Summary
כאן אנו מתארים טכניקה מיקרוסקופית פשוטה ונגישה לציבור רחב לרכוש וידאו דיגיטלי באיכות גבוהה של מבוגרים תסיסנית ופנוטיפים מוטציה זחל מנקודת מבט לרוחב.
Abstract
תסיסנית היא מערכת מודל ניסיוני רבת עוצמה ללימוד הפונקציה של מערכת העצבים. מוטציות גנטיות הגורמות לתפקוד לקוי של מערכת העצבים לעתים קרובות לייצר זחלים ומבוגרים שיש להם פנוטיפים פגומים תנועה שקשה לתאר במידה מספקת עם טקסט או מייצג לחלוטין עם דימוי הצילומי יחיד קיימא. מצבים הנוכחיים של הוצאה לאור מדעי, לעומת זאת, תומכים בהגשה של מדיה וידאו דיגיטלית כחומר משלים ללוות כתב יד. כאן אנו מתארים טכניקה מיקרוסקופית פשוטה ונגישה לציבור רחב לרכישת וידאו דיגיטלי באיכות גבוהה של שני פנוטיפים זחל והמבוגרים דרוזופילה מנקודת מבט לרוחב. וידאו של תנועת זחל ומבוגר מצדו להציג הוא יתרון משום שהוא מאפשר התבוננות וניתוח של הבחנות ושינויים קלים בהתנהגות קטר חריגה. אנחנו השתמשנו בהצלחה בטכניקה זו כדי לחזות ולכמת aberrant זחילה התנהגויות בזחלי instar שלישיים, בנוסף לפנוטיפים מבוגרים מוטציה והתנהגויות הכוללים טיפוח.
Introduction
הפירות הנפוצים לטוס melanogaster דרוזופילה הוא מערכת מודל ניסיוני רבת עוצמה ללימוד הפונקציה של מערכת העצבים 1-3. שימור האבולוציוני של מבנה ותפקוד של מערכת עצבים עם בני אדם, כמו גם קלות מניפולציה גנטית ומגוון רחב של כלים גנטיים גורמים דרוזופילה האורגניזם בכורה לדגמן מחלות ניווניות אנושיות 4. מוטציות גנטיות הגורמות לתפקוד לקוי של מערכת העצבים לעתים קרובות לגרום לזחלי מוטציה קיימא ומבוגרי תסיסנית עם תנועה לקויה. פנוטיפים שנצפו במוטציות פגומות מערכת עצבים כוללים ירידה בשיעור של תנועה, תיאום חריג, ותנועות עוויתיות במבוגרים, וכן את גירעונות בהתכווצות נפיחה של קיר שרירי הגוף, ושיתוק חלקי של זחלים. פנוטיפים אלה נוצלו בפיתוח של מסכי גנטיים תפוקה גבוהה ומבחני תנועה של זחלי מוטציה 5, 6 והמבוגר 7-10 דרוזופילה שנועד לכמת את ירידת ערך התנועה וזיהוי גנים חיוניות לתפקוד של מערכת העצבים. בעוד גישות אלה הן מאוד שימושיות לכימות התנהגויות קטר זחל ומבוגרים, הם לא מצליחים להעביר מידע איכותי על כל התנהגות חריגה ספציפית. לדוגמא, בזמן שזחלי instar שלישי מוטציה, עשויים להציג פרמטרים תנועה שינו בassay התנהגות, זה עלול להיות לא ברור אם זו היא התוצאה של שינויים בהתכווצויות peristaltic קצביות במהלך מחזור הזחילה, מחסור כללי בתיאום, או שיתוק חלקי של הגוף האחורי קיר שרירים. כאן אנו מתארים טכניקה מיקרוסקופית פשוטה ונגישה לציבור רחב לרכישת וידאו דיגיטלי באיכות גבוהה של מבוגרים תסיסנית ופנוטיפים קטר זחל מנקודת מבט לרוחב. וידאו דיגיטלי שנרכש מנקודת מבט רוחבית מאפשר תצפית הישירה וניתוח של הבחנות דקות בlocomotivהתנהגויות דואר מנטייה צד להציג יותר אינפורמטיבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 מערכת מיקרוסקופ סטריאו
הערה: למרות שפרוטוקול זה הוא בקלות להתאמה לכמעט כל מערכת מיקרוסקופ סטריאו מצמידים את מצלמה דיגיטלית עם היכולת של רכישת וידאו, פרטים מסופקים על המערכת המשמשת במעבדה שלנו (טבלה של חומרים / ציוד).
