Summary
Qui si descrive una tecnica di microscopia semplice e ampiamente accessibili per acquisire video digitale di alta qualità di Drosophila adulti e fenotipi mutanti larvali da una prospettiva laterale.
Abstract
Drosophila melanogaster è un potente sistema modello sperimentale per studiare la funzione del sistema nervoso. Mutazioni genetiche che causano la disfunzione del sistema nervoso spesso producono larve e gli adulti che hanno locomozione fenotipi difettosi che sono difficili da descrivere adeguatamente con il testo o completamente rappresentare con una sola immagine fotografica praticabile. Modalità attuali di pubblicazioni scientifiche, tuttavia, sostengono la presentazione di supporti video digitali come materiale supplementare per accompagnare un manoscritto. Qui si descrive una tecnica di microscopia semplice e ampiamente accessibili per l'acquisizione video digitale di alta qualità di entrambi i fenotipi larve e adulti di Drosophila da una prospettiva laterale. Video di locomozione larvale e adulto da una vista laterale è vantaggioso perché permette l'osservazione e l'analisi delle sottili distinzioni e le variazioni nei comportamenti aberranti locomotiva. Abbiamo utilizzato con successo la tecnica di visualizzare e quantificare aberrant strisciare comportamenti terzo instar larve, oltre a fenotipi mutanti adulti e comportamenti, tra cui governare.
Introduction
Il frutto comune mosca Drosophila melanogaster è un potente sistema modello sperimentale per lo studio della funzione del sistema nervoso 1-3. Conservazione evolutiva di struttura e funzione del sistema nervoso con gli esseri umani, così come la facilità di manipolazione genetica e di una vasta gamma di strumenti genetici rende Drosophila l'organismo prima di modellare le malattie neurodegenerative umane 4. Mutazioni genetiche che causano la disfunzione del sistema nervoso causano spesso vitale larve mutanti e adulti Drosophila con locomozione compromessa. Fenotipi osservati nel sistema nervoso mutanti difettosi includono il ridotto tasso di locomozione, coordinamento aberrante, e movimenti spastici negli adulti, così come deficit in contrazione peristaltica della muscolatura della parete del corpo, e la paralisi parziale delle larve. Questi fenotipi sono state sfruttate nello sviluppo di high-throughput schermi genetici e test di locomozione di larve mutanti 5, 6 e 7-10 adulto Drosophila volta a quantificare la perdita di valore locomozione e l'identificazione dei geni necessari per il funzionamento del sistema nervoso. Mentre questi approcci sono estremamente utili per quantificare i comportamenti locomotive larvali e adulti, non riescono a trasmettere informazioni qualitative su ogni comportamento problema specifico. Ad esempio, mentre il mutante terzo instar larve può presentare parametri di locomozione alterati in un test comportamentale, può essere chiaro se questo è il risultato di alterazioni contrazioni peristaltiche ritmiche durante il ciclo di scansione, generale mancanza di coordinamento, o paralisi parziale del corpo posteriore muscolatura della parete. Qui si descrive una tecnica di microscopia semplice e ampiamente accessibili per l'acquisizione video digitale di alta qualità di Drosophila adulti e fenotipi locomotiva larvali da una prospettiva laterale. Il video digitale acquisito da una prospettiva laterale, permette l'osservazione diretta e l'analisi delle distinzioni sottili LocomotivE i comportamenti di un più informativo orientamento side-view.
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Protocol
1 Il sistema Microscopio Stereo
Nota: Anche se questo protocollo è facilmente adattabile a qualsiasi impianto stereo microscopio accoppiato ad una fotocamera digitale con la possibilità di acquisire video, dettagli sono riportati sul sistema utilizzato nel nostro laboratorio (Tabella dei materiali / attrezzature).
- Acquisire video digitale utilizzando uno stereo microscopio trinoculare accoppiato ad una fotocamera digitale commerciale.
- Per accoppiare la fotocamera digitale commerciale alla porta trinoculare del microscopio stereo, rimuovere il ½x C-mount del porto fototubo del microscopio stereo e sostituirlo con un 1X C-mount.
- Montare un accoppiatore fotocamera digitale (filetto 43 millimetri) per la 1X C-mount.
- Montare due anelli step-down, 58 mm a 48 mm, e 48 mm a 43 mm, per l'accoppiatore fotocamera per colmare la connessione dal accoppiatore fotocamera digitale ad un kit adattatore per lenti per la fotocamera digitale.
