes de contraste de fase de la cultura en diferentes etapas de desarrollo. (A) DIV1, (B) DIV4, y las imágenes (C) DIV7 de la misma cultura se muestran. Las imágenes fueron adquiridas en células vivas con un microscopio invertido. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. tirosina hidroxilasa tinción de las neuronas dopaminérgicas. (A) En Div8, las neuronas DA se detectaron usando anticuerpo anti-TH. Apocalipsis se realizó con un 3,3 '-diaminobencidina (DAB) kit. La imagen fue tomada con un microscopio invertido. (B) Número de neuronas TH + en cultivos de mesencéfalo en función de la edad de la cultura. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. proporción representativa de las neuronas y astrocitos en cultivo. En DIV4, las neuronas DA (en magenta) fueron detectados utilizando anti-DAT (A) o anti-TH del anticuerpo (B) y las neuronas GABAérgicas, astrocitos y neuronas serotoninérgicas (en magenta) se detectaron usando (E)-anticuerpos anti-GFAP anti-GAD67 (C), anti-serotonina (D), y, respectivamente. Las células neuronales (en cian) se tiñeron con un anticuerpo anti-MAP2 (AE). Las imágenes fueron adquiridas con un microscopio invertido. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. tinción representativa de varias poblaciones celulares de la cultura mesencéfalo. Neurona (A) dopaminérgica detectada por tinción DAT en DIV9 (en rojo). (B) las neuronas GABAérgicas visualizados por el GAD-67 tinción en DIV9 (en verde).
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Discussion
Este protocolo presenta los procedimientos y reactivos necesarios para preparar un cultivo primario de neuronas mesencefálicas desde el ratón embrionario y el procedimiento de inmunofluorescencia para detectar las neuronas dopaminérgicas. Los pasos críticos del procedimiento son la disección de los embriones y la disociación mecánica de los fragmentos del cerebro recogidos. Instrumentos de disección de alta calidad ayuda a dominar la técnica de disección. Neuronas DA constituyen una pequeña proporción de mesencéfalo. Por consiguiente, la recogida de la parte derecha de la mesencéfalo ventral es esencial para obtener un cultivo que contiene 2-4% de las neuronas DA. Disociación mecánica se debe realizar con cuidado y suavidad. Si el cultivo contiene grupos de neuronas no disociadas, agregar uno o dos más pasos de trituración.
Este protocolo utiliza medio libre de suero para el cultivo de neuronas. Sin embargo, el recubrimiento con el suero es necesario para mejorar la unión de las células. Mezcla hormonal, que sustituye a la SERum, se define para permitir el crecimiento de la neurona y para minimizar la supervivencia y la proliferación de células gliales. En consecuencia, las células no neuronales representan alrededor del 2-3% de la cultura (cuantificación utilizando GFAP-tinción). Alternativamente, los cultivos se pueden cultivar en presencia de suero con la adición de dos días después de la siembra, de la citosina-β-D-arabinofuranósido (ara-C, 5-8 M) para suprimir la proliferación de células gliales 26. Otra alternativa a la mezcla de la hormona es el uso de los medios y suplementos definidos 29.
Esta técnica es adecuada para llevar a cabo la tinción de inmunofluorescencia, PCR cuantitativa, segundo mensajero cuantificación y varios tipos de pantallas de toxicología / supervivencia. También debería ser posible llevar a cabo estudios electrofisiológicos en estas preparaciones 33,34. Estos cultivos pueden identificar pre-candidatos moléculas neuroprotectoras y ayudar a caracterizar propiedades neuronas DA, mientras se minimiza el número de animales utilizados. Sin embargo, fiSe solicita la confirmación final utilizando modelos in vivo, como cultivos de neuronas no reciben aportaciones de otras regiones del cerebro, lo que podría influir fuertemente su maduración.
Esta técnica no se usa ampliamente, en comparación con los modelos de cultivo de rata, a pesar de sus primeras descripciones en los primeros años ochenta 16,17. La falta de imágenes que presentan la disección delicada puede limitar a los investigadores a desarrollar este modelo de cultivo de ratón. Sin embargo, debido a la generación de numerosos modelos de ratones transgénicos de enfermedades neurodegenerativas 25 con invalidación gen específico o etiquetado de los tipos neuronales específicos, cultivos de neuronas DA de ratón son ahora de gran interés.
El dominio de esta técnica permite el estudio de las neuronas DA aislados de cualquier tipo de ratón transgénico y para explorar la perturbación inducida por la modificación genética. Además, estos cultivos pueden ser usados como modelos de referencia que deben compararse con las neuronas DA derivados de madre de ratón35 células o de células madre pluripotentes inducidas 36.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1 M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water - Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1,000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
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