- לרכוש וידאו דיגיטלי באמצעות מיקרוסקופ סטריאו trinocular מצמידים את מצלמה דיגיטלית מסחרית.
- על מנת זוג המצלמה הדיגיטלית המסחרית לנמל trinocular של מיקרוסקופ סטריאו, להסיר את ½x C-mount של נמל phototube של מיקרוסקופ סטריאו ולהחליף אותו עם 1X C-mount.
- הר מצמד מצלמה דיגיטלי (43 חוט מ"מ) ל1X C-mount.
- שתי טבעות הר צעד למטה, 58 מ"מ ל48 מ"מ, ו48 מ"מ ל43 מ"מ, למצמד המצלמה כדי לגשר על החיבור ממצמד המצלמה הדיגיטלי לערכת מתאם עדשה למצלמה הדיגיטלית.
- לעלות את המצלמה הדיגיטלית לערכת מתאם עדשה.
- לרכוש וידאו עם הגדלת מיקרוסקופ וזום אופטי של המצלמה הדיגיטלית מוגדרת להגדלת שילוב של כ 12X (30 מסגרות לשנייה, 640 480 פיקסלים). הערה: ההגדלה של מיקרוסקופ סטריאו חייבת להיות מתוגמלת בהתאם ל1X C-mount מחדש החדש של נמל trinocular.
.2 הדמיה דרוזופילה שלישית instar זחלים
- סרט בטוש בלתי מחיק לצלחת השלב השחורה של מיקרוסקופ סטריאו מצמידים את מצלמה דיגיטלית כך שהצד של כובע הסמן תופס כ ⅓ ל¼ של השדה האנכי של התצוגה נצפתה בצג LCD המצלמה. השתמש בצמרות סמן כשלב לבצע הדמיה זחל, כי הם באים במגוון רחב של צבעים שיכולים לשמש לקוד צבע ולהבדיל גנוטיפים של זחלים שצלם.
- מסמן את שדה הראייה שנצפתה בצג LCD המצלמה הדיגיטלי על פני השטח של למעלה הסמן עם נקודת קנססמן.
- בחר זחל instar שלישי לתמונה. הקריטריונים לבחירת זחלי instar שלישיים היה אורך גוף, יציאה ממקור המזון בשלב הזחל של מחזור החיים, את נוכחותו של spiracles הקדמי והאחורי, ואת המבנה של הקרסים בלסת התחתונים, של הפה המנגנון 11. להבטיח את הזחל הוא נקי על ידי שטיפתו ביסודיות במים.
- להאיר את השלב העליון סמן הקבוע מלמעלה עם אור ממערכת תאורת סיבים אופטי. התאם את הזווית של אור האירוע לספק תאורה אופטימלית.
- פוקוס מיקרוסקופ על קצה עליון בטוש בלתי מחיקה. בגין רכישת וידאו דיגיטלי.
- מניחים את הזחל בצד של כובע הסמן כ 75 ° הרחק מהציר האנכי, ממש מחוץ לשדה הראייה, עם הקדמי של הזחל פונה לכיוון שדה הראייה (איור 1). הערה: מיקום של הזחל בצד של כובע הסמן מאפשר למצלמה שיא תנועה של הזחל דואר מנקודת מבט לרוחב. זה עוזר לשמור את הזחל לח עם מים כך שהם לא נופלים מהצד של כובע הסמן. טיפול חייב להיות מופעל, עם זאת, שלא להשתמש יותר מדי מים ככמויות עודפות תדבק הזחל כפי שהוא זוחל על פני השדה.
- בעדינות לבדוק ולדקור את הזחל עם מכחול קטן לכפות אותו לזחול על פני שדה הראייה. היה סבלני כמו הזחלים לעתים רחוקות לשתף פעולה, ולעתים קרובות יש להחזיר לנקודת ההתחלה הרבה פעמים לפני שהם זוחלים ישר על פני השדה.
- רשומה כ 10-15 דקות של מד רציף וידאו דיגיטלי ויבול ולהסיר את כל פוסט רכישת המד מיותר עם תוכנת עריכת וידאו דיגיטלית.
.3 ההדמיה דרוזופילה מבוגרים
- הנח מבוגר יחיד דרוזופילה בקובט קלקר ספקטרוסקופיות 1.5 מ"ל חד פעמי.
