Summary
ここでは、 ショウジョウバエの成体および横方向の視点から幼虫の変異体の表現型の高品質のデジタルビデオを取得するためのシンプルで広くアクセス顕微鏡技術が記載されている。
Abstract
キイロショウジョウバエは、神経系の機能を研究するための強力な実験モデル系である。神経系の機能障害を引き起こす遺伝子突然変異は、多くの場合、実行可能な幼虫と適切にテキストを記述するか、完全に単一の写真画像では表現が困難運動の欠陥表現型を持っている大人を作り出す。科学的な出版の現在のモードが、しかし、原稿を伴うために補足資料などのデジタル映像メディアの提出をサポートしています。ここでは、横方向の両方の観点から、ショウジョウバエの幼虫と大人の表現型の高品質のデジタルビデオを取得するためのシンプルな、そして幅広いアクセスができる顕微鏡技術が記載されている。それは異常な機関車の挙動に微妙な違いや変化の観察と分析を可能にするため、サイドビューから幼虫と大人の運動のビデオが有利である。私たちは正常に視覚化し、aberran定量化するために技術を使用していたtはグルーミングを含む成人の変異体の表現型と行動に加えて、3齢幼虫に行動をクロール。
Introduction
一般的な果物飛ぶキイロショウジョウバエは、神経系1-3の機能を研究するための強力な実験モデル系である。進化人間と神経系の構造と機能の保全だけでなく、遺伝子操作の容易性と遺伝子ツールの広大な配列は、ヒトの神経変性疾患4をモデル化するために、ショウジョウバエの初演生物を作る。神経系の機能障害を引き起こす遺伝子突然変異は、多くの場合、障害のある歩行を実現可能変異体幼虫と大人のショウジョウバエにつながる。神経系欠損変異株で観察された表現型は、歩行、異常な調整、および成人における痙性運動の速度だけでなく、体壁筋系の蠕動収縮の欠損、および幼虫の部分的な麻痺の減少、。これらの表現型は、ハイスループット遺伝子スクリーニングおよび突然変異体の幼虫5の移動アッセイの開発に利用されている、運動機能障害を定量化し、神経系の機能に必要な遺伝子を同定することを目的と6および成人7-10 ショウジョウバエ 。これらのアプローチは、幼虫と大人の機関車の挙動を定量化するために極めて有用であるが、これらはそれぞれ、特定の異常な行動についての定性的な情報を伝えることができない。変異型3齢幼虫が行動アッセイで変更された歩行パラメータを示すことができるしながら、これはクロール·サイクル中にリズミカルな蠕動性収縮、協調の一般的な不足、または後部胴体の部分的な麻痺の変化の結果である場合、それは不明かもしれ壁の筋肉組織。ここでは、 ショウジョウバエの成体および横方向の視点から幼虫機関車の表現型の高品質のデジタルビデオを取得するためのシンプルな、そして幅広いアクセスができる顕微鏡技術が記載されている。横視点から取得されたデジタルビデオは、locomotivの微妙な違いを直接観察や分析を可能にするより有益なサイドビューの方向から電子の振る舞い。
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Protocol
1ステレオ顕微鏡システム
注：このプロトコルは、簡単にビデオを取得する機能を備えたデジタルカメラに接続された事実上すべての実体顕微鏡システムに適用可能であるが、詳細は（材料/機器の表）の研究室で使用されるシステム上に設けられている。
- 商業デジタルカメラに接続された三眼実体顕微鏡を使用してデジタルビデオを取得します。
- 結合するために実体顕微鏡の三眼ポートへの商用デジタルカメラ、実体顕微鏡の光電管ポートの½xのCマウントを取り外し、1X Cマウントと交換します。
- 1X Cマウントデジタルカメラカプラー（43ミリメートルスレッド）をマウントします。
- カメラカプラーにマウント2のステップダウンリング、48ミリメートル、43ミリメートルと48ミリメートル58ミリメートル、デジタルカメラ用レンズアダプターキットデジタルカメラカプラからの接続をブリッジする。
- レンズアダプターキットにデジタルカメラをマウントします。