- Montare la fotocamera digitale al kit adattatore per lenti.
- Acquisire video con l'ingrandimento del microscopio e lo zoom ottico della fotocamera digitale impostata per un ingrandimento totale di circa 12X (30 fotogrammi al secondo, 640 x 480 pixel). Nota: L'ingrandimento del microscopio stereo deve essere compensato secondo la nuova riconfigurato 1X C-mount della porta trinoculare.
2 Imaging Drosophila larve terzo instar
- Nastro un pennarello indelebile al piattello nero di un microscopio stereo accoppiato ad una fotocamera digitale in modo che il lato del tappo marcatore occupa circa ⅓ a ¼ del campo di vista verticale osservata nel monitor LCD della fotocamera. Utilizzare cime marcatori come il palco per eseguire l'imaging larvale perché vengono in un assortimento di colori che può essere utilizzato per codice colore e differenziare i genotipi di larve di essere ripreso.
- Delimitare il campo di vista osservato nel monitor LCD della fotocamera digitale sulla superficie del piano marcatore con una punta finemarcatore.
- Selezionare un terzo stadio larva di immagine. I criteri per la selezione larve al terzo stadio era lunghezza del corpo, emergere dalla fonte di cibo durante la fase larvale del ciclo di vita, la presenza di spiracoli anteriori e posteriori, e la struttura dei ganci mandibolari dell'apparato bocca 11. Assicurarsi che la larva è pulito lavandolo accuratamente con acqua.
- Illuminare la fase superiore pennarello indelebile dall'alto con luce da un sistema di illuminazione a fibre ottiche. Regolare l'angolazione della luce incidente per fornire l'illuminazione ottimale.
- Mettere a fuoco il microscopio sul bordo del piano pennarello indelebile. Iniziare l'acquisizione video digitale.
- Posizionare la larva sul lato del tappo marcatore di circa 75 ° rispetto all'asse verticale, appena fuori dal campo visivo, con l'anteriore della larva rivolta verso il campo di vista (Figura 1). Nota: Posizionamento della larva sul lato del tappo indicatore permette alla fotocamera di registrare il movimento di the larva da una prospettiva laterale. Aiuta a mantenere la larva umido con acqua in modo che non cadano fuori il lato del tappo marcatore. Prestare attenzione, tuttavia, non usare troppa acqua come quantità eccessive potranno aderire alla larva come si esegue la scansione attraverso il campo.
- Colpire delicatamente e spingere la larva con un piccolo pennello per costringere a strisciare attraverso il campo di vista. Sii paziente come le larve raramente cooperano e spesso devono essere restituiti al punto di partenza molte volte prima che strisciano attraverso il campo.
- Record di circa 10-15 minuti di ininterrotta riprese video digitali e ritagliare e rimuovere tutti i filmati inutili post-acquisizione digitale con software di editing video.
3. Imaging adulti Drosophila
- Posizionare un singolo adulto Drosophila in un usa e getta da 1,5 ml spettroscopica polistirolo cuvetta.
Nota: CO 2 per l'anestesia di adulti Drosophila immediatamente prima di un Behavprotocollo di analisi ioral può compromettere i risultati 12. Si raccomanda di adulti Drosophila disporre di un periodo di 24 ore per recuperare da CO 2 l'anestesia prima di eseguire un test comportamentale 13. - Inserire l'estremità della cuvetta con un piccolo batuffolo di cotone. Assicurarsi che il batuffolo di cotone è ricco abbastanza stretto per occupare il grande spazio tappo e limita la mosca al vano ridotto volume della cuvetta.
- Inserire la cuvetta sul piatto bianco fase di un microscopio stereo e allineare correttamente il vano ridotto volume della cuvetta con il campo visivo osservata nel monitor LCD della fotocamera digitale.
- Illuminare la cuvetta dall'alto con luce da un sistema di illuminazione a fibre ottiche. Regolare l'angolazione della luce incidente per fornire l'illuminazione ottimale.
- Mettere a fuoco il microscopio e iniziare l'acquisizione di video digitale.
- Record di circa 30-45 min di ininterrotta riprese video digitali e ritagliare e rimuovere tutto il superfluorepertorio post-acquisizione digitale con software di editing video.