הערה: CO 2 הרדמה של המבוגרים תסיסנית מייד לפני behavפרוטוקול ניתוח ioral יכול להתפשר תוצאות 12. מומלץ שהמבוגרים תסיסנית תינתן תקופת 24 שעות להתאושש מCO 2 הרדמה לפני הביצוע במבחן התנהגות 13. - חבר את הקצה של קובט עם כדור צמר גפן קטן. ודא כדור צמר גפן הוא ארוז חזק מספיק כדי לכבוש את חלל כובע הגדול ומגביל את הזבוב לתא הנפח המופחת של קובט.
- מניחים את קובט על צלחת השלב הלבנה של מיקרוסקופ סטריאו וליישר את תא הנפח המופחת של קובט עם שדה הראייה שנצפתה בצג LCD המצלמה הדיגיטלי כראוי.
- להאיר את קובט מלמעלה עם אור ממערכת תאורת סיבים אופטי. התאם את הזווית של אור האירוע לספק תאורה אופטימלית.
- פוקוס מיקרוסקופ ולהתחיל לרכוש וידאו דיגיטלי.
- רשומות כ 30-45 דקות של מד רציף וידאו דיגיטלי ויבול ולהסיר את כל מיותרלאחר רכישת מדה עם תוכנת עריכת וידאו דיגיטלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו השתמשנו בהצלחה בטכניקה זו כדי לרכוש ולכמת את הפנוטיפ ההתנהגותי הזחל הקשורים לאובדן התפקוד של גן stathmin (איור 2) 14. גן stathmin מקודד חלבון רגולטורי microtubule שמחיצות הדימרים טובולין מבריכות של טובולין המסיס, ונקשר microtubules ומקדם פירוקם 15,16. פונקצית Stathmin נדרש כדי לשמור על השלמות של microtubules בהאקסונים של עצבים היקפיים 14. שיבוש של פעילות stathmin בתוצאות זחלי instar השלישי דרוזופילה בפנוטיפ שבמגזרי הגוף האחורי להעיף כלפי מעלה לאחר כל גל נפיחה של התכווצות שרירים במהלך מחזור הזחילה. שיתוק אחורי זה או פנוטיפ 'זנב להעיף "הוא סימן היכר של תחבורת axonal פגומה. אנחנו כימתנו את החדירות ואת החומרה של פנוטיפ השיתוק האחורי בזחלי instar שלישיים של שבע שונים <em> stathmin גנוטיפים מוטציה על ידי מדידת הזווית מעל אופקי הזנב הועלה במהלך מחזור הזחילה (טבלת 1). זחלים היו נחושים להפגין זנב להעיף חזק אם הזנב הועלה יותר מ -40 ° מעל אופקי בעת סריקה, זנב להעיף קל אם הזנב היה מגייס פחות 40 ° מעל אופקי, ולא זנב להעיף אם הזחלים הציגו זחילה התנהגות נורמלית.
איור 1 עמדה של זחל instar השלישי בשלב כובע סמן קבוע לרכישה של וידאו דיגיטלי מנקודת מבט רוחבית באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. צד להציג ממערכת מיקרוסקופ סטריאו בסיסית עם מצלמה דיגיטלית רכוב בנמל trinocular. הגדלה הבלעה מראה את הכיוון של סמן קבוע המודבק לבמה מיקרוסקופ ואת עמדתו של זחל instar השלישי בכובע הסמן לרכישה של וידאו הדיגיטלי של התנהגות סוטה מנקודת מבט לרוחב. בתמונה תלת הממדים של החלל מוגדרים; ציר X מפעיל את אורכו של הסמן הקבוע ומקביל לבמה מיקרוסקופ, ציר y מאונך לציר X ובמקביל לבמה מיקרוסקופ, וציר z הוא אנכי מכובע הסמן ל עדשה אובייקטיבית ובניצב לבמה מיקרוסקופ. זחל instar שלישי ממוקם בצד של כובע הסמן כ 75 ° מz-הציר האנכי כלפי ציר y, ממש מחוץ לשדה הראייה של המצלמה הדיגיטלית, עם הקדמי של הזחל פונה לכיוון השדה מבט. מיקום של הזחל בצד של כובע הסמן מאפשר למצלמה הדיגיטלית של מיקרוסקופ סטריאו להקליט תנועה של הזחל על פני השדה מנקודת מבט לרוחב.