- 顕微鏡の倍率は約12倍（毎秒30フレーム、640×480ピクセル）を合わせた倍率デジタルカメラセットの光学ズームでビデオを取得します。注：実体顕微鏡の倍率は三眼港の新たに再構成1X Cマウントに合わせて補償しなければならない。
2イメージングショウジョウバエ三齢幼虫
- マーカーキャップの側面には、カメラの液晶モニターで観察された垂直視野の4分の1に⅓約占めるようにデジタルカメラに接続された実体顕微鏡の黒ステージプレートにテープ油性マジックを。それらはカラーコードを使用して画像化されている幼虫の遺伝子型を区別することができる色の品揃えに来るので、幼虫の撮影を行うためにステージとして、マーカートップを使用してください。
- 細かい点でのマーカートップの表面にデジタルカメラの液晶モニターで観察視野を画定マーカー。
- 画像への3齢幼虫を選択します。 3齢幼虫を選択するための基準は、体長、ライフサイクルの幼虫期の間の食物源から出現、前方および後方気門の存在、と口装置11の下顎のフックの構造だった。幼虫は水中で徹底的に洗浄することにより、クリーンであることを確認してください。
- 光ファイバー照明システムからの光を上方から永久マーカー上部ステージを照らす。最適な照明を提供するために入射光の角度を調整する。
- 油性ペン上部の端に顕微鏡を焦点。デジタルビデオを取得開始します。
- 視野（ 図1）の方を向いている幼虫の前で、ちょうど視野外、約75°離れて垂直軸からのマーカーのキャップの側面に幼虫を置きます。注：マーカーキャップ側の幼虫の配置は、番目の記録的動きにカメラを可能にする横方向の視点からの電子幼虫。それは彼らが、マーカーキャップの側面から落下しないように、水で湿った幼虫を維持するのに役立ちます。ケアは、それが視野にわたってクロールのように過剰な量を幼虫に付着するようにあまりにも多くの水を使用しないように、しかし、注意しなければならない。
- そっと突くと、視野全体にクロールすることを強制するために、小さな絵筆で幼虫をprod。幼虫はほとんど協力しておらず、多くの場合、彼らはまっすぐに、フィールド全体にクロールする前に、開始点に何度も返されなければならないように我慢して。
- 録画中断のデジタルビデオ映像と作物の約10〜15分であり、デジタルビデオ編集ソフトウェアを使用して、すべての不要な映像の取得後を削除します。
3イメージング大人ショウジョウバエ
- 使い捨て1.5ミリリットル分光ポリスチレンキュベット中で、単一の大人のショウジョウバエを置きます。
注：大人のショウジョウバエのCO 2 anaesthetization直ちにbehav前にioral分析プロトコルは、結果が12を危うくする可能性がある。大人のショウジョウバエは、行動試験13で実行する前に、CO 2 anaesthetizationから回復するために、24時間の期間が与えられることをお勧めします。 - 小さなコットンボールとキュベットの端を差し込みます。コットンボールは、大きなキャップスペースを占有するのに十分タイトなパックされていることを確認し、キュベットの減少容積区画にフライを閉じ込める。
- 実体顕微鏡の白い舞台板にキュベットを置き、適切にデジタルカメラの液晶モニターで観察視野を持つキュベットの減少容積区画を合わせます。
- 光ファイバー照明システムからの光を上方からキュベットを照射する。最適な照明を提供するために入射光の角度を調整する。
- 顕微鏡の焦点を、デジタルビデオの収集を開始。
- 録画中断のデジタルビデオ映像と作物の約30〜45分であり、すべての不要なを削除デジタルビデオ編集ソフトウェアを使用してフッテージ取得後。
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Representative Results