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Representative Results
Abbiamo utilizzato con successo questa tecnica per acquisire e quantificare il fenotipo larvale comportamentale associata alla perdita di funzione del gene Stathmin (Figura 2) 14. Il gene codifica per una proteina Stathmin normativo microtubuli che le partizioni dimeri di tubulina da pool di tubulina solubile, e si lega i microtubuli e promuove il loro smontaggio 15,16. Funzione Stathmin è necessario per mantenere l'integrità dei microtubuli nelle assoni dei nervi periferici 14. Turbativa di attività Stathmin in Drosophila risultati del terzo instar larve in un fenotipo in cui i segmenti corporei posteriori lanciano verso l'alto dopo ogni onda peristaltica di contrazione muscolare durante il ciclo di scansione. Questa paralisi posteriore o fenotipo 'tail-flip' è un marchio di garanzia di trasporto assonale difettoso. Abbiamo quantificato la penetranza e la gravità del fenotipo posteriori paralisi nel terzo instar larve di sette diversi <em> Stathmin genotipi mutanti misurando l'angolo orizzontale sopra la coda è stata sollevata durante il ciclo strisciante (Tabella 1). Le larve sono stati determinati a mostrare una robusta coda-flip se la coda è stata sollevata superiore a 40 ° rispetto alla posizione orizzontale durante la scansione, un lieve coda-flip se la coda è stata sollevata a meno di 40 ° rispetto alla posizione orizzontale, e senza coda-flip, se le larve esposte un comportamento normale scansione.
Figura 1 Posizione del terzo stadio larva su un palco tappo pennarello indelebile per l'acquisizione di video digitale da una prospettiva laterale, utilizzando uno stereo microscopio. Vista laterale di un sistema di microscopio stereo di base con fotocamera digitale montata al porto trinoculare. L'ingrandimento inserto mostra l'orientamento di un pennarello indelebile attaccata al palco microscopio e la posizione di la terza larva instar sul tappo marcatore per l'acquisizione di video digitale di comportamento aberrante da un punto di vista laterale. Nell'immagine sono definite le tre dimensioni dello spazio; l'asse x corre lungo il pennarello indelebile ed è parallelo alla fase microscopio, l'asse y è perpendicolare all'asse x e parallelo alla fase microscopio, e l'asse z è verticale dal tappo marcatore al lente obiettivo e perpendicolare alla fase microscopio. Una terza larva è posto sul lato del tappo marcatore circa 75 ° dalla verticale asse z verso l'asse y, appena fuori dal campo visivo della telecamera digitale, con l'anteriore della larva rivolto verso il campo di vista. Posizionamento della larva sul lato del tappo marcatore consente la fotocamera digitale del microscopio stereo per registrare il movimento della larva attraverso il campo dal punto di vista laterale.
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Figura 2 Immagini di risultati rappresentativi. Immagini rappresentative di video digitale di Drosophila larva (A, B) e adulti (C, D) fenotipi e comportamenti acquisito da una prospettiva laterale. Ogni immagine è un video ancora fotogramma estratto dal file video digitali acquisiti. (A) Wildtype terzo instar larva mostrano una postura del corpo piatto quando strisciare lungo un substrato. (B) Terza larva omozigoti per una mutazione nel gene mostra Stathmin una scansione aberrante comportamento della coda-flip, indicativo di una paralisi della muscolatura posteriore. (C) Le ali di tipo selvatico adulto Drosophila si svolgono piatto contro il corpo come la mosca cammina. (D) per adulti Drosophila, omozigote per una mutazione sconosciuta, tenere le ali a angoli di circa 45 ° sopra il normale. Entrambi fenotipo aberrante larvale e adultos descritti sono meglio osservato e comunicato con video digitale acquisito da una laterale lato-vista in prospettiva. Nel pannello A e B la scala bar = 1 mm. Questo dato è stato modificato da Duncan et al., 2013.
