Summary
在这里，我们描述了一个简单而普及显微镜技术来获得高品质的数字果蝇成虫和幼虫突变表型的视频从横向的角度来看。
Abstract
黑尾果蝇是用于研究神经系统的功能的有力的实验模型系统。造成神经系统功能紊乱的基因突变往往产生可行的幼虫，并有运动缺陷表型，很难用文字充分说明，或用一个摄影图像完全代表成年人。科学出版的电流模式，但是，支持提交的数字视频媒体作为补充材料陪手稿。在这里，我们描述了从横向的角度获得高品质的数字均果蝇幼虫和成虫的表型视频的简单和普及显微技术。影片从一个侧面视图幼虫和成虫的运动是有利的，因为它允许观察和微妙的区别和变化的分析，异常机车的行为。我们已经成功地使用该技术来可视化和量化aberran吨爬行在三龄幼虫的行为，除了成人突变表型和行为，包括梳理。
Introduction
共同果蝇黑腹果蝇是用于研究神经系统1-3的功能的有力的实验模型系统。结构和神经系统与人类的功能进化保守性，以及易于遗传操作和遗传工具繁多，使果蝇的首映有机体来模拟人类神经退行性疾病4。引起的神经系统的机能障碍的基因突变往往导致活突变体的幼虫和成虫的果蝇与受损的运动。在神经系统有缺陷的突变体观察到的表型包括降低速率运动，异常协调，和痉挛性运动中的成年人，以及在体壁肌肉的蠕动收缩缺陷，和幼虫局部麻痹。这些表型都被利用于高通量遗传筛选和突变体幼虫5的运动测定法的发展，6和成人7-10 果蝇旨在量化运动障碍和识别所必需的神经系统的功能的基因。而，这些方法是用于定量幼虫和成虫机车行为极为有用，它们不能传达关于每个特定的异常行为的定性信息。例如，尽管突变体三龄幼虫可在行为分析表现出改变的运动参数，它可能是不清楚的，如果这是在爬行周期改变在节奏蠕动收缩，一般缺乏协调，或者在后体的局部麻痹的结果墙肌肉。在这里，我们描述了从横向的角度获得高品质的数字果蝇成虫和幼虫的表型机车视频的简单和普及显微技术。从横向的角度来看收购数字视频可以直接观察locomotiv微妙的区别和分析Ë行为的更翔实的侧面视图方向。
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Protocol
1，体视显微镜系统
注意：尽管该协议是很容易适应地耦合到一台数码相机以获取视频的能力几乎任何立体显微镜系统中，提供了在我们的实验中使用的（表的材料/设备）的系统上的信息。
- 使用三目体视显微镜连接到一个商业的数码相机获取数字视频。
- 为了夫妻商用数码相机的立体显微镜的三目口，取出立体显微镜的光电管口的½xC型并用1X C型取代。
- 安装一台数码相机连接器（43毫米螺纹）的1X C型安装。
- 装入两个降压型环，58毫米至48毫米，和48毫米至43毫米，到相机成色弥合从数字照相机耦合器的连接到透镜适配器套件，用于数字照相机。
- 安装数码相机镜头转接器套件。
- 收购与显微镜的放大倍率和数码相机集光学变焦为12倍左右组合的放大倍率（每秒30帧，640×480像素）的视频。注意：在立体显微镜的放大倍数，必须按照三目端口的新重新1X C接口来补偿。
2，成像果蝇三龄幼虫
- 磁带上的永久性标记的黑色舞台板立体显微镜连接到一台数码相机，这样的标志帽的侧占地约的⅓至¼看在相机液晶监视器中观察到的垂直领域。使用标记的顶部作为阶段执行幼虫成像，因为它们都在一个颜色分类，可用于对颜色代码和分化幼虫的基因型被成像。
- 标定的图中的数字照相机的液晶显示器中观察到的标记物顶部的表面上的场用细点标记。
- 选择三龄幼虫的形象。的准则选择第三龄幼虫体长，在生命周期的幼虫阶段，前部和后部气孔的存在从食物源的出现和口装置11的下颌骨钩的结构。保证幼虫的清洁，用水彻底清洗它。
- 从上面照亮永久性标记阶段性顶部光从光纤照明系统。调整入射光的角度，以提供最佳的照明。
- 聚焦显微镜上的永久性标记上方的边缘。开始采集数字视频。
- 将幼虫上的标记帽的侧约75°远离纵轴，只是外的视场，以朝向视场朝向幼虫（ 图1）的前部。注意：放置在标志帽的侧幼虫可让相机届的运动纪录Ë幼虫从横向的角度来看。它有助于保持幼虫浸有水，这样他们不脱落标记帽的侧面。必须谨慎行使但是，不要使用太多的水过量将坚持以幼虫，因为它爬行穿过田野。