ftp_upload / 51,981 / 51981fig2highres.jpg "/>
איור 2 תמונות של תוצאות נציג. נציג תמונות מוידאו דיגיטלי של זחל תסיסנית (A, B) ובוגר פנוטיפים (C, D) והתנהגויות שנרכשו מנקודת מבט לרוחב. כל תמונה היא וידאו עדיין מסגרת חילוצו מתוך קבצי וידאו דיגיטלי שנרכשו. תערוכת זחל instar השלישי () wildtype תנוחת גוף שטוח בעת הסריקה לאורך מצע. הומוזיגוטים זחל instar השלישי למוטציה בתערוכת גן stathmin זחילה סוטה (ב ') זנב להעיף התנהגות, מעידה על שיתוק של השרירים האחוריים. (C) הכנפיים של המבוגרים wildtype דרוזופילה מתקיימות שטוחה נגד הגוף כמו הזבוב הולך. (D) דרוזופילה מבוגרים, הומוזיגוטים למוטציה ידועה, להחזיק את כנפיהם ב זוויות 45 כ ° מעל לנורמה. שני הפנוטיפ זחל והמבוגר חריגים שתואר הם נצפו הכי טובים ותקשרו עם וידאו דיגיטלי שנרכש מנקודת מבט צד להציג לרוחב. בפנל וB בר = 1 מ"מ בקנה מידה. נתון זה שונה מאל דאנקן et. 2013.
| חומרת האחורית השיתוק הפנוטיפ | ||||
| גנוטיפ | n | אין זנב Flip | זנב-Flip קל (<40 °) | זנב-Flip חזק (> 40 °) |
| wildtype | 150 | 100.0% (N = 150) | 0.0% (N = 0) | 0.0% (N = 0) |
| הנירוסטה B200 / + | 130 | 100.0% (N = 130) | 0.0% (N = 0) | 0.0% (N = 0) |
| נירוסטת rdtp / + | 140 | 100.0% (N = 140) | 0.0% (N =) | 0.0% (N = 0) |
| Df (2L) Exel6015 / + | 120 | 100.0% (N = 120) | 0.0% (N = 0) | 0.0% (N = 0) |
| הנירוסטה B200 | 120 | 23.3% (N = 28) | 23.3% (N = 28) | 53.4% (N = 64) |
| הנירוסטה B200 / DF (2L) Exel6015 | 101 | 10.9% (N = 11) | 21.8% (N = 22) | 67.3% (N = 68) |
| rdtp הנירוסטה | 125 | 16.0% (N = 20) | 32.0% (N = 40) | 52.0% (N = 65) |
| rdtp הנירוסטה / DF (2L) Exel6015 | 140 | .7.7% (N = 11) | 23.7% (N = 33) | 68.6% (N = 96) |
טבלת 1 חדירות וחומרתהאחורי פנוטיפ שיתוק שנצפה בstathmin זחלי instar השלישי מוטציה דרוזופילה (נירוסטה). החדירות וחומרת הפנוטיפ השיתוק האחורי של stathmin זחלי instar השלישי מוטציה דרוזופילה, נכבש ולכמת על ידי רכישת וידאו דיגיטלי של ההתנהגות מנקודת מבט רוחבית ומדידת הזווית שהזנב גדל מעל למישור הזחילה האופקי במהלך מחזור הזחילה. זחלים הובקעו כבעל זנב להעיף חזק אם הזנב הועלה יותר מ -40 ° מעל למישור האופקי וזנב להעיף קל אם הזנב היה מגייס פחות 40 ° מעל למישור האופקי. זחלים מציגים התנהגות סריקה רגילה הובקעו כחסר זנב להעיף. ההתנהגות של זחלים לפחות מאה הזחילה נותחה עבור כל גנוטיפ נבדק. טבלה זו שונה מאל דאנקן et. 2013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כוח דרוזופילה של melanogaster כמערכת מודל לחקר תפקוד מערכת עצבים נובע במידה רבה מהשילוב של כלים גנטיים רבי עוצמה זמינה והמגוון הרחב של מבחני התנהגות חזקים פיתח. כאן אנו מציגים טכניקה מיקרוסקופית פשוטה ונגישה לציבור רחב לרכישת וידאו דיגיטלי באיכות גבוהה של מבוגרים תסיסנית ופנוטיפים קטר זחל מנקודת מבט לרוחב. אנחנו השתמשנו בהצלחה בגישה זו כדי לאפיין ולכמת את החומרה של שיתוק אחורי 'זנב להעיף "פנוטיפים שנצפו במוטציות זחל instar השלישי נוירולוגית ישירות על ידי מדידת הזווית המרבית שהזנב הועלה מ הציר האופקי במהלך מחזור 14 הזחילה. היתרון של הגישה שהוצגה כאן הוא שוידאו שנרכש מנקודת מבט רוחבית, המאפשר תצפית הישירה וניתוח של התנהגויות קטר חריגות, נצפה לעתים קרובות בזחל נוירולוגיות וdult מוטציות, מנטייה 'צד להציג' יותר אינפורמטיבי. כתוצאה מכך, להדמיה של התכווצויות peristaltic שריר בדרוזופילה זחל, ופנוטיפים הליכה חריגים במבוגרים תסיסנית בקלות רבה יותר שנצפתה ונותחה. מגבלה אחת של טכניקה זו היא שזה לא גישת תפוקה גבוהה. בנוסף, ניתן