私たちは、 スタスミン遺伝子 （ 図2）14の機能の喪失に関連した幼虫の行動表現型を獲得し、定量化するためにこの技術を正常に使用しています。 スタスミン遺伝子は、可溶性チューブリンのプールからチューブリン二量体を分割し、微小管を結合し、その分解を促進する微小管15,16調節タンパク質をコードしている。スタスミン機能が末梢 神経14の軸索微小管の完全性を維持するために必要とされる。後部胴体セグメントがクロールサイクル中の筋収縮の各蠕動波の後に上向きに反転された表現型のショウジョウバエ 3齢幼虫結果におけるスタスミン活性の破壊。この後方麻痺または「テールフリップ」表現型は、欠陥のある軸索輸送の特徴である。私たちは、異なる7の3齢幼虫における後部麻痺表現型の浸透度や重症度を定量化する<em>の水平尾翼の上に角度を測定することにより、スタスミン変異型遺伝子型は、クロール·サイクル（ 表1）の間に上昇させた。幼虫が出品している場合、尾は尾は水平上記40℃未満を調達していた場合、 軽度のテールフリップをクロールし、決して尾フリップ水平上記より大きく40度を上げた場合には幼虫は、 堅牢なテールフリップを示すことが決定された通常のクロールの動作。
実体顕微鏡を用いて、横方向の視点からのデジタル映像を取得するための油性ペンキャップステージ上3齢幼虫の図1の位置。デジタルカメラの基本的な実体顕微鏡システムのサイドビューは三眼のポートに取り付けられた。挿入図は倍率が顕微鏡ステージにテープで永久的なマーカーの向きおよび位置を示す横方向の視点から異常な行動のデジタル映像を取得するためのマーカーキャップ上の3齢幼虫。画像では空間の3次元は定義されています。 x軸は永久的なマーカーの長さを実行し、顕微鏡ステージに平行であり、y軸は、顕微鏡ステージにx軸と平行に垂直であり、z軸は、マーカキャップから垂直である対物レンズと顕微鏡ステージに垂直。 3齢幼虫は、フィールドに面する幼虫の前に、単にデジタルカメラの視野外に、約75°離れたy軸に向かって垂直z軸からのマーカーキャップの側に配置されているビューの。マーカーキャップ側の幼虫の配置は、実体顕微鏡のデジタルカメラは横視点から視野にわたって幼虫の動きを記録することができます。
ftp_upload / 51981 / 51981fig2highres.jpg "/>
代表的な結果の図2の画像 ショウジョウバエの幼虫のデジタルビデオから。代表的な画像（A、B）と横視点から取得した成人（C、D）の表現型と行動。各画像はビデオがまだ取得されたデジタルビデオファイルから抽出されたフレームである。（A）野生型3齢幼虫を呈するフラットボディ姿勢基板に沿ってクロールするとき。（B） スタスミン遺伝子の出品異常なクロールの突然変異のための3齢幼虫のホモ接合後部筋肉組織の麻痺を示すテールフリップの挙動、（C）ハエが歩くように、野生型ショウジョウバエ成虫の羽は、体に対して平らに開催されています。（D）大人ショウジョウバエ 、未知の変異についてホモ接合、で彼らの翼を保持するノーマルより約45°の角度。異常な幼虫と大人の表現型の両方記載sは最高の観察および側面ビューの視点から取得されたデジタルビデオに連通している。パネルAおよびBスケールバー= 1 mm単位。この図は、ダンカンらから変更されている。、2013。
| 臼歯麻痺表現型の重症度 | ||||
| 遺伝子型 | nは | いいえテールフリップん | マイルドテールフリップ（<40°） | 堅牢なテールフリップ（> 40°） |
| 野生型 | 150 | 100.0％ （N = 150） | 0.0％ （n = 0）は | 0.0％ （n = 0）は |
| STAI B200 / + | 130 | 100.0％ （N = 130） | 0.0％ （n = 0）は | 0.0％ （n = 0）は |
| STAI rdtp / + | 140 | 100.0％ （N = 140） | 0.0％ た（n =） | 0.0％ （n = 0）は |
| Dfは（2L）Exel6015 / + | 120 | 100.0％ （N = 120） | 0.0％ （n = 0）は | 0.0％ （n = 0）は |
| STAI B200 | 120 | 23.3％ （N = 28） | 23.3％ （N = 28） | 53.4％ た（n = 64） |
| STAI B200 / DF（2L）Exel6015 | 101 | 10.9％ た（n = 11） | 21.8％ （N = 22） | 67.3％ た（n = 68） |
| STAI rdtp | 125 | 30.0％ た（n = 20） | 32.0％ た（n = 40） | 52.0％ （N = 65） |