- 轻轻知己知彼幼虫用小画笔，以强制其在整个视场爬行。要有耐心，因为幼虫很少合作，经常要返回到起点很多时候他们直接穿过田野爬之前。
- 记录约10-15分钟不间断的数字视频资料和作物，并删除所有不必要的镜头收购后的数字视频编辑软件。
3，影像学成人果蝇
- 将一个成年果蝇的一次性1.5毫升光谱聚苯乙烯比色皿。
注： 二氧化碳 anaesthetization成年果蝇立即behav前ioral分析协议可以妥协的结果12。建议在成年果蝇给予24小时期间的CO 2 anaesthetization执行的行为测试13日之前恢复。 - 塞用小棉球反应杯的末端。确保棉花球被包装得足够紧，以占据较大的薪金空间，并且其限制飞的比色皿的减少量仓。
- 放置反应杯上的白色舞台板立体显微镜，并正确对准的图中的数字照相机的液晶显示器中观察到的字段的反应杯的容积减少隔室。
- 从上面照射比色皿光从光纤照明系统。调整入射光的角度，以提供最佳的照明。
- 聚焦显微镜，并开始采集数字视频。
- 不间断的数字视频资料和作物记录30-45分钟，去除一切不必要的镜头后收购数字视频编辑软件。
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Representative Results
我们已经成功地使用这种技术来获得和量化与损失的stathmin基因的功能（ 图2）14相关联的幼虫行为表型。在中stathmin基因编码划分的微管蛋白二聚体的可溶性微管蛋白的游泳池的微管调节蛋白和微管结合，并促进其分解15,16。中stathmin功能是必需的，以保持在周围神经14的轴突微管的完整性。中断在果蝇三龄幼虫的结果在表型中stathmin活性，其中的后机身段肌肉收缩的过程中抓取周期的每个蠕动波后翻转向上。这后瘫痪或“尾翻转'表型是有缺陷的轴突运输的一大特点。我们量化中的七个不同的第三龄幼虫后麻痹表型的外显率和严重程度<EM>通过测量上述水平尾角中stathmin突变基因型是在爬行周期（ 表1）提出。幼虫被确定呈现出强大的尾部翻转如果尾巴升至高于爬行时， 温和的尾部翻转如果尾巴升至高于水平面小于40°，且无尾翻转水平大于40°，如果幼虫表现出一个正常的抓取行为。
安装在三目端口图三龄幼虫上的永久性标记帽状期收购数字视频的使用立体显微镜的横向视角1的位置。侧视一个基本的立体显微镜系统的数码相机。插图的放大倍率显示了贴在显微镜载物台的永久标记的方位的位置三龄幼虫上的标记上限收购异常行为的数字视频从一个侧面透视图。在图像空间中的三维空间中定义; x轴运行的永久性标记的长度和平行于所述显微镜载物台上，y轴垂直于x轴并平行于显微镜载物台，和z轴是从标记帽到垂直物镜和垂直于显微镜载物台上。甲三龄幼虫被放置在所述标记帽的侧约75°远离朝向y轴垂直的z轴，外面的视图的数字照相机领域中，与果蝇幼虫的朝向场朝向前的图。上的标记帽侧的幼虫的布置使得立体显微镜的数码相机中，从侧面透视记录整个领域的幼虫的运动。
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图的代表性结果2图像从果蝇幼虫（A，B）和成人的数字视频图像代表（C，D），表型和行为，从横向的角度获得的。每幅图像是视频静止帧从收购数字视频文件中提取（A）野生型三龄幼虫表现出扁平的身体姿势沿基板爬行时（B）三龄幼虫纯合子在中stathmin基因表现出的异常爬行突变尾翻转的行为，表示后肌肉的麻痹。（三）野生型果蝇成虫的翅膀保持平贴在身体飞走。（四）成人果蝇 ，纯合子未知突变，持有其翅膀角约为45°偏多。这两个异常的幼虫和成虫的表型描述s为最好的观测和连通从横向侧视透视获取的数字视频。在面板A和B的比例尺= 1毫米。这一数字已经从邓肯等人 ，2013。
| 的后路麻痹表型的严重程度 | ||||
| 基因型 | Ñ | 无尾翻转 | 轻度尾翻转（<40°） | 稳健的尾部翻转（> 40°） |
| 野生型 | 150 | 100.0％ （N = 150） | 0.0％ 组（n = 0） | 0.0％ 组（n = 0） |