לנתח התנהגויות זחל ומבוגרים תסיסנית ספציפיות רק לתקופות קצרות של זמן בשל לאזור המעקב המגביל המוענק על ידי שדה הראייה של המיקרוסקופ סטריאו. זה יכול להיות בעייתי במיוחד בעת רכישת וידאו של התנהגויות דרוזופילה מבוגרות, כמו הנפח של חדר קובט הוא גדול יותר באופן משמעותי משדה הראיה של המיקרוסקופ סטריאו. יש לנו לטפל בבעיה זו על ידי שימוש במוסיף כותנה וקרטון כדי למזער את קובט תא הנפח ולהגביל את חופש התנועה של המבוגר לטוס לחלל הכלול בתוך שדה הראייה. בעוד שרוב im שלנוהזדקנות התמקדה במוטציות זחל נוירולוגית, יש לנו גם השתמשתי בטכניקה כדי לבחון פנוטיפים מבוגרים מוטציה והתנהגויות, כוללים טיפוח, המצביע על כך ניתן להרחיב את הטכניקה בקלות לכלול ניתוח של התנהגויות דרוזופילה אחרות כגון חיזור, הזדווגות, ותוקפנות. יתכן כי טכניקה זו יכולה להיות שימושית עבור הדמיה חברים אחרים Drosophilidae משפחה, כמו גם חרקים אחרים בגודל דומה. בנוסף, שינוי קל של הטכניקה שיאפשר הדמיה של מיני חרקים גדולים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים הצהירו שאין אינטרסים מתחרים קיימים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות אלכסנדרה Opie לקבלת סיוע טכני ולתמיכה, ג'יימס ברטון למתן קריינות וידאו, ורמונה Flatz וJoellen סוויני הלמופיע בוידאו המצורף. עבודה זו נתמכה על ידי קרן הצדקה MJ מרדוק (מענק מס '2,012,205 לJED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
- Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. Drosophila neurobiology: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Frank, C. A., et al. New approaches for studying synaptic development, function, and plasticity using Drosophila as a model system. J Neurosci. 33, 17560-17568 (2013).
- Mudher, A., Newman, T. Drosophila : a toolbox for the study of neurodegenerative disease. , Taylor & Francis Group. (2008).
- Bilen, J., Bonini, N. M. Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu Rev Genet. 39, 153-171 (2005).
- Jakubowski, B. R., Longoria, R. A., Shubeita, G. T. A high throughput and sensitive method correlates neuronal disorder genotypes to Drosophila larvae crawling phenotypes. Fly (Austin). 6, 303-308 (2012).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants). Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 16053-16058 (2003).
- Jahn, T. R., et al. Detection of early locomotor abnormalities in a Drosophila model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 197, 186-189 (2011).
- Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PLoS ONE. 7, e37250 (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (24), (2009).
- Colomb, J., Reiter, L., Blaszkiewicz, J., Wessnitzer, J., Brembs, B. Open source tracking and analysis of adult Drosophila locomotion in Buridan's paradigm with and without visual targets. PLoS ONE. 7, e42247 (2012).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. (1965).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics.. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Duncan, J. E., Lytle, N. K., Zuniga, A., Goldstein, L. S. The Microtubule Regulatory Protein Stathmin Is Required to Maintain the Integrity of Axonal Microtubules in Drosophila. 8, e683244 (2013).
- Belmont, L. D., Mitchison, T. J. Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell. 84, 623-631 (1996).
- Cassimeris, L.