| STAI rdtp / DF（2L）Exel6015 | 140 | 7.7％ た（n = 11） | 23.7％ （N = 33） | 68.6パーセント （N = 96） |
表1浸透率との重症度スタスミンで観察された麻痺の表現型（STAI）変異ショウジョウバエ 3齢幼虫を後方。 スタスミン変異体の後方麻痺表現型の浸透度や重症度がショウジョウバエ 3齢幼虫を横視点から行動のデジタル映像を取得し、角度を測定することによって獲得し、定量化したテールは、クロール·サイクル中に水平クロール面上に隆起していること。幼虫は、尾が40℃未満、水平面上に上昇した場合には、テールがより大きく40°、水平面と穏やかなテールフリップを超えて上昇した場合には堅牢なテールフリップを持つものとして採点した。通常のクロール挙動を示す幼虫はテールフリップを持たないように採点した。少なくとも百幼虫のクロールの動作を試験した各遺伝子型について分析した。このテーブルには、ダンカンらから変更されている。、2013。
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Discussion
神経系の機能を研究するためのモデル系としてキイロショウジョウバエの強みは主に利用可能な強力な遺伝子ツールの収束と開発された堅牢な行動アッセイ幅広い由来する。ここでは、 ショウジョウバエの成体および横方向の視点から幼虫機関車の表現型の高品質のデジタルビデオを取得するためのシンプルな、そして幅広いアクセスができる顕微鏡技術を提示する。私たちは、成功し特徴づけると後麻痺の重症度を定量化するために、このアプローチを使用していた「テールフリップ'直接尾クロールサイクル14の間に水平軸からよみがえられたことを最大の角度を測定することにより、神経学的三齢幼虫の変異体で観察された表現型。ここに提示アプローチの利点は、多くの場合、神経学的幼虫そしてaで観察、映像が異常な機関車挙動の直接観察および分析を可能にする、横方向の視点から取得されることであるdult 突然変異体、より有益な「サイドビュー 'の方向から。その結果、幼虫ショウジョウバエの蠕動筋肉収縮、および成体ショウジョウバエの異常歩行の表現型の可視化をより容易に観察し、分析する。この技術の一つの制限は、高スループットのアプローチではないということである。また、特定のショウジョウバエ幼虫及び成体行動のみによる立体顕微鏡の視野によって与えられる限定的なトラッキングエリアに時間の短い期間のために分析することができる。キュベット室の容積は、ステレオ顕微鏡の視野よりも著しく大きいように、 ショウジョウバエ成虫行動の映像を取得するときに、特に問題となり得る。私たちは、キュベットチャンバの容積を最小限にし、視野内に含まれる空間に成虫ハエの移動を制限するために、綿や厚紙インサートを使用することによって、この問題に対処している。一方、当社イムの大半高齢化が神経学的幼虫の変異体に焦点を当ててきた、私たちも技術が簡単にそのような求愛、交尾、および攻撃性など、他のショウジョウバエの行動の分析を含むように拡張することができることを示唆し、グルーミングなど、大人の変異体の表現型や行動を観察するための技術を使用している。これは、この技術が他のショウジョウバエファミリーメンバー、ならびに同様のサイズの他の昆虫を画像化するのに有用である可能性がある。さらに、技術のわずかな改変は、より大きな昆虫種の画像化を可能にするであろう。
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Disclosures
著者らは競合する利益が存在しないことを宣言した。
Acknowledgments
著者らは、ビデオのナレーションを提供するための技術支援やサポート、ジェームズ·バートンのためのアレクサンドラオピーを承認したい、付属のビデオに登場するためのラモナFlatzとJoellenスウィーニー。この作品は、MJマードック公益信託（JEDに認可番号2012205）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
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