| 焦虑B200 / + | 130 | 100.0％ （N = 130） | 0.0％ 组（n = 0） | 0.0％ 组（n = 0） |
| 焦虑rdtp / + | 140 | 100.0％ （N = 140） | 0.0％ （N =） | 0.0％ 组（n = 0） |
| DF（2L）Exel6015 / + | 120 | 100.0％ （N = 120） | 0.0％ 组（n = 0） | 0.0％ 组（n = 0） |
| 焦虑B200 | 120 | 23.3％ （N = 28） | 23.3％ （N = 28） | 53.4％ （N = 64） |
| 焦虑B200 / DF（2L）Exel6015 | 101 | 10.9％ （N = 11） | 21.8％ （N = 22） | 67.3％ （N = 68） |
| 焦虑rdtp | 125 | 16.0％ （N = 20） | 32.0％ （N = 40） | 52.0％ （N = 65） |
| 焦虑rdtp / DF（2L）Exel6015 | 140 | 7.7％ （N = 11） | 23.7％ （N = 33） | 68.6％ （N = 96） |
表1外显率和严重程度后侧中的stathmin观察（STAI）突变体果 蝇三龄幼虫麻痹型。 中stathmin突变体果 蝇三龄幼虫的后瘫痪的表型的外显率和严重程度进行评分，并通过从横向透视获取行为的数字视频和测量的角量化该尾部在爬行周期上升高于水平面抓取面。幼虫被评价为具有鲁棒尾部翻转如果尾巴升至大于40°以上的水平面和温和的尾部翻转如果尾巴升高小于40°以上的水平面。幼虫表现出正常的抓取行为得分为无尾翻转。至少百幼虫的爬行行为对于每个基因型测试进行分析。该表已经被修改邓肯等人，2013。
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Discussion
果蝇的实力作为研究神经系统的功能模型系统主要来自强大的遗传工具可用收敛性和强大的行为分析的广泛的发展。在这里，我们提出了从横向的角度获得高品质的数字果蝇成虫和幼虫的表型机车视频的简单和普及显微技术。我们已经成功地使用这种方法来表征和量化后麻痹的严重程度“尾巴翻转'通过直接测量，该尾部从水平轴在爬行周期14所提出的最大角度在神经系统的第三龄幼虫的突变体观察到的表型。这里提出的方法的好处是，视频是从横向透视获取，允许直接观察异常机车行为和分析，经常在神经幼虫和观察dult 突变体，从更多的信息'侧视'的方向。因此，蠕动肌肉收缩在果蝇幼虫，并在成年果蝇步态异常表型可视化更容易观察和分析。这种技术的一个限制是，它不是一种高通量的方法。此外，特定的果蝇幼虫和成虫行为只能是时间很短的持续时间，由于通过视立体显微镜领域，得到的限制性跟踪区域进行分析。获得成年果蝇行为的视频时，如比色皿室的容积比视立体显微镜领域显著较大这可能是特别有问题的。我们已通过使用棉花和纸板插入件，以减少实验皿室体积和限制成人的运动飞向包含在视野内的空间解决了这个问题。虽然我们大部分的即时通讯老龄化一直专注于神经幼虫突变体，我们也使用该技术来观察成人突变表型和行为，包括仪容仪表，这表明该技术可以很容易地扩展到包括其他果蝇的行为，例如求偶，交配和攻击行为的分析。这是可能的，这种技术可以用于成像其他果蝇家族的成员，以及类似尺寸的其他昆虫是有用的。此外，该技术的少许修改将允许较大的昆虫物种的成像。
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Disclosures
作者宣称，不存在利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢亚历山大欧派提供技术援助和支持，詹姆斯·巴顿提供视频旁白和雷蒙娜Flatz和Joellen斯威尼对于出现在影随行。这项工作是由MJ默多克慈善信托基金（批准号：2012205，以JED）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
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