| Gravità del posteriore Paralisi Fenotipo | ||||
| Genotipo | n | No Tail-Flip | Lieve coda-flip (<40 °) | Robusta coda-flip (> 40 °) |
| tipo selvatico | 150 | 100,0% (N = 150) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| STAI B200 / + | 130 | 100,0% (N = 130) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| STAI rdtp / + | 140 | 100,0% (N = 140) | 0,0% (N =) | 0,0% (N = 0) |
| Df (2L) Exel6015 / + | 120 | 100,0% (N = 120) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| STAI B200 | 120 | 23,3% (N = 28) | 23,3% (N = 28) | 53,4% (N = 64) |
| STAI B200 / Df (2L) Exel6015 | 101 | 10,9% (N = 11) | 21,8% (N = 22) | 67,3% (N = 68) |
| STAI rdtp | 125 | 16,0% (N = 20) | 32,0% (N = 40) | 52.0% (N = 65) |
| STAI rdtp / Df (2L) Exel6015 | 140 | 7,7% (N = 11) | 23,7% (N = 33) | 68,6% (N = 96) |
Tabella 1 penetranza e la gravità dellaposterior paralisi fenotipo osservato in Stathmin (STAI) mutante di Drosophila terzo instar larve. La penetranza e la gravità del fenotipo posteriori paralisi di Stathmin mutante di Drosophila terzo instar larve è stato segnato e quantificata con l'acquisizione video digitale del comportamento da una prospettiva laterale e misurare l'angolo che la coda è stata sollevata al di sopra del piano di scansione orizzontale durante il ciclo di scansione. Le larve sono stati segnati come aventi una robusta coda-flip se la coda è stata sollevata superiore a 40 ° sopra il piano orizzontale e un lieve coda-flip se la coda è stata sollevata a meno di 40 ° al di sopra del piano orizzontale. Le larve che presentano un comportamento normale scansione sono stati segnati come senza coda-flip. Il comportamento strisciante di almeno cento larve è stata analizzata per ciascun genotipo testato. Questa tabella è stata modificata da Duncan et al., 2013.
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Discussion
Forza Drosophila melanogaster s 'come sistema modello per lo studio della funzione del sistema nervoso deriva in gran parte dalla convergenza dei potenti strumenti genetici disponibili e la vasta gamma di test comportamentali robusti sviluppato. Qui vi presentiamo una tecnica di microscopia semplice e ampiamente accessibili per l'acquisizione video digitale di alta qualità di Drosophila adulti e fenotipi locomotiva larvali da una prospettiva laterale. Abbiamo utilizzato con successo questo approccio per caratterizzare e quantificare la gravità della paralisi posteriore 'tail-flip' fenotipi osservati nei neurologici terzo stadio larvale mutanti misurando direttamente l'angolo massimo che la coda è stata sollevata rispetto all'asse orizzontale durante il ciclo di scansione 14. Il vantaggio dell'approccio qui presentato è che il video viene acquisito da una prospettiva laterale, consentendo l'osservazione diretta e l'analisi dei comportamenti aberranti locomotiva, spesso osservata in neurologica larvale e unaDult mutanti, da un più informativo di orientamento 'side-view'. Di conseguenza, la visualizzazione delle contrazioni muscolari peristaltiche in larvale Drosophila, e fenotipi aberranti deambulazione in adulti Drosophila sono più facilmente osservati e analizzati. Una limitazione di questa tecnica è che non è un metodo ad alta produttività. Inoltre, specifici larvali e adulti comportamenti Drosophila possono essere analizzati solo per brevi periodi di tempo a causa della zona di inseguimento restrittiva accordata dal campo visivo del microscopio stereo. Questo può essere particolarmente problematico quando incorporante spiacevole comportamenti adulti Drosophila, come il volume della camera cuvetta è significativamente maggiore del campo visivo del microscopio stereo. Abbiamo affrontato questo problema utilizzando inserti di cotone e cartone per ridurre al minimo il volume della camera cuvetta e limitare i movimenti dell'adulto vola in uno spazio contenuto all'interno del campo di vista. Mentre la maggior parte della nostra iminvecchiamento è concentrata sulla mutanti larvali neurologici, abbiamo usato anche la tecnica di osservare adulti fenotipi e comportamenti mutanti, tra cui governare, suggerendo che la tecnica può essere facilmente ampliato per includere l'analisi di altri comportamenti Drosophila, come il corteggiamento, l'accoppiamento, e l'aggressione. E 'possibile che questa tecnica può essere utile per l'imaging altri membri della famiglia Drosophilidae, nonché altri insetti di dimensioni simili. Inoltre, modifica minore della tecnica permetterebbe di imaging di grandi specie di insetti.
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Disclosures
Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Alexandra Opie per l'assistenza e il supporto tecnico, James Barton per la fornitura di video narrazione, e Ramona Flatz e Joellen Sweeney per apparire nel video allegato. Questo lavoro è stato supportato dal Charitable Trust MJ Murdock (Grant No. 2.012.205 a JED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
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